Deplezione rapida dei macrofagi renali utilizzando lo strumento di ablazione cellulare CD59/intermedisina umana

Qui si riporta un protocollo per l'ablazione selettiva dei macrofagi renali per studiarne la rigenerazione utilizzando lo strumento di ablazione cellulare umana CD59/intermedisina. Questo metodo è applicabile anche per studiare la funzione e la rigenerazione delle altre popolazioni cellulari nei reni, nel fegato e nel tessuto adiposo.

I macrofagi renali (RM) sono essenziali per la salute dei reni, orchestrando la sorveglianza immunitaria, l'omeostasi dei tessuti e le risposte alle lesioni. In precedenza, abbiamo riportato l'uso di uno strumento di ablazione cellulare umana CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) per studiare il destino, la dinamica e le nicchie distinte delle RM di origine midollare o embrionale. Le RM originano dai macrofagi derivati dal sacco vitellino, dai monociti epatici fetali e dai monociti derivati dal midollo osseo e si mantengono in età adulta attraverso la proliferazione locale e il reclutamento di monociti circolanti. Qui, riportiamo un protocollo dettagliato per l'ablazione selettiva di RM per studiare la loro rigenerazione, che include 1) generazione e caratterizzazione dell'espressione Cre-inducibile di hCD59 in RM di topo, 2) purificazione di ILY e caratterizzazione dell'attività di IJLY, 3) induzione dell'espressione di hCD59 su RM in topi composti e 4) caratterizzazione della rigenerazione dopo ablazione di RM mediata da ILY. ILY esaurisce specificamente e rapidamente le RM nei topi composti, con un'efficiente ablazione dei macrofagi entro 1 giorno dalla somministrazione di IJLY. La rigenerazione dei macrofagi renali è iniziata entro il giorno 3 dopo l'ablazione, con un recupero di ~88% entro il giorno 7. Questo modello offre un potente strumento per lo studio della biologia dei macrofagi e può essere utilizzato per l'ablazione selettiva di altre popolazioni cellulari nei reni, nel fegato e nei tessuti adiposi per studiarne la funzione e la rigenerazione.

I macrofagi renali (RM) sono cellule immunitarie essenziali che mantengono l'omeostasi renale, regolano le risposte immunitarie e promuovono la riparazione dei tessuti dopo una lesione. Svolgono una varietà di funzioni, tra cui la fagocitosi, la presentazione dell'antigene e l'orchestrazione delle risposte infiammatorie e antinfiammatorie ^1,2,3. A seconda dell'ambiente locale, le RM possono polarizzarsi in fenotipi pro-infiammatori (M1) o anti-infiammatori (M2), esacerbando le lesioni o facilitando la guarigione ^4,5,6. La disregolazione delle RM è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione del danno renale acuto (AKI) e della malattia renale cronica (CKD), rendendole attori fondamentali nella salute e nella patologia renale ^7,8. Le RM derivano da varie fonti, tra cui i macrofagi derivati dal sacco vitellino durante l'embriogenesi, i monociti epatici fetali e i monociti derivati dal midollo osseo in età adulta. Le RM si espandono e maturano in parallelo con la crescita renale postnatale, originando principalmente dai monociti epatici fetali prima della nascita, con l'automantenimento durante l'età adulta integrata da monociti periferici⁹. Negli adulti, i monociti circolanti vengono reclutati nel rene da segnali omeostatici o di lesione, differenziandosi in macrofagi sotto influenze microambientali locali. Il mantenimento della RM è sostenuto dalla proliferazione locale e dal rifornimento periodico dai monociti circolanti 9,10,11,12.

In precedenza abbiamo dimostrato l'uso del sistema di ablazione cellulare umana CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) come strumento^13,14 per studiare i distinti destini, le dinamiche e le nicchie microambientali delle RM derivate dal midollo osseo o da origini embrionali⁹. ILY lisa selettivamente le cellule umane in pochi secondi formando pori nelle membrane cellulari mirate¹⁵. Questa specificità deriva dall'esclusiva affinità di legame di ILY per il CD59 umano (hCD59), senza alcuna interazione o effetto litico su cellule di altre specie prive di questo recettore¹⁵. Sulla base di questo concetto, abbiamo progettato uno strumento che consente l'ablazione rapida, condizionale e mirata di cellule umane che esprimono CD59 in modelli murini transgenici attraverso l'applicazione di intermedilisina (ILY)¹⁴. Per facilitare l'uso di questo strumento, abbiamo sviluppato un modello di ablazione cellulare condizionale e mirata generando topi knockin STOP-CD59 floxati (ihCD59), in cui l'espressione di CD59 umano avviene solo dopo la ricombinazione mediata da^Cre13. In precedenza, è stato riscontrato il gene CX3CR1cre-EFP espresso esclusivamente su CD11bintF480hi, definito come macrofagi renali⁹. Pertanto, abbiamo utilizzato le linee CX3CR1CreER2^+/+  per incrociare con topi ihCD59 per esprimere hCD59 sui macrofagi renali. Abbiamo generato con successo topi composti con il genotipo ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ e -/- indicano rispettivamente i topi transgenici omozigoti, emizigoti e non portatori). Somministrazione di tamoxifene in topi composti ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- marcati condizionatamente e marcati RM dall'espressione di hCD59⁹. A seguito della deplezione della nicchia di RM attraverso il trattamento con IJLY, i monociti periferici si sono prontamente differenziati in RM derivati dal midollo osseo, ripopolando efficacemente la nicchia come precedentemente descritto in⁹. Questa rigenerazione è stata criticamente dipendente dall'asse di segnalazione CX3CR1/CX3CL1, sottolineando il suo ruolo essenziale sia nel mantenimento che nel ripristino della popolazione RM⁹. Abbiamo anche dimostrato che, a causa delle loro distinte capacità glicolitiche, le RM di origine embrionale hanno una maggiore capacità di eliminare i complessi immunitari e sono più sensibili alle sfide immunitarie rispetto alle RM derivate dal midollo osseo⁹.

Presentiamo un protocollo dettagliato per l'ablazione selettiva delle RM per studiare la loro rigenerazione utilizzando l'ablazione cellulare rapida mediata da Cre-inducibile da hCD59 (ihCD59) dopo somministrazione di ILY. L'iniezione di ILY ha causato l'ablazione mirata di RM che esprimono condizionatamente e specificamente hCD59 in topi composti CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- . Dopo l'ablazione, abbiamo monitorato i cambiamenti dinamici dei macrofagi utilizzando la citometria a flusso e abbiamo riscontrato una rapida deplezione dei macrofagi seguita dalla rigenerazione delle RM. ILY ricombinante è stato espresso in cellule BL21 (DE3) di E. coli e purificato mediante cromatografia di affinità nichel-NTA. La purezza e la funzionalità dell'ILY ricombinante sono state confermate da SDS-PAGE, spettrofotometria e un test di emolisi, dimostrando la sua caratteristica attività di citolisina colesterolo-dipendente. Abbiamo usato ILY per esaurire le RM nei topi, ottenendo un'efficiente ablazione dei macrofagi entro 1 giorno dalla somministrazione di ILI. La rigenerazione dei macrofagi renali è iniziata il giorno 3 dopo l'ablazione, con un recupero del ~85% entro il giorno 7. I dati suggeriscono che la rigenerazione è guidata principalmente dal reclutamento dei monociti. Questo modello offre un potente strumento per lo studio della biologia dei macrofagi e ha un potenziale terapeutico per la manipolazione mirata delle popolazioni di macrofagi nelle malattie renali. Lo strumento di ablazione cellulare ihCD59/ILY può essere utilizzato per studiare la funzione cellulare e la rigenerazione nei reni, nel fegato, nel tessuto adiposo e in altri organi.

I protocolli di studio sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Tulane University, School of Medicine (numero di protocollo 1482). I topi sperimentali, Cx3cr1CreER^+/+ e ihCD59^+/+, di età compresa tra 10 e 12 settimane e con un peso di 25-30 g, sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) presso la struttura per animali dell'università. Tutte le procedure che prevedono l'isolamento dei reni sono state condotte in un ambiente sterile, con i ricercatori che indossavano guanti e maschere facciali per prevenire la contaminazione. I dettagli relativi ai reagenti e alle attrezzature utilizzate nello studio sono disponibili nella tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

1. Ottieni CX3CR1CreER^+/+topi dal Laboratorio Jackson. Ospita i topi presso la Tulane University School of Medicine (SOM) in una struttura specifica priva di agenti patogeni (SPF). Mantenere gli animali sotto un ciclo luce/buio di 12 ore con condizioni ambientali controllate.
2. Utilizzare topi ihCD59+/+ precedentemente generati con un background genetico C57BL/6 per l'allevamento. Incrociare topi omozigoti CX3CR1CreER^+/+ (carenti nell'espressione di CX3CR1) con topi ihCD59^+/- per produrre i seguenti genotipi di prole: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-e CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-.
3. Assicurarsi che i topi eterozigoti CX3CR1CreER^+/- mantengano l'espressione funzionale di CX3CR1, mentre i topi omozigoti CX3CR1CreER^+/+ siano carenti di CX3CR1 mediante analisi di citometria a flusso con anticorpo anti-CX3CR1⁹.

2. Produzione di ILY (derivata da^14,15 )

1. Giorno 0
   1. Recuperare il ceppola congelata del ceppo batterico ILY BL21-DE3-RIPL che trasporta sequenze ILY marcate con His-A nel plasmide pTrcHis-A (Figura supplementare 1) conservato a -80 °C. Inoculare 10 μL del brodo batterico in 40 μL di terreno di brodo di Luria (LB) contenente ampicillina a una concentrazione di 1 μg/mL.
   2. Distribuire la miscela inoculata su una piastra di agar LB integrata con ampicillina (1 μg/mL). Incubare la piastra per una notte a 37 °C in un incubatore batterico.
2. Giorno 1
   1. Seleziona sei colonie individuali dalla piastra di agar LB. Inoculare ogni colonia in 3,5 ml di terreno LB contenente ampicillina. Incubare le colture per una notte a 37 °C.
3. Giorno 2
   1. Trasferire ogni coltura starter da 3,5 mL in 250 mL di terreno LB integrato con ampicillina. Incubare le colture a 37 °C per 3 ore agitando a 230 x g per consentire la crescita batterica.
   2. Dopo 3 ore, aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) da una soluzione madre 1 M (conservata a -20 °C) a una diluizione 1:1000 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Continuare l'incubazione per altre 4 ore per indurre l'espressione proteica.
   3. Pesare una bottiglia da centrifuga vuota e registrare il peso. Trasferire circa 250 mL della coltura indotta nel flacone da centrifuga.
   4. Pellettare le celle centrifugando a 10.000 x g per 15 min a 4 °C. Scartare il surnatante, quindi pesare il flacone contenente il pellet. Calcolare il peso del pellet sottraendo il peso della bottiglia vuota dal peso totale dopo la centrifugazione.
   5. Conservare il pellet batterico a -20 °C per la successiva estrazione e purificazione di ILY.
4. Giorno 3 : Estrazione e purificazione di ILY
   1. Preparare il tampone di lisi combinando 30 ml di reagente per l'estrazione di proteine Bug Buster con 30 μl di nucleasi benzonasi (1200 unità Kunitz) e 0,9 μl di lisozima (10.000 unità di attività enzimatica) in una provetta da centrifuga da 50 mL.
   2. Mescolare delicatamente la soluzione per garantire che il tampone di lisi sia omogeneo. Aggiungere il tampone di lisi preparato al pellet batterico (2-5 g). Agitare accuratamente la miscela per 30-60 s per risospendere completamente le cellule batteriche.
   3. Dividere la soluzione risospesa in parti uguali tra due provette da centrifuga da 50 mL. Mettere le provette sul ghiaccio e incubare per 30-90 minuti. Durante l'incubazione, agitare delicatamente le provette utilizzando un agitatore orbitale e agitare brevemente ogni 5-10 minuti per 10-15 s per migliorare la lisi cellulare.
   4. Dopo l'incubazione, centrifugare i lisati a 4.900 x g per 30 minuti a 4 °C.
   5. Lavare accuratamente la colonna con acqua di rubinetto utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml per rimuovere la resina residua dall'uso precedente.
   6. Sciacquare la colonna con etanolo al 70% per sanificarla. Lavare la colonna 2x-3x con ddH₂O freddo per rimuovere eventuali residui di etanolo. Posizionare la colonna nel supporto.
   7. Aggiungere 6-10 mL di ddH₂O freddo per lavare ulteriormente ed equilibrare la colonna per la purificazione. Aggiungere circa 3 mL di perle di resina alla colonna. Collegare la colonnina ad una pompa peristaltica impostata su una velocità di 30.
   8. Aggiungere 10 ml di ddH₂O freddo per sospendere completamente la resina e prepararla per il legame proteico. Lavare le perle di resina con 15 ml di 1x tampone di ricarica per preparare la resina al legame proteico.
   9. Raccogliere il surnatante di lisato batterico dopo la centrifugazione in una provetta nuova, assicurandosi che il pellet venga scartato. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da 0,45 μm con una siringa per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti.
   10. Far passare 20-25 mL di lisato batterico filtrato attraverso la colonna in tre cicli separati. Dopo ogni passaggio, raccogliere 20 μl di flusso ed etichettarlo come P.E. per la successiva misurazione della densità ottica (OD).
   11. Lavare la colonna con 20-30 mL di tampone legante per rimuovere le proteine non legate. Lavare la colonna con 20-30 ml di Wash Buffer. Raccogliere 20 μl della frazione di lavaggio per la misurazione OD.
   12. Eluire la proteina legata aggiungendo 10-20 ml di tampone di eluizione. Iniziare a raccogliere l'eluizione dopo 3-4 minuti utilizzando provette da microcentrifuga. Raccogliere circa 1 ml per provetta, riempiendo 15-17 provette.
   13. Misurare l'assorbanza di ciascuna frazione di eluizione in A280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer di eluizione come spazio vuoto durante le letture A280. Raccogliere le provette con assorbanza notevolmente aumentata all'A280 poiché contengono la proteina ILY marcata con His, che si trova tipicamente nelle frazioni intorno alla provetta 13.
   14. Conservare le frazioni di eluizione (o le provette) contenenti la proteina ILY a 4 °C. Procedere con ulteriori passaggi entro il giorno successivo per garantire una stabilità ottimale delle proteine.
       NOTA: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio o a 4 °C, ove possibile, per mantenere l'integrità delle proteine.
5. Giorno 4: Rimozione dell'endotossina dall'eluizione
   1. Sciacquare la colonna di resina per la rimozione delle endotossine con 6-10 ml di acqua ultrapura. Premere delicatamente la colonna per regolare il flusso.
   2. Sciacquare la colonna con 10 ml di soluzione desossicolato di sodio all'1% (appena preparata o non più vecchia di 1 mese) per rimuovere le endotossine legate. Sciacquare nuovamente la colonna con 6-10 ml di acqua ultrapura per rimuovere eventuali residui di detersivo.
   3. Applicare il campione proteico preparato sulla colonna di resina. Incubare il campione nella colonna per 1 ora a temperatura ambiente (RT) per consentire un legame ottimale delle endotossine.
   4. Raccogli la frazione di flusso iniziale. Aggiungere ddH₂O alla colonna per un'ulteriore eluizione e raccogliere le frazioni eluite in circa 10 provette (1 mL per provetta).
   5. Conservare la colonna di resina in etanolo al 25% a 4 °C per un uso futuro. Misurare la densità ottica (O.D.) dei campioni di proteine eluite per quantificare la resa. Aspettatevi di recuperare circa il 50%-70% delle proteine totali dal primo lotto di eluizione.
6. Giorno 5-6: Dialisi
   1. Preparare 2 L di tampone per dialisi in autoclave 1600 mL di acqua distillata e deionizzata (ddH₂O). Aggiungere 200 ml di 10x PBS, 200 ml di glicerolo e 3,5115 g di MES (acido 2-(N-morfolino) etansolfonico) all'acqua sterilizzata in autoclave.
   2. Mescolare la miscela con un'ancoretta magnetica fino a quando tutti i reagenti non sono completamente sciolti. Conservare il tampone risultante a 4 °C.
   3. Aggiungere le frazioni di eluizione immagazzinate al kit di dialisi, quindi rimuovere l'aria dal kit di dialisi con un ago. Dializzare la soluzione proteica utilizzando il kit per dialisi per 24 ore a 4 °C con una velocità di agitazione impostata a circa 2.
   4. Configurare il kit per dialisi in modo che sia completamente immerso nel tampone. Sostituire il tampone per dialisi nel kit per dialisi con un tampone per dialisi fresco in un contenitore da 2 L il giorno successivo. Continuare la dialisi per altre 24 ore.
   5. Trasferire con cura l'intera soluzione, compresi i precipitati bianchi, in una provetta sterile per preservare la proteina ILY, che può aggregarsi. Concentrare la proteina ILY utilizzando un'unità di filtro centrifuga, seguendo le istruzioni del produttore per la centrifugazione.
   6. Aliquotare la proteina ILY concentrata in porzioni da 200 μl in provette sterili. Etichettare ogni tubo con la data e il nome. Conservare le aliquote a -80 °C per un uso futuro in saggi di elettroforesi su gel ed emolisi.

3. Caratterizzazione ILY mediante elettroforesi SDS-PAGE

1. Preparare il buffer di esecuzione MOPS SDS (1x) diluendo il buffer di corsa (20x) con ddH₂O.
2. Preparare il tampone del campione in una cappa aspirante mescolando 90 μl di tampone di caricamento 6x con 10 μl di β-mercaptoetanolo (β-ME). Mescolare accuratamente la soluzione per garantire una completa omogeneizzazione.
3. Combinare il campione preparato con il tampone di caricamento per ottenere un volume finale di 30 μl. Scongelare i campioni e agitarli energicamente per garantire una miscelazione completa.
4. Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti per denaturare le proteine. Caricare i campioni su un gel SDS-PAGE al 4%-20%. Eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 80 V per 90 minuti.
5. Aprire con cautela la cassetta del gel e immergere il gel in ddH₂O per 5 min. Ripetere la fase di lavaggio 2 volte utilizzando uno shaker.
6. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Lavare il gel per 30 minuti in ddH₂O. Sostituire l'acqua con ddH₂O fresco e incubare il gel su uno shaker per un periodo che va dalla notte a 3 giorni per la completa decolorazione.
7. Acquisire un'immagine del gel colorato utilizzando una fotocamera (Figura 1A). Analizza il gel utilizzando il software ImageJ per valutazioni quantitative e qualitative.

4. Dosaggio emolitico per attività ILY

1. Scongelare completamente i campioni di ILY (Intermedilysin) conservati a temperatura ambiente. Agitare accuratamente i campioni scongelati per garantire l'omogeneità, poiché ILY può aggregarsi durante lo scongelamento.
2. Impostare una piastra a 96 pozzetti per diluizioni seriali. Aggiungere 160 μl della soluzione madre ILY (26,7 ng/μl) al primo pozzetto. Aggiungere 80 μl di 1x PBS a ciascuno dei pozzetti successivi nella stessa riga o colonna.
3. Trasferire 80 μl della soluzione ILY dal primo pozzetto al secondo pozzetto. Miscelare accuratamente pipettando su e giù per assicurarsi che la soluzione sia omogenea. Trasferire 80 μl dal secondo al terzo pozzetto e mescolare accuratamente.
4. Ripetere questo processo per ogni pozzetto, trasferendo 80 μl dal pozzetto precedente al successivo fino a preparare il numero di diluizioni desiderato. Dopo aver trasferito 80 μl nell'ultimo pozzetto, scartare 80 μl da quel pozzetto per garantire volumi costanti in tutta la piastra.

5. Preparazione dei globuli rossi umani (RBC)

1. Aspirare 1-2 ml di sangue umano fresco in una provetta contenente un anticoagulante, come l'EDTA. Centrifugare il sangue a temperatura ambiente a 3.000 x g per 5 minuti.
2. Scartare il surnatante e lavare il pellet di globuli rossi umani con PBS 2x-3x fino a quando il surnatante non è limpido. Diluire i globuli rossi umani lavati aggiungendo 10 μl di globuli rossi a 900 μl di 1x PBS per ottenere una diluizione 1:100.
3. Aggiungere 10 μl di globuli rossi umani diluiti in ciascun pozzetto. Aggiungere 30 μl della soluzione ILY diluita in serie dalla piastra di diluizione a ciascun pozzetto. Aggiungere 160 μl di 1x PBS per portare il volume finale a 200 μl per pozzetto (concentrazione iniziale: 4 ng/μl).
4. Aggiungere 10 μl di globuli rossi umani diluiti ai pozzetti di controllo. Aggiungere 190 μL di acqua o 1x PBS ai pozzetti di controllo per i controlli negativi. Mescolate i piatti picchiettandoli delicatamente.
5. Incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti per consentire l'emolisi. Centrifugare le piastre a 3.000 x g per 5 minuti per pellettare eventuali globuli rossi umani intatti.
6. Trasferire con cautela 100 μl di surnatante da ciascun pozzetto a una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Misurare l'assorbanza dei surnatanti a 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
7. Calcolare l'attività emolitica di ILY confrontando i valori di assorbanza dei campioni con quelli del controllo¹⁶.

6. Trattamento con tamoxifene, esaurimento RM e rigenerazione

1. Preriscaldare l'olio di mais a 42 °C. Sciogliere 100 mg di tamoxifene in 5 mL di olio di mais preriscaldato per preparare una soluzione madre con una concentrazione di 20 mg/mL.
2. Somministrare tamoxifene per via intraperitoneale (i.p.) a topi maschi CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- di età compresa tra 10 μg/g di peso corporeo alla dose di 100 μg/g di peso corporeo. Ripetere l'iniezione di tamoxifene per 3 giorni consecutivi.
3. Attendere 15 giorni dopo l'ultima iniezione di tamoxifene per consentire l'espressione di hCD59 mediata da Cre.
4. Iniettare una singola dose di intermedilisina (ILY) per via endovenosa nei topi CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- e nei controlli della cucciolata CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- alla dose di 120 ng/g di peso corporeo.
5. Monitorare e confermare l'ablazione RM e la successiva rigenerazione eseguendo la citometria a flusso a 1, 3 e 7 giorni dopo la somministrazione di ILY¹⁷.

7. Eutanasia del topo

1. Collocare l'animale in una camera appropriata ed esporlo all'isoflurano in conformità con i protocolli IACUC. Verificare l'anestesia controllando l'assenza di riflessi, come il riflesso di ritiro del pedale.
2. Una volta che il topo è completamente anestetizzato e non risponde, eseguire la lussazione cervicale per garantire l'eutanasia. Confermare l'eutanasia verificando l'assenza di riflessi, come il riflesso di ritiro del pedale.
3. Praticare un'incisione sulla linea mediana di circa 2 cm sull'addome utilizzando un bisturi sterile e ritrarre delicatamente la pelle per esporre la cavità toracica. Apri la gabbia toracica lungo lo sterno usando le forbici chirurgiche a punta smussata per esporre il cuore.
4. Inserire un ago 21G-23G nel ventricolo sinistro. Iniziare la perfusione con 10-20 ml di PBS freddo per eliminare il sangue.
5. Tagliare l'atrio destro per consentire al sangue di defluire dalla circolazione. Continua la perfusione fino a quando i reni appaiono pallidi, indicando un'efficace eliminazione del sangue.
6. Individua i reni contro la parete dorsale del corpo. Separa delicatamente i reni dai tessuti circostanti usando una pinza e delle forbici. Asportare le capsule renali e mettere immediatamente i reni in PBS freddo per prevenire la degradazione.

8. Digestione dei reni

1. Preparare il cocktail di enzimi digestivi mescolando 9 ml di HBSS (senza Ca/Mg), 1 ml di collagenasi IV (5 mg/mL) e 20 μL di DNasi I (10 mg/mL). Preparare la soluzione enzimatica fresca e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Tritare i reni in piccoli frammenti (idealmente ≤ 1 mm) utilizzando forbici sterili in una capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS. Trasferire i frammenti di tessuto renale in provette da 15 mL contenenti 10 mL della soluzione enzimatica preparata.
3. Incubare le provette a 37 °C per 30 minuti con una leggera agitazione per dissociare il tessuto. Triturare delicatamente il tessuto utilizzando una pipetta o uno stantuffo della siringa per dissociare ulteriormente i grumi cellulari.
4. Rimuovere i detriti tissutali facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 10 minuti a 18 °C.
5. Decantare accuratamente il tampone dopo la centrifugazione. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi.
6. Lavare le cellule con PBS per rimuovere il tampone di lisi. Mantenere la sospensione a cella singola risultante sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.

9. Centrifugazione in gradiente di densità

1. Per arricchire le cellule ematopoietiche, risospendere il pellet cellulare del lavaggio precedente in 10 mL di soluzione con gradiente di densità al 30%. Stratificare accuratamente la soluzione su 3 mL di soluzione con gradiente di densità al 70% in una provetta da centrifuga.
2. Centrifugare la pendenza a 500 x g per 30 minuti senza frenare. Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di interfase tra le soluzioni al 30% e al 70%; Questo strato contiene le singole cellule arricchite.
3. Lavare le cellule raccolte 2 volte con 10 mL di PBS centrifugando a 500 x g per 10 minuti ogni volta. Risospendere il pellet cellulare finale in 1 mL di tampone FACS (1x PBS con 2% FBS) in una provetta da 1,5 mL.
4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro al microscopio a campo chiaro. Regolare la concentrazione delle cellule su 2 x 10⁶ cellule/mL.

10. Colorazione con citometria a flusso, acquisizione

1. Regolare la concentrazione cellulare da sospensioni di singole cellule preparate da tessuto renale di topo a 2-3 x 10⁶ cellule/mL per l'analisi citofluorimetrica.
2. Pellettare le cellule in provette da 1,5 mL centrifugando a 650 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone FACS.
3. Aggiungere l'anticorpo anti-CD16/32 a una diluizione 1:200 per bloccare il legame non specifico del recettore Fc. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Utilizzare il colorante Aqua Live/Dead per distinguere le cellule vive da quelle morte, seguendo le istruzioni del produttore.
5. Colorare le cellule con anticorpi pre-coniugati a una diluizione 1:100, tra cui CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE e F4/80-BV605. Aggiungere il cocktail di anticorpi alla sospensione cellulare.
6. Incubare il campione per 30 minuti a 4 °C al buio per proteggere i fluorofori dal fotosbiancamento. Lavare le cellule colorate 2 volte con tampone FACS (PBS con siero fetale bovino al 2%) centrifugando a 650 x g per 5 minuti.
7. Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) all'1% per 30 minuti su ghiaccio. Lavare le celle fisse 2 volte con tampone FACS per rimuovere il PFA residuo.
8. Acquisire cellule colorate e fissate utilizzando un citometro a flusso. Analizza i dati utilizzando il software.
9. Identificare i macrofagi e le microglia residenti nei reni e in altri tessuti utilizzando i marcatori CD45, CD11b e F4/80 come descritto in⁹ .
10. Eseguire il gating iniziale per selezionare le celle vive in base ai profili FSC (Direct Scatter) e SSC (Side Scatter). Elimina i doppietti impostando l'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto all'altezza di dispersione diretta (FSC-H). Escludere le cellule morte utilizzando il colorante di vitalità LIVE/DEAD.
11. Arricchisce le cellule immunitarie controllando le popolazioni CD45+. Definire i macrofagi residenti nei reni come cellule CD11b+F4/80++ all'interno della popolazione CD45+, come mostrato nella strategia di gating (Figura 2A).
12. Definire le popolazioni di microglia come cellule CD11b+CD45ⁱⁿt (Figura 2B). Eseguire l'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. Condurre l'analisi finale utilizzando il software per completare lo studio citofluorimetrico.

La purificazione dell'ILY ricombinante His-Tag ha seguito lo stesso protocollo precedentemente descritto in¹⁴. ILY è stato espresso con successo in cellule BL21(DE3) di E. coli , trasformate con un plasmide codificante il gene ILY da Streptococcus intermedius. Dopo l'induzione con IPTG, era evidente una sovraespressione della proteina bersaglio. Dopo l'espressione, l'ILY è stato purificato mediante cromatografia di affinità nichel-NTA, sfruttando un His-tag C-terminale per il legame specifico. La purezza e il peso molecolare di ILY (~54 kDa) sono stati confermati dall'analisi SDS-PAGE (Figura 1A). L'intensità della banda proteica è stata quantificata mediante densitometria utilizzando il software ImageJ e la concentrazione proteica è stata ulteriormente verificata mediante analisi spettrofotometrica, ottenendo una concentrazione finale di 1,27 mg/mL. L'attività biologica dell'ILY purificato è stata valutata utilizzando un test di emolisi con globuli rossi umani (RBC), un test standard per la valutazione delle citolisine colesterolo-dipendenti. Il test ha dimostrato un'attività emolitica dose-dipendente, confermando l'integrità funzionale della proteina ricombinante. L'emolisi completa è stata ottenuta con il controllo positivo (acqua), mentre non si è verificata emolisi nel controllo negativo (tampone BPS). L'ILY purificato ha mostrato una potente attività emolitica, con una lisi del 50% dei globuli rossi osservata a una concentrazione di 7,24 ng/mL e un'emolisi quasi completa (99,62%) a 650 ng/mL (Figura 1B). Questi risultati confermano che l'ILY ricombinante mantiene la sua caratteristica attività di formazione dei pori, coerente con le proprietà delle citolisine colesterolo-dipendenti. Il successo dell'espressione e della purificazione di ILY ha prodotto una proteina ricombinante altamente pura, e la sua attività emolitica ha confermato il corretto ripiegamento e la conservazione delle sue proprietà citolitiche funzionali.

Le RM sono altamente vulnerabili alle condizioni patologiche e possono essere fondamentali per far avanzare le strategie terapeutiche, quindi è fondamentale una comprensione approfondita di come vengono reintegrate dopo l'esaurimento della nicchia¹⁸. Per depletare e manipolare la nicchia dei macrofagi renali, abbiamo preso di mira l'interazione specifica tra ILY e CD59 umano (hCD59), che facilita l'ablazione selettiva delle cellule che esprimono hCD59 nei topi¹³. La somministrazione di ILY in topi inducibili che esprimono hCD59 incrociati con varie linee Cre-driver consente un'ablazione rapida e precisa delle cellule immunitarie ed epiteliali senza effetti off-target¹³. Per ottenere la deplezione selettiva delle RM, abbiamo somministrato ILY 15 giorni dopo l'induzione del tamoxifene in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- topi. Questo punto temporale è stato scelto per due motivi fondamentali. In primo luogo, entro il giorno 15, quasi tutte le cellule CX3CR1+ nel cervello e nei reni di questi topi continuano ad esprimere hCD59, mentre l'espressione di hCD59 è minima o assente nel sangue, nella milza, nel polmone, nel midollo osseo e nel fegato. In secondo luogo, a causa delle grandi dimensioni di ILY (54 kDa), non è in grado di attraversare la barriera emato-encefalica, assicurando che le cellule microgliali che esprimono hCD59 rimangano inalterate⁹. Per convalidare ciò, abbiamo quantificato i macrofagi CD11b+CX3CR1+ marcati con hCD59 in più organi 15 giorni dopo il trattamento con tamoxifene. Abbiamo osservato una ritenzione stabile dei macrofagi hCD59+ nel rene e nel cervello (~90%), mentre l'espressione era ≤ il 5% in altri tessuti. Dopo la somministrazione di IJLY, abbiamo raggiunto la deplezione completa e selettiva dei macrofagi renali, senza deplezione rilevabile della microglia, confermando che ILY non penetra la barriera emato-encefalica (Figura supplementare 2A - B). Per confermare la stabilità dell'espressione di CD59 e la dinamica del ripopolamento dei macrofagi residenti nel rene (KRM), abbiamo valutato l'espressione di hCD59 sui KRM a 15 e 30 giorni dopo l'induzione del tamoxifene. Le analisi di citometria a flusso hanno confermato che l'espressione di hCD59 rimane stabile nel tempo (Figura supplementare 2C). Inoltre, per valutare la potenziale perdita Cre-indipendente del CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- abbiamo valutato l'espressione di hCD59 in topi trattati con veicolo (olio di mais). Questi topi hanno mostrato una popolazione CD11bintF480hihCD59+ (0,93%) trascurabile (1,8%), Al contrario, i topi trattati con tamoxifene hanno mostrato un marcato aumento in entrambe le popolazioni (87% e 81%, rispettivamente), confermando una robusta ricombinazione Cre-mediata con una minima permeabilità basale (Figura supplementare 2D). Questi risultati convalidano la specificità del sistema inducibile e supportano l'uso di controlli trattati con veicolo in studi futuri. (Figura supplementare 2D). Come mostrato in Figura 2A - E, la deplezione di RM è stata raggiunta in modo efficiente entro un giorno dalla somministrazione di ILY CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- topi, mentre non si è verificata alcuna deplezione nei topi di controllo (CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-). Tre giorni dopo l'iniezione, la popolazione RM ha iniziato a riprendersi, raggiungendo circa il 50% del suo livello originale. Entro il giorno 7, si era ripristinato a quasi l'88% (Figura 2B - C). Successivamente, abbiamo studiato l'origine dei RM rigenerati, che potrebbero derivare dai monociti, in situ proliferazione di macrofagi residui, o una combinazione. Solo ~5% dei RM di nuova generazione esprimeva hCD59, suggerendo che in situ La proliferazione gioca un ruolo minimo nel loro ripopolamento e la maggior parte deriva probabilmente dal reclutamento di monociti (Figura 2D). Questi risultati sono coerenti con le osservazioni precedenti⁹ e fornire preziose informazioni sui meccanismi alla base della rigenerazione di RM, evidenziando la predominanza del rifornimento derivato dai monociti in seguito alla deplezione della nicchia dei macrofagi. I dati rappresentativi presentati in questo studio sono in linea con i risultati precedentemente riportati da noi⁹ .

Figura 1: SDS-PAGE e saggio di emolisi della proteina ILY ricombinante. (A) L'immagine del gel SDS-PAGE mostra la proteina ricombinante Intermedilisina (ILY) purificata. Una singola banda è visibile al peso molecolare previsto di 54 kDa, confermando il successo dell'espressione e della purificazione di ILY. La purezza delle proteine è evidente, senza che si osservino bande contaminanti importanti. Come riferimento è incluso un marcatore di peso molecolare (scala), che dimostra il corretto posizionamento della proteina ILY rispetto ai pesi molecolari noti. (B) Questo grafico presenta l'attività emolitica dose-dipendente dell'ILY purificato sugli hRBC. La percentuale di lisi cellulare viene confrontata con l'aumento delle concentrazioni di ILY e l'IC50, o la concentrazione richiesta per lisare il 50% delle cellule, è stata determinata in 7,224 ng/mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ablazione e rigenerazione dei macrofagi residenti nel rene (RM) dopo iniezione di ILY. (A) Strategia di gating utilizzata per identificare i macrofagi renali (RM), definiti come cellule CD11b+F4/80^high, da sospensioni di singole cellule di tessuto renale. Il gating iniziale ha escluso detriti, doppietti e cellule morte, quindi ha selezionato le celle CD11b+ e F4/80high. (B) Analisi con dot plot di citometria a flusso che mostrano la percentuale di popolazioni RM (CD11b+F4/80^hi) al basale (Giorno 0) e dopo l'iniezione di ILY ai giorni 1, 3 e 7. (C) La proporzione di cellule RM per rene in vari momenti (giorni 0, 1, 3 e 7) dopo somministrazione endovenosa (e.v.) di ILY (120 ng/g di peso corporeo). Confronto tra topi Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^+/- e Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^-/- (n=3, due esperimenti indipendenti, ANOVA a due vie). (D) Espressione di CD59 umano (hCD59) su macrofagi residenti nei reni nei controlli al giorno 0 e nei RM rigenerati al giorno 7 dopo l'iniezione di ILY. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato una ridotta espressione di hCD59 nelle RM rigenerate rispetto alle popolazioni RM originali (n = 3, due esperimenti indipendenti, t-test non appaiati). I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con n=3 topi per gruppo in ogni punto temporale. I risultati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD), con *p < 0,05 che indica la significatività statistica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Sequenze ILY nel vettore di espressione batterica pTrcHis-A. Le sequenze della regione limite 5' e 3' di ILY nel vettore sono evidenziate in giallo. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura 2 supplementare: Convalida dell'espressione e della stabilità di hCD59 indotta da tamoxifene nelle cellule CD11b + CX3CR1 + in diversi tessuti ed efficienza della ricombinazione mediata da Cre. (A) Analisi in citometria a flusso dei macrofagi CD11b+CX3CR1+ marcati con hCD59 in più organi 15 giorni dopo l'induzione del tamoxifene, mostrando una ritenzione stabile dei macrofagi hCD59+ nel rene e nel cervello (~90%), mentre l'espressione era ≤ il 5% in altri tessuti. (B) Dopo la somministrazione di ILY il giorno 1, la microglia è rimasta inalterata, confermando che ILY non attraversa la barriera emato-encefalica. (C) Stabilità dell'espressione di hCD59 sui macrofagi residenti nel rene (KRM) a 15 e 30 giorni dopo l'induzione del tamoxifene, valutata mediante citometria a flusso. (D) Valutazione della permeabilità Cre-indipendente nei topi CX3CR1CreER^+/-/ihCD59⁺ . I topi trattati con veicolo (VC = olio di mais) hanno mostrato una popolazione trascurabile di CD11bintF480hihCD59+ (0,93%) CD11b+CX3CR1+hCD59+ (1,8%), mentre i topi trattati con tamoxifene hanno mostrato un marcato aumento dell'87% e dell'81%, confermando un'efficiente ricombinazione mediata da Cre indotta dal tamoxifene. Clicca qui per scaricare questa figura.

L'espressione, la purificazione e la validazione funzionale di ILY ricombinante con tag His-taged in questo studio hanno seguito un protocollo ben consolidato¹⁵. Tuttavia, il processo prevedeva diversi passaggi critici che garantivano un'elevata resa proteica, purezza e attività biologica. L'induzione di cellule BL21 (DE3) di E. coli con IPTG è stata ottimizzata per bilanciare i livelli di espressione proteica riducendo al minimo la formazione di corpi di inclusione. Nonostante la robustezza di questo protocollo, sono state necessarie alcune modifiche e passaggi per la risoluzione dei problemi per massimizzare la resa e la funzionalità. Una modifica chiave è stata l'ottimizzazione della concentrazione di IPTG e della temperatura di induzione, poiché un'espressione eccessiva a temperature più elevate ha portato ad aggregati insolubili. Un aumento graduale dell'IPTG da 0,2 mM a 0,5 mM a 37 °C ha migliorato significativamente la solubilità. Inoltre, durante la purificazione, le concentrazioni di imidazolo nei tamponi di lavaggio sono state accuratamente regolate per ridurre al minimo il legame con le proteine aspecifiche, pur mantenendo un'eluizione efficiente.

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo altamente specifico per l'ablazione selettiva e la successiva rigenerazione dei macrofagi renali (RM) utilizzando il sistema ILY-hCD59. Questo approccio offre vantaggi unici per lo studio della biologia e della rigenerazione dei macrofagi rispetto alle tecniche di ablazione tradizionali, che spesso mancano di specificità o inducono effetti fuori bersaglio. Lo studio evidenzia l'importanza di metodi precisi per sezionare il ruolo delle RM nell'omeostasi renale, nella regolazione immunitaria e nella riparazione dei tessuti. Le RM svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della funzione renale, influenzando le risposte immunitarie, la riparazione dei tessuti e la fibrosi. Le RM disregolate sono implicate in diverse patologie renali, tra cui l'infiammazione cronica e la ridotta rigenerazione 11,17,18. Gli attuali approcci per la deplezione dei macrofagi, come i liposomi del clodronato, i sistemi del recettore della tossina difterica (DTR) o i knockout genetici, spesso soffrono di limitazioni come la mancanza di specificità, gli effetti off-target o l'induzione di una lenta morte cellulare mediata dall'apoptosi¹⁹. Queste limitazioni complicano la capacità di studiare le dinamiche di rigenerazione dei macrofagi. Al contrario, il sistema ILY-hCD59 offre un'ablazione rapida e altamente specifica degli RM CX3CR1+ che esprimono hCD59, fornendo una potente piattaforma per studiare la rigenerazione della nicchia dei macrofagi nel rene. È importante sottolineare che studi precedenti hanno dimostrato che l'interazione ILY-hCD59 non produce effetti off-target in tessuti privi di espressione di hCD59, garantendo la specificità e la riproducibilità di questo protocollo^13,14. Da notare che un precedente studio su reni di topo sani ha dimostrato due sottogruppi principali di RM: due sottogruppi principali di RM, uno Ccr2+RM e l'altro Cd63+RM²⁰. Sarebbe interessante determinare in che modo ILY abla efficacemente queste due popolazioni in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- trattato con tamoxifene in studi futuri.

Oltre alla deplezione dei macrofagi, questo sistema fornisce uno strumento versatile per studiare le interazioni tra i macrofagi e altri tipi di cellule renali. Ad esempio, le cellule epiteliali tubulari (TEC) si basano su segnali derivati dai macrofagi per la sopravvivenza e la riparazione dopo una lesione²¹. La capacità di esaurire e rigenerare le RM offre un'opportunità unica per studiare come il crosstalk macrofagi-TEC influenzi la proliferazione, la riparazione e la funzione renale complessiva²². Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per esplorare il ruolo delle RM nella regolazione della fibrosi, dove i macrofagi pro-infiammatori contribuiscono alla fibrogenesi e i macrofagi riparativi supportano la risoluzione della fibrosi²³. Le intuizioni ottenute da questi studi potrebbero guidare lo sviluppo di terapie mirate ai macrofagi volte a modulare la fibrosi nella malattia renale cronica. Le implicazioni di questo metodo vanno oltre la biologia dei macrofagi, in quanto facilita lo studio delle interazioni della RM con altri tipi di cellule renali, comprese le cellule endoteliali e i periciti. Queste cellule sono fondamentali per mantenere l'integrità vascolare e regolare l'infiammazione²⁴. Il sistema ILY-hCD59 offre una piattaforma per studiare come la deplezione e la rigenerazione della RM influenzino la salute vascolare renale e la funzione renale complessiva, fornendo una finestra sulle implicazioni più ampie dell'attività dei macrofagi nella malattia renale.

Sebbene la tecnica di deplezione basata su ILY offra un'elevata specificità, presenta dei limiti intrinseci. Il metodo si basa sull'espressione di hCD59, limitando la sua applicazione ai modelli transgenici che esprimono CD59 umanizzato e limitando la generalizzabilità ai topi non transgenici. Inoltre, come dimostrato, ILY non esaurisce le cellule microgliali in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- (Figura supplementare 1B), lo strumento di ablazione ILY/hCD59 non può essere utilizzato per la manipolazione specifica della popolazione microgliale. Inoltre, mentre ILY esaurisce selettivamente i macrofagi hCD59+, non distingue tra sottogruppi di macrofagi distinti all'interno del rene.

Oltre alla sua utilità nel rene, la piattaforma ILY-hCD59 ha dimostrato un'ampia applicabilità nello studio della capacità rigenerativa di altri tipi di cellule. Ad esempio, questo sistema è stato impiegato per l'ablazione delle cellule del dotto biliare, consentendo lo studio della rigenerazione del dotto biliare, mirando agli adipociti e facilitando gli studi sul danno epatico mediato dagli adipociti^25,26. Inoltre, è stato impiegato per l'ablazione di cellule intercalate renali, facilitando la ricerca sulla rigenerazione cellulare intercalata²⁷. Queste applicazioni evidenziano la versatilità del sistema ILY-hCD59 nel far progredire la nostra comprensione della rigenerazione cellulare e della riparazione dei tessuti in più sistemi di organi. In sintesi, il sistema ILY-hCD59 rappresenta un progresso significativo nei protocolli di ablazione dei macrofagi. La sua specificità, l'assenza di effetti off-target e la capacità di facilitare studi dettagliati sulla rigenerazione della RM forniscono una solida piattaforma per lo studio della biologia dei macrofagi nella salute e nella malattia dei reni. Inoltre, le intuizioni ottenute da questo protocollo non solo miglioreranno la nostra comprensione della funzione dei macrofagi, ma informeranno anche le strategie terapeutiche per le malattie renali, la fibrosi e la dinamica della riparazione cellulare in vari tipi di tessuto.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo manoscritto. Nessun conflitto di interessi, comprese le affiliazioni finanziarie, non finanziarie, professionali o personali, ha influenzato la progettazione, la conduzione, l'interpretazione o la presentazione dello studio.

Estendiamo la nostra gratitudine ai membri passati e attuali del Qin Lab per il loro contributo allo sviluppo e al perfezionamento dei protocolli utilizzati in questo studio. Ringraziamo anche il gruppo del Dr. R. K. Tweten presso l'Health Sciences Center dell'Università dell'Oklahoma per aver generosamente fornito il plasmide ricombinante ILY, che è stato determinante in questa ricerca. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) attraverso la sovvenzione NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) e R21OD024931 (X.Q.).