Schnelle Depletion von Nierenmakrophagen mit humanem CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug

Hier wird über ein Protokoll für die selektive Ablation von Nierenmakrophagen berichtet, um deren Regeneration mit dem humanen CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug zu untersuchen. Diese Methode ist auch anwendbar, um die Funktion und Regeneration der anderen Zellpopulationen in der Niere, der Leber und dem Fettgewebe zu untersuchen.

Nierenmakrophagen (RMs) sind für die Nierengesundheit unerlässlich und orchestrieren die Immunüberwachung, die Gewebehomöostase und die Reaktion auf Verletzungen. Zuvor haben wir über die Verwendung eines humanen CD59 (hCD59)/Intermedilysin (ILY) Zellablationswerkzeugs berichtet, um das unterschiedliche Schicksal, die Dynamik und die Nischen von RMs aus dem Knochenmark oder embryonalen Ursprungs zu untersuchen. RMs stammen aus aus Dottersack-abgeleiteten Makrophagen, fetalen Lebermonozyten und aus dem Knochenmark stammenden Monozyten und werden im Erwachsenenalter durch lokale Proliferation und Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten aufrechterhalten. In dieser Arbeit berichten wir über ein detailliertes Protokoll für die selektive Ablation von RMs, um ihre Regeneration zu untersuchen, einschließlich 1) Generierung und Charakterisierung der Cre-induzierbaren Expression von hCD59 in Maus-RMs, 2) Reinigung von ILY und Charakterisierung der IEL-Aktivität, 3) Induktion der hCD59-Expression an RMs in zusammengesetzten Mäusen und 4) Charakterisierung der Regeneration nach ILY-vermittelter RM-Ablation. ILY depletiert RMs in zusammengesetzten Mäusen spezifisch und schnell mit effizienter Makrophagenablation innerhalb von 1 Tag nach der IGY-Verabreichung. Die Regeneration der renalen Makrophagen begann am 3. Tag nach der Ablation und erholte sich bis zum 7. Tag zu ~88 %. Dieses Modell bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Makrophagenbiologie und kann für die selektive Ablation anderer Zellpopulationen im Nieren-, Leber- und Fettgewebe verwendet werden, um deren Funktion und Regeneration zu untersuchen.

Nierenmakrophagen (RMs) sind essentielle Immunzellen, die die Homöostase der Niere aufrechterhalten, Immunreaktionen regulieren und die Gewebereparatur nach Verletzungen fördern. Sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen, darunter Phagozytose, Antigenpräsentation und die Orchestrierung von Entzündungs- und Entzündungshemmerreaktionen ^1,2,3. Abhängig von der lokalen Umgebung können RMs entweder in proinflammatorische (M1) oder antiinflammatorische (M2) Phänotypen polarisieren, die entweder die Verletzung verschlimmern oder die Heilung erleichtern ^4,5,6. Eine Dysregulation von RMs wurde mit dem Auftreten und Fortschreiten von akutem Nierenversagen (AKI) und chronischer Nierenerkrankung (CKD) in Verbindung gebracht, was sie zu einer entscheidenden Rolle für die Nierengesundheit und -pathologie macht ^7,8. RMs stammen aus verschiedenen Quellen, darunter aus Dottersack gewonnene Makrophagen während der Embryogenese, fetale Lebermonozyten und aus Knochenmark gewonnene Monozyten im Erwachsenenalter. RMs expandieren und reifen postnatal parallel zum Nierenwachstum, hauptsächlich aus fetalen Lebermonozyten vor der Geburt, mit Selbsterhaltung bis zum Erwachsenenalter, ergänzt durch periphere Monozyten⁹. Bei Erwachsenen werden zirkulierende Monozyten durch homöostatische oder Verletzungssignale in die Niere rekrutiert und differenzieren sich unter lokalen Mikroumwelteinflüssen zu Makrophagen. Die RM-Aufrechterhaltung wird durch lokale Proliferation und periodische Auffüllung aus zirkulierenden Monozyten^{aufrechterhalten} 9,10,11,12.

Wir haben zuvor die Verwendung des humanen CD59 (hCD59)/Intermedilysin (ILY)-Zellablationssystems als Werkzeug^13,14 demonstriert, um die unterschiedlichen Schicksale, Dynamiken und Mikroumgebungsnischen von RMs zu untersuchen, die entweder aus dem Knochenmark oder embryonalen Ursprungs stammen⁹. ILY lysiert menschliche Zellen selektiv innerhalb von Sekunden, indem es Poren in gezielten Zellmembranen bildet¹⁵. Diese Spezifität ergibt sich aus der exklusiven Bindungsaffinität von ILY für humanes CD59 (hCD59), ohne Wechselwirkung oder lytische Wirkung auf Zellen anderer Spezies, denen dieser Rezeptor^{fehlt 15}. Basierend auf diesem Konzept haben wir ein Werkzeug entwickelt, das die schnelle, bedingte und gezielte Ablation von humanen CD59-exprimierenden Zellen in transgenen Mausmodellen durch die Anwendung von Intermedilysin (ILY)¹⁴ ermöglicht. Um die Verwendung dieses Werkzeugs zu erleichtern, haben wir ein Modell der bedingten und gezielten Zellablation entwickelt, indem wir floxierte STOP-CD59-Knockin-Mäuse (ihCD59) erzeugt haben, bei denen die Expression von humanem CD59 erst nach Cre-vermittelter Rekombination erfolgt¹³. Zuvor wurde festgestellt, dass das CX3CR1cre-EFP-Gen ausschließlich auf CD11bintF480hi exprimiert wird, definiert als Nierenmakrophagen⁹. Daher haben wir CX3CR1CreER2^+/+ -Linien verwendet, um mit ihCD59-Mäusen zu kreuzen, um hCD59 auf Nierenmakrophagen zu exprimieren. Wir haben erfolgreich zusammengesetzte Mäuse mit dem Genotyp ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ und -/- für homozygote, hemizygote bzw. nicht-trägergebundene transgene Mäuse generiert). Die Verabreichung von Tamoxifen an ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- Compound-Mäusen, die durch hCD59-Expression bedingt markierte und markierte RMs^{waren 9}. Nach der Erschöpfung der RM-Nische durch die ily-Behandlung differenzierten sich periphere Monozyten prompt zu Knochenmark-RMs, wodurch die Nische effektiv wieder bevölkert wurde, wie zuvor in⁹ beschrieben. Diese Regeneration hing entscheidend von der Signalachse CX3CR1/CX3CL1 ab, was ihre wesentliche Rolle sowohl bei der Erhaltung als auch bei der Wiederherstellung der RM-Population unterstreicht⁹. Wir zeigen auch, dass RMs embryonalen Ursprungs aufgrund ihrer unterschiedlichen glykolytischen Kapazitäten eine höhere Kapazität zum Abfangen von Immunkomplexen haben und empfindlicher auf Immunherausforderungen reagieren als RMs aus dem Knochenmark⁹.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die selektive Ablation von RMs, um deren Regeneration mittels Cre-induzierbarer hCD59 (ihCD59)-vermittelter Schnellzellablation nach Verabreichung von ILY zu untersuchen. Die Injektion von ILY bewirkte die gezielte Ablation von RMs, die bedingt und spezifisch hCD59 in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^{+/-compound-Mäusen}  exprimieren. Nach der Ablation überwachten wir die dynamischen Veränderungen der Makrophagen mittels Durchflusszytometrie und fanden eine schnelle Depletion der Makrophagen, gefolgt von der Regeneration der RMs. Rekombinante ILY wurde in E. coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert und mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Reinheit und Funktionalität des rekombinanten ILY wurde durch SDS-PAGE, Spektrophotometrie und einen Hämolyse-Assay bestätigt, der seine charakteristische cholesterinabhängige Cytolysin-Aktivität nachweist. Wir verwendeten LILY, um die RMs in den Mäusen zu depletieren und eine effiziente Makrophagenablation innerhalb von 1 Tag nach der Ily-Verabreichung zu erreichen. Die Regeneration der Nierenmakrophagen begann am Tag 3 nach der Ablation und erholte sich bis zum 7. Tag zu ~85%. Die Daten deuten darauf hin, dass die Regeneration in erster Linie durch die Rekrutierung von Monozyten angetrieben wird. Dieses Modell bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Makrophagenbiologie und hat therapeutisches Potenzial für die gezielte Manipulation von Makrophagenpopulationen bei Nierenerkrankungen. Das ihCD59/ily-Zellablationswerkzeug kann verwendet werden, um die Zellfunktion und -regeneration in Niere, Leber, Fettgewebe und anderen Organen zu untersuchen.

Die Tierstudienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Tulane University, School of Medicine, genehmigt (Protokollnummer 1482). Die Versuchsmäuse Cx3cr1CreER^+/+ und ihCD59^+/+ im Alter von 10-12 Wochen und mit einem Gewicht von 25-30 g wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierhaltung der Universität untergebracht. Alle Eingriffe, bei denen die Nieren isoliert wurden, wurden in einer sterilen Umgebung durchgeführt, wobei die Forscher Handschuhe und Gesichtsmasken trugen, um eine Kontamination zu vermeiden. Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Beziehen Sie CX3CR1CreER^+/+Mäuse aus dem Jackson Laboratory. Halten Sie die Mäuse an der Tulane University School of Medicine (SOM) in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Einrichtung unter. Halten Sie die Tiere unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierten Umgebungsbedingungen.
2. Für die Zucht werden zuvor erzeugte ihCD59+/+ Mäuse mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6 verwendet. Kreuzung homozygoter CX3CR1CreER^+/+ Mäuse (mangelhaft in der CX3CR1-Expression) mit ihCD59^+/- Mäusen, um die folgenden Nachkommengenotypen zu erzeugen: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-und CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-.
3. Stellen Sie sicher, dass heterozygote CX3CR1CreER^+-Mäuse die funktionelle CX3CR1-Expression beibehalten, während homozygote CX3CR1CreER^+/+-Mäuse durch durchflusszytometrische Analyse mit Anti-CX3CR1-Antikörper 9 CX3CR1-defizient^sind.

2. Ily-Produktion (abgeleitet von^14,15 )

1. Tag 0
   1. Entnommener gefrorener Bestand des iY-Bakterienstamms BL21-DE3-RIPL mit His-markierten ILY-Sequenzen in pTrcHis-A-Plasmid (Ergänzende Abbildung 1), gelagert bei -80 °C. 10 μl des Bakterienbestands werden in 40 μl Luria-Bouillon-Medium (LB) mit Ampicillin in einer Konzentration von 1 μg/ml inokuliert.
   2. Verteilen Sie die inokulierte Mischung auf einer LB-Agarplatte, die mit Ampicillin (1 μg/ml) ergänzt ist. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C in einem Bakterieninkubator.
2. Tag 1
   1. Wählen Sie sechs einzelne Kolonien aus der LB-Agarplatte aus. Impfen Sie jede Kolonie in 3,5 ml LB-Medium, das Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C.
3. Tag 2
   1. Übertragen Sie jede 3,5-ml-Starterkultur in 250 ml LB-Medium, das mit Ampicillin ergänzt wird. Inkubieren Sie die Kulturen 3 h lang bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 230 x g , um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.
   2. Nach 3 h Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) aus einer 1 M Stammlösung (gelagert bei -20 °C) in einer Verdünnung von 1:1000 zugeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. Die Inkubation für weitere 4 Stunden fortsetzen, um die Proteinexpression zu induzieren.
   3. Wiegen Sie eine leere Zentrifugenflasche und notieren Sie das Gewicht. Übertragen Sie ca. 250 mL der induzierten Kultur in die Zentrifugenflasche.
   4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie dann die Flasche mit dem Pellet. Berechnen Sie das Pelletgewicht, indem Sie das Gewicht der leeren Flasche vom Gesamtgewicht nach der Zentrifugation abziehen.
   5. Lagern Sie das Bakterienpellet bei -20 °C für die anschließende Extraktion und Reinigung von ILY.
4. Tag 3 : Extraktion und Reinigung von ILY
   1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor, indem Sie 30 ml Bug Buster Protein Extraction Reagenz mit 30 μl Benzonase-Nuklease (1200 Kunitz-Einheiten) und 0,9 μl Lysozym (10.000 Einheiten enzymatischer Aktivität) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen kombinieren.
   2. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Lysepuffer homogen ist. Geben Sie den vorbereiteten Lysepuffer zum Bakterienpellet (2-5 g). Wirbeln Sie die Mischung 30-60 s lang gründlich ein, um die Bakterienzellen vollständig zu resuspendieren.
   3. Die resuspendierte Lösung wird gleichmäßig auf zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen verteilt. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und inkubieren Sie sie 30-90 min. Schütteln Sie die Röhrchen während der Inkubation vorsichtig mit einem Orbitalschüttler und wirbeln Sie sie alle 5-10 Minuten kurz für 10-15 s auf, um die Zelllyse zu verbessern.
   4. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Lysate bei 4.900 x g für 30 min bei 4 °C.
   5. Waschen Sie die Säule gründlich mit Leitungswasser und verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das restliche Harz der vorherigen Verwendung zu entfernen.
   6. Spülen Sie die Säule mit 70 % Ethanol, um sie zu desinfizieren. Waschen Sie die Säule 2x-3x mit kaltem ddH₂O, um Ethanolreste zu entfernen. Setzen Sie die Säule in die Halterung ein.
   7. Fügen Sie 6-10 mL kaltes ddH₂O hinzu, um die Säule für die Reinigung weiter zu waschen und auszugleichen. Geben Sie ca. 3 ml Harzkügelchen in die Säule. Schließen Sie die Säule an eine Schlauchpumpe an, die auf eine Drehzahl von 30 eingestellt ist.
   8. Fügen Sie 10 ml kaltes ddH₂O hinzu, um das Harz vollständig zu suspendieren und für die Proteinbindung vorzubereiten. Waschen Sie die Harzkügelchen mit 15 mL 1x Charging Buffer, um das Harz für die Proteinbindung vorzubereiten.
   9. Sammeln Sie den bakteriellen Lysatüberstand nach der Zentrifugation in einem frischen Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Pellet verworfen wird. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45-μm-Filter mit einer Spritze, um verbleibende Zelltrümmer zu entfernen.
   10. 20-25 ml des filtrierten Bakterienlysats werden in drei separaten Runden durch die Säule geleitet. Sammeln Sie nach jedem Durchgang 20 μl des Durchflusses und markieren Sie ihn als PE für eine spätere Messung der optischen Dichte (OD).
   11. Waschen Sie die Säule mit 20-30 ml Bindungspuffer, um ungebundene Proteine zu entfernen. Waschen Sie die Säule mit 20-30 ml Waschpuffer. Sammeln Sie 20 μl der Waschfraktion für die Außendurchmessermessung.
   12. Eluieren Sie das gebundene Protein durch Zugabe von 10-20 ml Elutionspuffer. Beginnen Sie nach 3-4 Minuten mit der Entnahme der Elution mit Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie ca. 1 ml pro Röhrchen und füllen Sie 15-17 Röhrchen.
   13. Messen Sie die Extinktion jeder Elutionsfraktion an A280 mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie den Elutionspuffer als Leerzeichen während der A280-Messungen. Sammeln Sie die Röhrchen mit dramatisch erhöhter Extinktion bei A280, da sie das His-markierte ILY Protein enthalten, das typischerweise in Fraktionen um Röhrchen 13 vorkommt.
   14. Die Elutionsfraktionen (oder Röhrchen), die das IELY-Protein enthalten, werden bei 4 °C gelagert. Fahren Sie innerhalb des folgenden Tages mit weiteren Schritten fort, um eine optimale Proteinstabilität zu gewährleisten.
       HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch, wenn möglich, um die Proteinintegrität zu erhalten.
5. Tag 4: Entfernung von Endotoxinen aus der Elution
   1. Spülen Sie die Säule des Endotoxinentfernungsharzes mit 6-10 ml Reinstwasser. Drücken Sie vorsichtig auf die Säule, um den Durchfluss zu regulieren.
   2. Spülen Sie die Säule mit 10 ml 1%iger Natriumdesoxycholatlösung (frisch hergestellt oder nicht älter als 1 Monat), um gebundene Endotoxine zu entfernen. Spülen Sie die Säule erneut mit 6-10 ml Reinstwasser, um alle Reinigungsmittelreste zu entfernen.
   3. Tragen Sie die vorbereitete Proteinprobe auf die Harzsäule auf. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) in der Säule, um eine optimale Endotoxinbindung zu ermöglichen.
   4. Sammeln Sie die anfängliche Durchflussfraktion. Geben Sie ddH₂O zur weiteren Elution in die Säule und sammeln Sie die eluierten Fraktionen in etwa 10 Röhrchen (1 mL pro Röhrchen).
   5. Lagern Sie die Harzsäule in 25 % Ethanol bei 4 °C für die zukünftige Verwendung. Messen Sie die optische Dichte (O.D.) der eluierten Proteinproben, um die Ausbeute zu quantifizieren. Erwarten Sie eine Rückgewinnung von etwa 50 % bis 70 % des Gesamtproteins aus der ersten Elutionscharge.
6. Tag 5-6: Dialyse
   1. Bereiten Sie 2 l Dialysepuffer vor, indem Sie 1600 ml destilliertes, deionisiertes Wasser (ddH₂O) autoklavieren. Geben Sie 200 ml 10x PBS, 200 ml Glycerin und 3,5115 g MES (2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure) in das autoklavierte Wasser.
   2. Rühren Sie die Mischung mit einem magnetischen Rührstab um, bis sich alle Reagenzien vollständig aufgelöst haben. Den entstandenen Puffer bei 4 °C lagern.
   3. Geben Sie die gespeicherten Elutionsfraktionen in das Dialyse-Kit und entfernen Sie dann mit einer Nadel Luft aus dem Dialyse-Kit. Die Proteinlösung wird mit dem Dialysekit 24 h lang bei 4 °C dialysiert, wobei die Rührgeschwindigkeit auf ca. 2 eingestellt ist.
   4. Konfigurieren Sie das Dialysekit so, dass es vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Dialysepuffer im Dialysekit durch frischen Dialysepuffer in einem 2-Liter-Behälter. Setzen Sie die Dialyse für weitere 24 Stunden fort.
   5. Übertragen Sie die gesamte Lösung, einschließlich aller weißen Ausfällungen, vorsichtig in ein steriles Röhrchen, um das ily-Protein zu erhalten, das sich ansammeln kann. Konzentrieren Sie das RILY-Protein mit einer Zentrifugalfiltereinheit gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Zentrifugation.
   6. Aliquotieren Sie das konzentrierte ily-Protein in sterilen Röhrchen in 200-μl-Portionen. Beschriften Sie jede Tube mit dem Datum und dem Namen. Lagern Sie die Aliquote bei -80 °C für die zukünftige Verwendung in Gelelektrophorese- und Hämolyse-Assays.

3. Ily-Charakterisierung mittels SDS-PAGE-Elektrophorese

1. Bereiten Sie den MOPS SDS-Laufpuffer (1x) vor, indem Sie den Laufpuffer (20x) mit ddH₂O verdünnen.
2. Bereiten Sie den Probenpuffer in einem Abzug vor, indem Sie 90 μl 6x Ladepuffer mit 10 μl β-Mercaptoethanol (β-ME) mischen. Mischen Sie die Lösung gründlich, um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten.
3. Kombinieren Sie die vorbereitete Probe mit dem Ladepuffer, um ein Endvolumen von 30 μl zu erreichen. Tauen Sie die Proben auf und wirbeln Sie sie kräftig ein, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
4. Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten lang auf 95 °C, um die Proteine zu denaturieren. Laden Sie die Proben auf ein 4%-20% SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie die Elektrophorese 90 min lang mit einer konstanten Spannung von 80 V laufen.
5. Öffnen Sie vorsichtig die Gelkassette und tauchen Sie das Gel für 5 min in ddH₂O ein. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x mit einem Shaker.
6. Färben Sie das Gel 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) mit Coomassie Brilliant Blue ein. Waschen Sie das Gel 30 Minuten lang in ddH₂O. Ersetzen Sie das Wasser durch frisches ddH₂O und inkubieren Sie das Gel auf einem Shaker für einen Zeitraum von über Nacht bis 3 Tage, um es vollständig zu entfärben.
7. Nehmen Sie mit einer Kamera ein Bild des gefärbten Gels auf (Abbildung 1A). Analysieren Sie das Gel mit der ImageJ-Software für quantitative und qualitative Bewertungen.

4. Hämolytischer Assay für die LILY-Aktivität

1. Tauen Sie die gelagerten ILY (Intermedilysin)-Proben vollständig bei Raumtemperatur auf. Vortex die aufgetauten Proben gründlich, um die Homogenität zu gewährleisten, da ILY beim Auftauen aggregieren kann.
2. Richten Sie eine 96-Well-Platte für serielle Verdünnungen ein. Geben Sie 160 μl der ily-Stammlösung (26,7 ng/μl) in die erste Vertiefung. Geben Sie 80 μl 1x PBS in jede der nachfolgenden Vertiefungen in derselben Zeile oder Spalte.
3. Übertragen Sie 80 μl der ily-Lösung aus der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist. Übertragen Sie 80 μl von der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung und mischen Sie sie gründlich.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung und übertragen Sie 80 μl von der vorherigen Vertiefung in die nächste, bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen vorbereitet ist. Nachdem Sie 80 μl in die letzte Vertiefung überführt haben, verwerfen Sie 80 μl aus dieser Vertiefung, um ein gleichmäßiges Volumen auf der Platte zu gewährleisten.

5. Aufbereitung der menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs)

1. Ziehen Sie 1-2 ml frisches menschliches Blut in ein Röhrchen, das ein Antikoagulans wie EDTA enthält. Zentrifugieren Sie das Blut bei Raumtemperatur bei 3.000 x g für 5 min.
2. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das menschliche RBC-Pellet mit PBS 2x-3x, bis der Überstand klar ist. Verdünnen Sie die gewaschenen humanen Erythrozyten, indem Sie 10 μl Erythrozyten zu 900 μl 1x PBS hinzufügen, um eine Verdünnung von 1:100 zu erreichen.
3. Geben Sie 10 μl der verdünnten menschlichen Erythrozyten in jede Vertiefung. Geben Sie 30 μl der seriell verdünnten ily-Lösung aus der Verdünnungsplatte in jede Vertiefung. Fügen Sie 160 μl 1x PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf 200 μl pro Vertiefung zu bringen (Ausgangskonzentration: 4 ng/μl).
4. Geben Sie 10 μl der verdünnten humanen Erythrozyten in die Kontrollvertiefungen. Geben Sie 190 μl Wasser oder 1x PBS in die Kontrollvertiefungen für Negativkontrollen. Mischen Sie die Teller, indem Sie vorsichtig darauf klopfen.
5. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 °C, damit die Hämolyse stattfinden kann. Zentrifugieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei 3.000 x g , um alle intakten menschlichen Erythrozyten zu pelletieren.
6. Übertragen Sie vorsichtig 100 μl des Überstands aus jeder Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie die Extinktion der Überstände bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
7. Die hämolytische Aktivität von ILY wird berechnet, indem die Absorptionswerte der Proben mit denen der Kontrolle¹⁶ verglichen werden.

6. Tamoxifen-Behandlung, RM-Abbau und Regeneration

1. Maisöl auf 42 °C vorheizen. 100 mg Tamoxifen in 5 ml vorgewärmtem Maisöl auflösen, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 20 mg/ml herzustellen.
2. Verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal (i.p.) an 10-12 Wochen alte männliche CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäuse in einer Dosis von 100 μg/g Körpergewicht. Wiederholen Sie die Tamoxifen-Injektion an 3 aufeinanderfolgenden Tagen.
3. Warten Sie 15 Tage nach der letzten Tamoxifen-Injektion, um eine Cre-vermittelte hCD59-Expression zu ermöglichen.
4. Injizieren Sie eine Einzeldosis Intermedilysin (ILY) intravenös in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäuse und CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- Wurfgeschwisterkontrollen in einer Dosis von 120 ng/g Körpergewicht.
5. Überwachen und bestätigen Sie die RM-Ablation und die anschließende Regeneration durch Durchflusszytometrie 1, 3 und 7 Tage nach der Ily-Verabreichung¹⁷.

7. Euthanasie von Mäusen

1. Setzen Sie das Tier in eine geeignete Kammer und setzen Sie es gemäß den IACUC-Protokollen Isofluran aus. Überprüfen Sie die Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob keine Reflexe vorhanden sind, wie z. B. der Pedalzurückzugsreflex.
2. Sobald die Maus vollständig betäubt und nicht mehr ansprechbar ist, führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um die Euthanasie sicherzustellen. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie das Fehlen von Reflexen, wie z. B. dem Pedalrückzugsreflex, überprüfen.
3. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt von ca. 2 cm in der Mittellinie am Bauch und ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die Brusthöhle freizulegen. Öffnen Sie den Brustkorb entlang des Brustbeins mit einer chirurgischen Schere mit stumpfer Spitze, um das Herz freizulegen.
4. Führen Sie eine 21G-23G-Nadel in den linken Ventrikel ein. Beginnen Sie die Durchblutung mit 10-20 ml kaltem PBS, um das Blut auszuspülen.
5. Schneide den rechten Vorhof auf, damit das Blut aus dem Blutkreislauf abfließen kann. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die Nieren blass erscheinen, was auf eine effektive Blutreinigung hinweist.
6. Lokalisieren Sie die Nieren an der dorsalen Körperwand. Trennen Sie die Nieren vorsichtig mit einer Pinzette und einer Schere vom umgebenden Gewebe. Schneiden Sie die Nierenkapseln heraus und legen Sie die Nieren sofort in kaltes PBS, um einen Abbau zu verhindern.

8. Verdauung der Nieren

1. Bereiten Sie den Verdauungsenzymcocktail vor, indem Sie 9 ml HBSS (Ca/Mg-frei), 1 ml Kollagenase IV (5 mg/ml) und 20 μl DNase I (10 mg/ml) mischen. Bereiten Sie die Enzymlösung frisch vor und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf.
2. Zerkleinern Sie die Nieren mit einer sterilen Schere in einer Petrischale, die 5 ml HBSS enthält, in winzige Fragmente (idealerweise ≤ 1 mm). Die Nierengewebefragmente werden in 15-ml-Röhrchen mit 10 ml der vorbereiteten Enzymlösung überführt.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 °C unter leichtem Rühren, um das Gewebe zu dissoziieren. Zerreiben Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pipette oder einem Spritzenkolben, um die Zellklumpen weiter zu dissoziieren.
4. Entfernen Sie Gewebereste, indem Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb leiten. Die Zellsuspension bei 650 x g für 10 min bei 18 °C zentrifugieren.
5. Dekantieren Sie den Puffer nach der Zentrifugation vorsichtig. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Lysepuffer und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
6. Waschen Sie die Zellen mit PBS, um den Lysepuffer zu entfernen. Bewahren Sie die resultierende einzellige Suspension bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf.

9. Zentrifugation des Dichtegradienten

1. Um hämatopoetische Zellen anzureichern, resuspendieren Sie das Zellpellet aus der vorherigen Wäsche in 10 ml 30%iger Dichtegradientenlösung. Schichten Sie die Lösung vorsichtig über 3 ml 70%ige Dichtegradientenlösung in einem Zentrifugenröhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das Gefälle bei 500 x g für 30 min, ohne eine Bremse zu betätigen. Nach dem Zentrifugieren die Zwischenphasenschicht zwischen den 30%igen und 70%igen Lösungen vorsichtig sammeln; Diese Schicht enthält die angereicherten Einzelzellen.
3. Waschen Sie die gesammelten Zellen 2x mit 10 mL PBS, indem Sie bei 500 x g jeweils 10 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in 1 mL FACS-Puffer (1x PBS mit 2 % FBS) in einem 1,5 mL Röhrchen.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Hellfeldmikroskop. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 10⁶ Zellen/ml ein.

10. Durchflusszytometrische Färbung, Erfassung

1. Passen Sie die Zellkonzentration aus Einzelzellsuspensionen, die aus Nierengewebe der Maus hergestellt wurden, auf 2-3 x 10⁶ Zellen/ml für die durchflusszytometrische Analyse an.
2. Pelletieren Sie die Zellen in 1,5 mL Röhrchen, indem Sie 5 Minuten lang bei 650 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer.
3. Fügen Sie Anti-CD16/32-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 hinzu, um die unspezifische Bindung an den Fc-Rezeptor zu blockieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Verwenden Sie Aqua Live/Dead Farbstoff, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Färben Sie die Zellen mit vorkonjugierten Antikörpern in einer Verdünnung von 1:100, einschließlich CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE und F4/80-BV605. Geben Sie den Antikörpercocktail in die Zellsuspension.
6. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln, um die Fluorophore vor Photobleiche zu schützen. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2x mit FACS-Puffer (PBS mit 2% fötalem Rinderserum) durch Zentrifugieren bei 650 x g für 5 min.
7. Fixieren Sie die Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min auf Eis. Waschen Sie die fixierten Zellen 2x mit FACS-Puffer, um PFA-Reste zu entfernen.
8. Erfassen Sie gefärbte und fixierte Zellen mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie die Daten mit der Software.
9. Identifizieren Sie Nieren- und andere geweberesidente Makrophagen und Mikroglia mit den Markern CD45, CD11b und F4/80, wie in⁹ beschrieben.
10. Führen Sie ein anfängliches Gating durch, um lebende Zellen basierend auf Forward-Scatter- (FSC) und Side-Scatter-Profilen (SSC) auszuwählen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie die Forward-Scatter-Area (FSC-A) im Vergleich zur Forward-Scatter-Höhe (FSC-H) ansteuern. Schließen Sie tote Zellen mit dem Lebensfähigkeitsfarbstoff LIVE/DEAD aus.
11. Anreicherung von Immunzellen durch Gating auf CD45+-Populationen. Definieren Sie nierenresidente Makrophagen als CD11b+F4/80++-Zellen innerhalb der CD45+-Population, wie in der Gating-Strategie gezeigt (Abbildung 2A).
12. Definieren Sie Mikroglia-Populationen als CD11b+CD45ⁱⁿt Zellen (Abbildung 2B). Führen Sie die Datenerfassung am Durchflusszytometer durch. Führen Sie die abschließende Analyse mit der Software durch, um die durchflusszytometrische Studie abzuschließen.

Die Aufreinigung von rekombinanter His-Tag-ILY erfolgte nach dem gleichen Protokoll wie zuvor in^{Nummer 14} beschrieben. ILY wurde erfolgreich in E. coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert, transformiert mit einem Plasmid, das für das ily-Gen von Streptococcus intermedius kodiert. Bei der Induktion mit IPTG war eine Überexpression des Zielproteins offensichtlich. Nach der Expression wurde die ILY mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt, wobei ein C-terminaler His-Tag für eine spezifische Bindung genutzt wurde. Die Reinheit und das Molekulargewicht von ILY (~54 kDa) wurden durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt (Abbildung 1A). Die Intensität der Proteinbande wurde durch Densitometrie mit der ImageJ-Software quantifiziert, und die Proteinkonzentration wurde durch spektrophotometrische Analyse weiter verifiziert, was zu einer Endkonzentration von 1,27 mg/ml führte. Die biologische Aktivität des gereinigten ILY wurde unter Verwendung eines Hämolyse-Assays mit menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs), einem Standardassay zur Bewertung cholesterinabhängiger Cytolysine, bewertet. Der Assay zeigte eine dosisabhängige hämolytische Aktivität, die die funktionelle Integrität des rekombinanten Proteins bestätigt. Eine vollständige Hämolyse wurde mit der Positivkontrolle (Wasser) erreicht, während bei der Negativkontrolle (BPS-Puffer) keine Hämolyse auftrat. Das gereinigte ILY zeigte eine starke hämolytische Aktivität, wobei eine Lyse von 50 % der hRBCs bei einer Konzentration von 7,24 ng/ml und eine nahezu vollständige Hämolyse (99,62 %) bei 650 ng/ml beobachtet wurde (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse bestätigen, dass das rekombinante ILY seine charakteristische porenbildende Aktivität beibehält, die mit den Eigenschaften cholesterinabhängiger Cytolysine übereinstimmt. Die erfolgreiche Expression und Aufreinigung von ILY führte zu einem hochreinen rekombinanten Protein, und seine hämolytische Aktivität bestätigte die korrekte Faltung und Erhaltung seiner funktionellen zytolytischen Eigenschaften.

RMs sind sehr anfällig für pathologische Zustände und können der Schlüssel zur Weiterentwicklung therapeutischer Strategien sein, daher ist ein gründliches Verständnis dafür, wie sie nach einer Nischenerschöpfung wieder aufgefüllt werden, von entscheidender Bedeutung¹⁸. Um die renale Makrophagennische zu depletieren und zu manipulieren, zielten wir auf die spezifische Interaktion zwischen ILY und humanem CD59 (hCD59) ab, die die selektive Ablation von hCD59-exprimierenden Zellen in Mäusen erleichtert¹³. Die Verabreichung von ILY in induzierbaren hCD59-exprimierenden Mäusen, die mit verschiedenen Cre-Treiberlinien gekreuzt wurden, ermöglicht eine schnelle und präzise Ablation von Immun- und Epithelzellen ohne Off-Target-Effekte¹³. Um eine selektive Depletion von RMs zu erreichen, verabreichten wir ILY 15 Tage nach der Tamoxifen-Induktion in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäuse. Dieser Zeitpunkt wurde aus zwei entscheidenden Gründen gewählt. Erstens, am 15. Tag, exprimieren fast alle CX3CR1+-Zellen im Gehirn und in der Niere dieser Mäuse weiterhin hCD59, während die hCD59-Expression im Blut, in der Milz, in der Lunge, im Knochenmark und in der Leber minimal oder gar nicht vorhanden ist. Zweitens ist es aufgrund der großen Größe von ILY (54 kDa) nicht in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, wodurch sichergestellt wird, dass hCD59-exprimierende Mikrogliazellen unberührt bleiben⁹. Um dies zu validieren, quantifizierten wir hCD59-markierte CD11b+CX3CR1+-Makrophagen in mehreren Organen 15 Tage nach der Tamoxifen-Behandlung. Wir beobachteten eine stabile Retention von hCD59+-Makrophagen in der Niere und im Gehirn (~90%), während die Expression in anderen Geweben bei ≤ 5% lag. Nach der Verabreichung von ILY erreichten wir eine vollständige und selektive Depletion der Nierenmakrophagen ohne nachweisbare Depletion der Mikroglia, was bestätigt, dass ILY die Blut-Hirn-Schranke nicht durchdringt (Ergänzende Abbildung 2A - B). Um die Stabilität der CD59-Expression und die Dynamik der Repopulation nierenresidenter Makrophagen (KRM) zu bestätigen, untersuchten wir die hCD59-Expression auf KRMs 15 und 30 Tage nach der Tamoxifen-Induktion. Durchflusszytometrische Analysen bestätigten, dass die hCD59-Expression über die Zeit stabil bleibt (Ergänzende Abbildung 2C). Zusätzlich zur Bewertung einer potentiellen Cre-unabhängigen Leckage des CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- untersuchten wir die hCD59-Expression in Vehikel-behandelten (Maisöl) Mäusen. Diese Mäuse wiesen eine vernachlässigbare CD11bintF480hihCD59+ (0,93%) CD11b+CX3CR1+hCD59+ Population auf (1,8%), Im Gegensatz dazu zeigten Tamoxifen-behandelte Mäuse einen deutlichen Anstieg in beiden Populationen (87% bzw. 81%), was eine robuste Cre-vermittelte Rekombination mit minimaler basaler Leckage (Ergänzende Abbildung 2D). Diese Ergebnisse bestätigen die Spezifität des induzierbaren Systems und unterstützen den Einsatz von fahrzeugbehandelten Kontrollen in zukünftigen Studien. (Ergänzende Abbildung 2D). Wie in Abbildung 2A - Bwurde die RM-Erschöpfung innerhalb eines Tages nach der Ily-Verabreichung in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Bei Mäusen trat zwar keine Erschöpfung bei Kontrollmäusen auf (CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-). Drei Tage nach der Injektion begann sich die RM-Population zu erholen und erreichte etwa 50 % ihres ursprünglichen Niveaus. Am 7. Tag hatte sie sich auf fast 88 % (Abbildung 2B - C). Als nächstes untersuchten wir die Herkunft der regenerierten RMs, die von Monozyten stammen könnten, in situ Proliferation von Restmakrophagen oder einer Kombination. Nur ~5% der neu generierten RMs exprimierten hCD59, was darauf hindeutet, dass in situ Die Proliferation spielt bei ihrer Wiederbesiedlung eine minimale Rolle, und die meisten stammen wahrscheinlich aus der Rekrutierung von Monozyten (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen überein⁹ und wertvolle Einblicke in die Mechanismen liefern, die der RM-Regeneration zugrunde liegen, wobei die Dominanz der Monozyten-abgeleiteten Nachfüllung nach der Depletion der Makrophagen-Nische hervorgehoben wird. Die repräsentativen Daten, die in dieser Studie vorgestellt werden, stimmen mit den von uns zuvor berichteten Ergebnissen überein⁹ .

Abbildung 1: SDS-PAGE und Hämolyse-Assay des rekombinanten ILY Proteins. (A) Das SDS-PAGE Gel-Bild zeigt das gereinigte rekombinante Intermedilysin (ILY) Protein. Bei dem erwarteten Molekulargewicht von 54 kDa ist eine einzelne Bande sichtbar, die die erfolgreiche Expression und Aufreinigung von LY bestätigt. Die Reinheit des Proteins ist offensichtlich, es wurden keine größeren Kontaminationsbanden beobachtet. Als Referenz ist ein Molekulargewichtsmarker (Leiter) beigefügt, der die korrekte Positionierung des ILY Proteins relativ zu bekannten Molekulargewichten demonstriert. (B) Diese Grafik zeigt die dosisabhängige hämolytische Aktivität von gereinigtem ILY auf hRBCs. Der Prozentsatz der Zelllyse wird gegen steigende ILY-Konzentrationen aufgetragen, und der IC50 oder die Konzentration, die zur Lyse von 50 % der Zellen erforderlich ist, wurde auf 7,224 ng/ml bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ablation und Regeneration von nierenresidenten Makrophagen (RMs) nach ily-Injektion. (A) Gating-Strategie zur Identifizierung von Nierenmakrophagen (RMs), definiert als CD11b+F4/80^hohe Zellen, aus Einzelzellsuspensionen von Nierengewebe. Das anfängliche Gating schloss Trümmer, Dubletten und tote Zellen aus und selektierte dann CD11b+- und F4/80high-Zellen. (B) Durchflusszytometrische Dotplots-Analyse, die den Prozentsatz der RM-Populationen (CD11b+F4/80^hi) zu Studienbeginn (Tag 0) und nach der IEY-Injektion an den Tagen 1, 3 und 7 zeigt. (C) Der Anteil der RM-Zellen pro Niere zu verschiedenen Zeitpunkten (Tage 0, 1, 3 und 7) nach intravenöser (i.v.) Verabreichung von ILY (120 ng/g Körpergewicht). Vergleich zwischen Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^+/- und Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^-/- Mäusen (n=3, zwei unabhängige Experimente, Zwei-Wege-ANOVA). (D) Expression von humanem CD59 (hCD59) auf nierenresidenten Makrophagen bei Kontrollen an Tag 0 und in regenerierten RMs an Tag 7 nach der ily-Injektion. Die durchflusszytometrische Analyse ergab eine reduzierte hCD59-Expression in regenerierten RMs im Vergleich zu ursprünglichen RM-Populationen (n = 3, zwei unabhängige Experimente, ungepaarte t-Tests). Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit n=3 Mäusen pro Gruppe zu jedem Zeitpunkt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt, wobei *p < 0,05 die statistische Signifikanz anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: ILY Sequenzen im bakteriellen Expressionsvektor pTrcHis-A. Die 5'- und 3'-Grenzbereichssequenzen von LILY im Vektor sind gelb hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Validierung der Tamoxifen-induzierten hCD59-Expression und -Stabilität in CD11b + CX3CR1 + Zellen über verschiedene Gewebe hinweg und Cre-vermittelte Rekombinationseffizienz. (A) Durchflusszytometrische Analyse von hCD59-markierten CD11b+CX3CR1+-Makrophagen in mehreren Organen 15 Tage nach Tamoxifen-Induktion, die eine stabile Retention von hCD59+-Makrophagen in der Niere und im Gehirn (~90%) zeigt, während die Expression in anderen Geweben ≤ 5% betrug. (B) Nach der Verabreichung von ILY an Tag 1 blieben die Mikroglia nicht betroffen, was bestätigt, dass ILY die Blut-Hirn-Schranke nicht überschreitet. (C) Stabilität der hCD59-Expression auf nierenresidenten Makrophagen (KRMs) 15 und 30 Tage nach Tamoxifen-Induktion, beurteilt durch Durchflusszytometrie. (D) Bewertung der Cre-unabhängigen Leckage in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäusen. Vehikelbehandelte (VC = Maisöl) Mäuse wiesen eine vernachlässigbare CD11bintF480hihCD59+ (0,93%) CD11b+CX3CR1+hCD59+ Population (1,8%) auf, während Tamoxifen-behandelte Mäuse einen deutlichen Anstieg von 87% bzw. 81% zeigten, was eine effiziente Cre-vermittelte Rekombination durch Tamoxifen bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Die erfolgreiche Expression, Reinigung und funktionelle Validierung von His-markiertem rekombinantem ILY in dieser Studie folgte einem etablierten Protokoll¹⁵. Der Prozess umfasste jedoch mehrere kritische Schritte, die eine hohe Proteinausbeute, Reinheit und biologische Aktivität gewährleisteten. Die Induktion von E. coli BL21 (DE3)-Zellen mit IPTG wurde optimiert, um die Proteinexpressionsniveaus auszugleichen und gleichzeitig die Bildung von Einschlusskörpern zu minimieren. Trotz der Robustheit dieses Protokolls waren bestimmte Modifikationen und Schritte zur Fehlerbehebung erforderlich, um die Ausbeute und Funktionalität zu maximieren. Eine wichtige Modifikation war die Optimierung der IPTG-Konzentration und der Induktionstemperatur, da eine übermäßige Expression bei höheren Temperaturen zu unlöslichen Aggregaten führte. Eine schrittweise Erhöhung des IPTG von 0,2 mM auf 0,5 mM bei 37 °C verbesserte die Löslichkeit erheblich. Darüber hinaus wurden während der Aufreinigung die Imidazolkonzentrationen in den Waschpuffern sorgfältig angepasst, um die unspezifische Proteinbindung zu minimieren und gleichzeitig eine effiziente Elution zu gewährleisten.

In diesem Manuskript beschreiben wir ein hochspezifisches Protokoll für die selektive Ablation und anschließende Regeneration von Nierenmakrophagen (RMs) mit dem ILY-hCD59-System. Dieser Ansatz bietet einzigartige Vorteile für die Untersuchung der Biologie und Regeneration von Makrophagen im Vergleich zu herkömmlichen Ablationstechniken, denen es oft an Spezifität mangelt oder die Off-Target-Effekte induzieren. Die Studie unterstreicht die Bedeutung präziser Methoden, um die Rolle von RMs bei der Nierenhomöostase, der Immunregulation und der Gewebereparatur zu analysieren. RMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Nierenfunktion, der Beeinflussung von Immunreaktionen, der Gewebereparatur und der Fibrose. Dysregulierte RMs sind an mehreren Nierenerkrankungen beteiligt, einschließlich chronischer Entzündungen und gestörter Regeneration 11,17,18. Aktuelle Ansätze zur Depletion von Makrophagen, wie z. B. Clodronat-Liposomen, Diphtherietoxin-Rezeptor-Systeme (DTR) oder genetische Knockouts, leiden oft unter Einschränkungen wie mangelnder Spezifität, Off-Target-Effekten oder der Induktion eines langsamen, Apoptose-vermittelten Zelltods¹⁹. Diese Einschränkungen erschweren die Untersuchung der Regenerationsdynamik von Makrophagen. Im Gegensatz dazu bietet das ILY-hCD59-System eine schnelle und hochspezifische Ablation von hCD59-exprimierenden CX3CR1+-RMs und bietet damit eine leistungsstarke Plattform zur Untersuchung der Makrophagen-Nischenregeneration in der Niere. Wichtig ist, dass frühere Studien gezeigt haben, dass die ILY-hCD59-Interaktion in Geweben ohne hCD59-Expression keine Off-Target-Effekte hervorruft, was die Spezifität und Reproduzierbarkeit dieses Protokolls gewährleistet^13,14. Bemerkenswert ist, dass eine frühere Studie an gesunden Mausnieren zwei Hauptuntergruppen von RM zeigte, zwei Hauptuntergruppen von RM, eine Ccr2+RM und die andere Cd63+RM²⁰. Es wäre interessant zu bestimmen, wie ILY diese beiden Populationen in Tamoxifen-behandeltem CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- in zukünftigen Studien effizient abliert.

Über die Depletion von Makrophagen hinaus bietet dieses System ein vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und anderen Nierenzelltypen. Zum Beispiel sind tubuläre Epithelzellen (TECs) auf Makrophagen-abgeleitete Signale angewiesen, um nach einer Verletzung zu überleben und zu reparieren²¹. Die Fähigkeit, RMs zu depletieren und zu regenerieren, bietet eine einzigartige Gelegenheit zu untersuchen, wie Makrophagen-TEC-Crosstalk die TEC-Proliferation, -Reparatur und die allgemeine Nierenfunktion beeinflusst²². Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die Rolle von RMs bei der Fibroseregulation zu untersuchen, wobei proinflammatorische Makrophagen zur Fibrogenese beitragen und reparative Makrophagen die Fibroseauflösung unterstützen²³. Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse könnten die Entwicklung von Makrophagen-zielgerichteten Therapien zur Modulation der Fibrose bei chronischen Nierenerkrankungen leiten. Die Implikationen dieser Methode gehen über die Makrophagenbiologie hinaus, da sie die Untersuchung von RM-Wechselwirkungen mit anderen Nierenzelltypen, einschließlich Endothelzellen und Perizyten, ermöglicht. Diese Zellen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität und die Regulierung von Entzündungen²⁴. Das ILY-hCD59-System bietet eine Plattform, um zu untersuchen, wie sich RM-Depletion und -Regeneration auf die Gesundheit der Nierengefäße und die allgemeine Nierenfunktion auswirken, und bietet einen Einblick in die breiteren Auswirkungen der Makrophagenaktivität bei Nierenerkrankungen.

Die ILY-basierte Depletionstechnik bietet zwar eine hohe Spezifität, hat aber inhärente Einschränkungen. Die Methode beruht auf der hCD59-Expression, wodurch ihre Anwendung auf transgene Modelle, die humanisiertes CD59 exprimieren, beschränkt und die Verallgemeinerbarkeit auf nicht-transgene Mäuse beschränkt wird. Darüber hinaus depletiert ILY, wie gezeigt, die Mikrogliazellen in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- (Ergänzende Abbildung 1B)), das ILY/hCD59-Ablationswerkzeug kann nicht für eine spezifische Manipulation der Mikrogliapopulation verwendet werden. Darüber hinaus depletiert ILY zwar selektiv hCD59+-Makrophagen, unterscheidet jedoch nicht zwischen verschiedenen Makrophagen-Untergruppen innerhalb der Niere.

Zusätzlich zu ihrem Nutzen in der Niere hat die ILY-hCD59-Plattform eine breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung der Regenerationsfähigkeit anderer Zelltypen gezeigt. Zum Beispiel wurde dieses System zur Ablation von Gallengangszellen eingesetzt, was die Untersuchung der Gallengangsregeneration ermöglicht, Adipozyten anspricht und Studien zu Adipozyten-vermittelten Leberschäden erleichtert^25,26. Darüber hinaus wurde es zur Ablation von interkalierten Zellen der Niere eingesetzt, was die Forschung zur Regeneration interkalierter Zellen erleichtert²⁷. Diese Anwendungen unterstreichen die Vielseitigkeit des ILY-hCD59-Systems bei der Verbesserung unseres Verständnisses der zellulären Regeneration und Gewebereparatur über mehrere Organsysteme hinweg. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das ILY-hCD59-System einen bedeutenden Fortschritt in den Makrophagen-Ablationsprotokollen darstellt. Seine Spezifität, das Fehlen von Off-Target-Effekten und die Fähigkeit, detaillierte Studien der RM-Regeneration zu ermöglichen, bieten eine robuste Plattform für die Untersuchung der Makrophagenbiologie bei der Gesundheit und Erkrankung von Nieren. Darüber hinaus werden die aus diesem Protokoll gewonnenen Erkenntnisse nicht nur unser Verständnis der Makrophagenfunktion verbessern, sondern auch therapeutische Strategien für Nierenerkrankungen, Fibrose und die Dynamik der Zellreparatur in verschiedenen Gewebetypen informieren.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Manuskript berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten. Keine Interessenkonflikte, einschließlich finanzieller, nichtfinanzieller, beruflicher oder persönlicher Zugehörigkeiten, haben das Design, die Durchführung, die Interpretation oder die Präsentation der Studie beeinflusst.

Wir danken sowohl den ehemaligen als auch den aktuellen Mitgliedern des Qin-Labors für ihre Beiträge zur Entwicklung und Verfeinerung der in dieser Studie verwendeten Protokolle. Wir danken auch der Gruppe von Dr. R. K. Tweden am Health Sciences Center der University of Oklahoma für die großzügige Bereitstellung des rekombinanten ILY Plasmids, das bei dieser Forschung eine wichtige Rolle gespielt hat. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) durch die Zuschüsse NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) und R21OD024931 (X.Q.) unterstützt.