Weight-Drop Method로 수정되고 자기 공명 영상(Magnetic Resonance Imaging)으로 입증된 복잡하지 않은 경미한 외상성 뇌 손상 모델의 개발

본 연구에서는 단순하고 가벼운 외상성 뇌 손상의 신경영상 결과를 급성기 및 장기 뇌 위축에서 보존된 뇌 구조와 함께 복제하는 폐쇄두부 손상 동물 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다. 종방향 자기 공명 영상(Longitudinal magnetic resonance imaging)은 증거에 사용되는 기본 방법입니다.

뇌진탕으로 알려진 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 전 세계적으로 뇌 손상의 85% 이상을 차지합니다. 특히, 급성기의 일상적인 임상 영상에서 단순 mTBI가 음성 소견을 보이는 것은 이러한 환자의 조기에 적절한 치료를 방해합니다. 다양한 영향 매개변수가 mTBI 후 후속 신경 심리학적 증상의 진행에 영향을 미치고 심지어 가속화할 수 있음이 인정되었습니다. 그러나 뇌진탕 중 충격과 결과의 연관성은 광범위하게 조사되지 않았습니다. 본 연구에서는 체중 감량 부상 패러다임에서 변형된 폐쇄두부 손상(CHI)을 가진 동물 모델을 설명하고 시연했습니다. 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐(n = 20)는 충격 매개변수가 다른 CHI 그룹(그룹당 n = 4)에 무작위로 할당되었습니다. T2 가중 이미징 및 확산 텐서 이미징을 포함한 종단 MR 이미징 연구와 수정된 신경학적 중증도 점수(mNSS) 및 빔 워크 테스트와 같은 순차적 행동 평가가 50일 연구 기간 동안 수행되었습니다. 성상아교증에 대한 면역조직화학적 염색은 부상 후 50일째에 수행되었습니다. 반복적인 CHI 후 동물에서 단일 부상 및 가짜 그룹에 비해 더 나쁜 행동 수행이 관찰되었습니다. 종방향 자기공명영상(MRI)을 사용하여 부상 후 24시간 동안 심각한 뇌 타박상이 관찰되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 손상 후 50일째에 대뇌피질 위축과 대뇌피질 분획 이방성(FA)의 변화가 입증되었으며, 이는 임상적으로 복잡하지 않은 mTBI의 성공적인 복제를 시사합니다. 가장 중요한 것은 mTBI 후 관찰된 신경행동 결과와 이미지 특징의 변화가 충격횟수, 부상 간 간격 및 동물에서 선택한 충격 부위에 따라 달라졌다는 것입니다. 전임상 MRI와 결합된 이 생체 내 mTBI 모델은 전뇌 규모에서 뇌 손상을 탐구할 수 있는 수단을 제공합니다. 또한 다양한 영향 매개변수와 심각도 수준에서 mTBI에 민감한 이미징 바이오마커를 조사할 수 있습니다.

경미한 외상성 뇌손상(mTBI)은 주로 접촉 스포츠에 종사하는 운동선수, 퇴역 군인 및 교통 사고에 연루된 개인에서 관찰된다¹. 보고된 모든 두부 부상의 85% 이상을 차지합니다². mTBI의 광범위한 병인과 전 세계적으로 증가하는 발병률은 mTBI가 후기 발병 신경퇴행성 질환의 잠정적인 환경 위험 인자로 포함되어 있음을 강조합니다³. 단순하고 경증적인 TBI는 컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔에서 구조적 이상이 관찰되지 않고 글래스고 혼수 점수(GCS)가 13-15인 것이 특징입니다. 합병증이 없는 mTBI 환자가 경험하는 일반적인 증상으로는 두통, 현기증, 메스꺼움 또는 구토, 피로 등이 있습니다. 그러나 복잡하지 않은 mTBI에 따른 결과에 대한 종단적 평가는 환자의 높은 중도탈락률로 인해 상당한 어려움을 안겨준다⁴.

특히 NFL(National Football League) 프로 운동선수 커뮤니티 내에서 반복적인 mTBI에 대한 우려가 증가하면서 비프로 운동선수 사회의 인식이 높아졌다⁵. 뇌의 취약성은 초기 mTBI 이후 증가하는 것으로 추정되며, 이후의 모욕은 잠재적으로 부상 결과를 악화시킬 수 있습니다. 가장 큰 규모의 기증된 축구 선수 뇌 코호트의 최근 연구 결과에 따르면 만성 외상성 뇌병증(CTE)의 중증도에 대한 사전 축구 참여와 관련이 있을 뿐만 아니라 다양한 축구 관련 요인과 CTE⁶의 위험 및 중증도 사이의 상관관계를 시사했습니다. 따라서 뇌진탕 횟수와 반복적인 체제가 부상 결과에 미치는 영향에 대한 우려가 커지고 있습니다. 전임상 연구에서는 다양한 폐쇄두손상(CHI) 모델을 사용하여 반복적 mTBI 후 신경병리학적 변화, 신경염증성 연쇄반응 및 신경심리학적 손상을 조사했습니다 7,8,9,10,11,12,13,14 . 그러나 급성기에는 기능적 장애를, 만성기에는 뇌위축을 초래하는 스포츠와 관련된 반복성 뇌진탕성 두부 충격을 밀접하게 모방할 수 있는 복잡하지 않은 mTBI 모델에 대한 충격 매개변수에 대한 조사는 잘 검토되지 않았습니다.

물 분자의 확산을 평가하는 기술인 확산 텐서 이미징(DTI)은 mTBI의 영향을 조사하는 연구에 일반적으로 활용되어 왔습니다. DTI에서 파생된 주요 지표인 FA(Fractional Anisotropy)는 수분 확산 일관성의 정도를 정량화하고 축삭돌기 및 신경 섬유 다발의 구조적 조직에 관한 정보를 제공합니다. 백질(WM)에서 FA 값의 섭동은 다양한 모델 8,10,11,15,16,17에서 mTBI에 따라 제안되었습니다. 또한, 축삭 및 미엘린 무결성을 나타내는 축방향 확산도(AD)와 방사형 확산도(RD)는 전임상 연구에서 mTBI 이후 변화했습니다 10,15,16,18,19,20. 그러나 이전 연구와 DTI 소견의 불일치는 mTBI 중증도의 차이, 충격 매개변수의 차이, 다양한 mTBI 모델, 부상 후 추적 관찰 시점의 일관성 없는 차이에 기인할 가능성이 높다⁹.

따라서 현재 프로토콜 논문은 단일 및 반복 mTBI의 누적 효과를 평가하기 위해 고안된 mTBI의 동물 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. 우리는 동물 복지, 행동 결과, DTI 매개변수 및 피질 용적에 대한 평가를 포함한 포괄적이고 종단적인 평가를 통합하여 부상 후 역동적인 변화를 포착하고 다양한 충격 매개변수의 영향을 탐색했습니다. 이 모델은 급성 기능 장애와 장기적인 미세구조 변화를 모두 입증함으로써 이전 동물 연구에서 완전히 다루어지지 않았던 복잡하지 않은 mTBI의 주요 기능을 효과적으로 복제합니다. 여기에서는 수정된 폐쇄 헤드 중량 강하 방법 ^8,11을 사용하여 복잡하지 않은 mTBI 모델을 개발하고 mTBI에 따른 종단 평가를 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공했습니다.

이 연구는 동물 연구를 위한 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 동물 연구 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 동물 연구: 생체 내 실험 보고 지침(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments guidelines)의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 국립 양밍 키아오퉁 대학교(National Yang Ming Chiao Tung University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 20마리의 동물을 5개 그룹(그룹당 n = 4개)에 무작위로 할당했습니다: (i) 감각 운동 피질에서의 단일 충격(SMCx/단일), (ii) 1시간 간격의 SMCx에서 이중 충격(SMCx/2 hits/1 h), (iii) 10분 간격의 SMCx에서 이중 충격(SMCx/2 hits/10 min), (iv) 1-h 간격의 중앙 뇌에서 이중 충격(Central/2 hits/1 h), (v) 수술만 받았지만 머리에 직접적인 충격을 주지 않은 가짜 그룹, 종단적 결과 평가를 위한 그룹(그림 1). 주목할 점은 이 연구를 위해 선택된 부상 간 간격(1시간 대 10분 간격)은 접촉 스포츠에 참여하는 운동 선수가 경험하는 반복적인 뇌진탕 아래 충격 8,10,11,13,21을 모방하도록 설계되었습니다 ^22,23.

1. 폐쇄두손상(CHI)의 유도

참고: 10주에서 12주 사이이고 체중이 250g 이상인 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 12/12시간의 명암 주기로 보호되며 음식과 물에 대한 자유가 있습니다.

1. 쥐를 작은 유도 챔버에 넣고 이소플루란(5%)과 의료용 공기(2.5-3L/분)의 혼합물로 마취합니다. 쥐가 발이나 꼬리 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 챔버에서 쥐를 제거합니다.
2. 발열 패드에 쥐를 놓습니다.
   알림: 쥐의 체온을 유지하기 위해 수술 중 발열 패드를 켜십시오.
3. 쥐를 입체 프레임으로 가져오고 이빨 막대로 고정합니다. 수술 중 유지 관리를 위해 1.5-2L/min의 유속으로 의료용 공기와 연결된 노즈콘을 사용하여 2%로 이소플루란을 투여합니다.
4. 이어바를 배치합니다. 쥐가 입체성 프레임의 중앙에 있고 대칭인지 확인하십시오.
   참고: 모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행해야 합니다. 기구는 수술 전에 스팀 오토클레이브를 사용하여 멸균했으며, 시술 중 비드 멸균기로 팁을 추가로 멸균했습니다. 오염을 막기 위해, 그 동물에게 수술용 드레이프를 씌웠다. 외과 의사는 시술 중 머리카락을 가리기 위해 모자를 쓰고, 얼굴을 가리기 위해 마스크를 썼으며, 실험복과 수술용 장갑을 착용했다²⁴.
5. 맥박 산소 측정기의 센서를 동물의 뒷발에 착용하여 동물의 호흡수, 심박수, 혈중 산소 수치 및 체온을 모니터링합니다.
6. 체중 1mL/kg의 리도카인(20mg/mL)을 진통제로 쥐의 목에 피하주사합니다.
7. 동물의 머리에 제모 크림을 바르고 3분 동안 기다립니다. 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 크림을 닦아냅니다.
8. 요오드를 적신 멸균 면봉을 사용하여 면도한 부위를 여러 번 청소합니다. 70% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 요오드 잔여물을 제거합니다.
9. 멸균 수술 칼날을 사용하여 면도 한 피부에 약 2-2.5cm 길이의 정중선 절개를 만들어 두개골 표면에 접근합니다.
10. 화장솜을 사용하여 뼈의 조직을 제거하여 두개골을 드러냅니다. 0.9% 식염수에 적신 면봉을 사용하여 두개골 표면을 청소한 다음 마른 면봉으로 닦습니다.
    참고: 이제 두개골 봉합사와 브레그마 및 람다를 쉽게 식별할 수 있습니다.
11. 브레그마를 기준점으로 식별하여 좌표를 기반으로 충돌 영역을 추가로 찾습니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 CHI 유도를 위해 두 세트의 좌표가 사용됩니다: 감각 운동 피질(SMCx) 상단의 (-2.5,-2.0)(브레그마 뒤쪽 2.5mm)과 중추 뇌(중심) 상단의 (0,-3.0).
12. 두개골 표면에서 선택한 좌표를 확인하고 치과용 시멘트를 사용하여 지정된 영역에 원형 스테인리스 스틸 헬멧(직경 10mm 및 두께 1mm)을 접착합니다. 가열 패드와 맥박 산소 농도계를 제거합니다.
13. CHI 임팩터 아래의 리프트 테이블(길이 14cm, 너비 8cm, 깊이 6.15cm)에서 정위 장치와 쥐를 이동합니다.
14. 거품 스폰지 (길이 19cm, 너비 10cm, 깊이 4cm, 밀도 18kg / m³)를 사용하여 쥐의 몸을 들어 올립니다.
15. 입체 프레임의 이어바에서 쥐를 제거합니다. 콧방울과 연결된 치아 막대에 쥐를 가만히 두어 2% 이소플루란을 전달합니다. 머리와 몸이 꼬리 방향으로 수평을 이루는지 확인하십시오.
16. CHI 임팩터와 헬멧 사이에 공간이 없도록 리프트 테이블을 조정합니다. 충격 직전에 이소플루란 5초를 끕니다.
    참고: 뇌 손상으로 인한 우측 반사를 명시하기 위해, 이소플루란의 일시적 중단을 시행했다²⁵.
17. 600m 높이에서 1m 높이의 황동을 스테인리스 스틸 튜브(스테인리스 황동 추 기둥을 청소하기 위한 높이 1m, 내경 20mm)를 통해 금속 헬멧을 겨냥한 둥근 팁으로 고정된 임팩터로 떨어뜨립니다.
    참고: 가짜 그룹의 동물들은 충격을 경험하지 않았는데, 놋쇠 방울이 쥐의 머리에 있는 헬멧에 닿지 않고 풀렸기 때문이다.
18. 리프트 테이블을 내립니다. 입체성 프레임에서 쥐를 제거하고 쥐를 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다.
19. 동물이 누운 자세에서 엎드린 자세로 변화를 시도하는 시간인 오른쪽 반사 시간을 기록하십시오^26,27.
    참고: 반복적인 '키'를 투여한 동물들은 2^번째 충격이 가해지기 3분 전에 다시 마취되었다. 엎드린 자세로 되돌아가지 않은 SMCx/double/10분 그룹의 동물의 경우, 해당 교정 반사 시간은 420초로 기록되었습니다.
20. 우측 반사 기록 후 1.1단계를 사용하여 이소플루란으로 쥐를 다시 마취합니다.
21. 1.2단계를 사용하여 입체성 프레임으로 쥐를 고정시킵니다.
    알림: 스털 상단의 헬멧 안정성을 확인한 후 1.13-1.17단계를 다시 반복하여 2^차 임팩트를 수행합니다.
22. 헬멧을 제거합니다. 두개골 상단의 모든 결합 조직과 시멘트를 제거합니다.
23. 두개골을 치과용 시멘트로 덮고 말리십시오. 핀셋 백을 사용하여 치과용 시멘트가 뻣뻣하고 단단한지 확인하십시오.
    참고: 수술 후 두개골과 두피 사이의 두개골-공기 또는 두개골-혈액 계면으로 인한 감수성 아티팩트를 제거하기 위해 두개골 위에 치과용 시멘트를 도포했습니다.
24. 4-5개의 독립적인 매듭이 있는 4-0 나일론 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
    참고: 상처의 길이는 약 2-2.5cm입니다. 수술용 봉합사에 모세관 작용이 없고 실크 또는 나일론 소재로 만들어졌는지 확인하십시오. 동물의 긁힘에 의한 상처의 개방을 방지하기 위해 하나의 매듭을 사용하여 절개 부위를 봉합하지 마십시오.
25. 감염을 예방하기 위해 수술 부위에 국소 항생제(더마네스트 크림)를 바르십시오.
26. 체중 1mL/kg의 카프로펜(50mg/mL)을 수술 후 진통제로 목에 피하주사합니다.
27. 쥐가 의식을 회복할 때까지 깨끗한 케이지에 넣어 가열 패드에 올려 놓습니다. 쥐가 똑바로 앉으면 집 우리로 되돌려 놓습니다.
28. 물 200mL에 섞인 아세트아미노펜 5mL(24mg/mL)를 수술 후 3일 연속 진통제로 매일 동물에게 경구 투여합니다.

2. 자기공명영상(MRI)

참고: T2 가중 이미지 및 확산 텐서 이미징은 CHI 전과 부상 후 1일 및 50일 동안 순차적 PET/MR 7T 시스템을 사용하여 수행됩니다(그림 1). 기준선 MRI는 CHI 시술 전 1주일 이내에 수행되었습니다. CHI 후 1일 및 50일 평가의 경우 오전에 행동 평가를 실시한 후 같은 날 오후에 MRI 스캔을 실시했습니다.

1. 이소플루란(5%)과 의료용 공기(2.5-3L/min)의 혼합물로 채워진 작은 유도 챔버에서 쥐를 마취합니다.
2. 쥐가 발이나 꼬리를 꼬집어도 반응이 없으면, 머리를 먼저 엎드린 자세로 동물 요람으로 옮길 때 마취를 일시적으로 중단한다.
3. 콧방울과 연결된 헤드 홀더에 쥐를 배치하고 이미지 획득 중 유지 관리를 위해 1.5-2L/min의 유속으로 의료용 공기와 함께 2% 이소플루란을 전달합니다.
4. 스캔하는 동안 움직이지 않도록 작은 테이프 조각으로 머리를 고정하십시오.
   참고: 두피 제거로 인한 자기 감수성 아티팩트를 방지하기 위해 CHI 후 첫날에 쥐의 머리에 치약을 바르십시오^28,29.
5. 쥐의 흉부 아래에 압력 패드를 놓고 호흡을 모니터링합니다. 산소 농도계 클립을 뒷다리에 테이프로 붙여서 심박수를 모니터링합니다.
6. 직장 프로브를 삽입하여 직장 온도를 측정합니다. 실험 중에는 체온을 유지하기 위해 순환하는 따뜻한 물과 티슈 랩으로 쥐를 난방 담요로 덮습니다.
   알림: 실험 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수 및 직장 온도를 포함한 생리적 상태를 모니터링합니다. 스캔하기 전에 쥐의 모든 생리적 신호를 확인하여 활력 징후 모니터의 품질을 확인하십시오.
7. PET/MR 스캐너의 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 정확한 정렬을 위해 헤드 중앙을 표시합니다.
8. 머리 중심이 스캐너의 등반 중심과 정렬될 때까지 전동 동물 운송 시스템을 사용하여 동물을 MRI 구멍으로 자동으로 이동합니다.
   참고: PET/MR 시스템에 통합된 전동 동물 운송 시스템은 정확한 동물 위치를 보장하고 이미징 양식 간 전환 시 워크플로를 간소화합니다.
9. MRI 염기서열을 얻습니다.
   1. 초기 현지화 및 전체 조정을 수행합니다.
   2. 중간 시상 슬라이스를 사용하고 앞쪽에서 8^{번째 슬라이스를} 앞쪽 시상면의 진압에 맞춥니다.
      참고: 관상동맥 절편은 전방 커미슈어와 소뇌 기저부를 연결하는 선에 의해 정의된 수평면에 수직으로 위치하며, 말뭉치의 장축에 대해 약 15° 각도에 해당합니다. 중간 시상 절편에 대한 T2-RARE 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: 반복 시간(TR) = 2500ms, 에코 시간(TE) = 44ms, 시야(FOV) = 3.5cm, 매트릭스 크기 = 256 256, 절편 두께 = 1mm, 절편 수 = 1, 희귀 계수 = 8, 대역폭 = 75kHz, 평균 수 = 1, 획득 시간 = 1분 20초.
   3. 지방 억제 및 뇌 아래의 포화 밴드와 함께 RARE(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement)를 사용하여 해부학적 참조를 위한 T2 가중치 이미지를 얻습니다(그림 2).
      참고: T2-RARE 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: 반복 시간(TR) = 3600ms, 에코 시간(TE) = 40ms, 시야(FOV) = 2cm, 매트릭스 크기 = 256 256, 슬라이스 두께 = 1mm, 슬라이스 수 = 16, 희귀 계수 = 8, 대역폭 = 75kHz, 평균 수 = 8, 획득 시간 = 7분 40초.
   4. 4-샷 스핀 에코 EPI를 사용하여 확산 텐서 이미지를 획득합니다(그림 2).
      참고: DTI 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: TR = 3000ms, TE = 28ms, 시야(FOV) = 2cm, 매트릭스 크기 = 96 96, 두께 = 1mm, 슬라이스 수 = 16, 펄스 지속 시간(δ) = 5ms, 두 펄스 사이의 시간(Δ) = 15ms, B0 수 = 5, 방향 수 = 30, b-값 = 1000 s/mm³, 대역폭 = 150kHz, 평균 수 = 4, 획득 시간 = 14분.
   5. 스캔 프로토콜을 마칩니다. 자석에서 동물 요람을 밀어냅니다. 요람에서 동물을 꺼냅니다.
   6. 쥐의 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지로 쥐를 옮깁니다. 쥐가 의식을 되찾으면 집 우리로 되돌려 놓습니다.
10. 이미지 전처리
    참고: 데이터 처리 및 분석을 위해 MRtrix3, SPM(Statistical Parametric Mapping) 소프트웨어 및 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용할 수 있습니다.
    1. MRtrix3 명령(dwidenoise)³⁰을 사용하여 DTI 이미지의 노이즈를 제거합니다.
    2. MRtrix 명령(mrdegibbs)³⁰을 사용하여 DTI 이미지에서 Gibb의 링잉 아티팩트를 제거합니다.
    3. SPM 기능(spm_coreg.m 및 spm_powell.m)을 사용하여 세로 스캔에서 단일 피사체의 T2 가중치 이미지에 DTI 이미지를 공동 등록합니다.
    4. 뇌 영역을 슬라이스별로 수동으로 윤곽을 그리는 방식으로 T2 가중치 영상에서 두개골 박리를 수행한 다음, Otsu의 방법³¹ (사용자 지정 MATLAB 스크립트 thr_otsu2.m)에 의해 결정된 계산된 임계값 미만의 강도를 가진 픽셀을 제거합니다.
    5. SPM 함수(spm_coreg.m 및 spm_powell.m)를 사용하여 동일한 실험 그룹의 동물 간에 교차 피험자 공동 정합을 수행합니다. 해당 DTI 영상에 브레인 마스크를 적용합니다.
       참고: 두개골 스트리핑은 컴퓨터 처리 시간을 줄이기 위해 수행됩니다.
    6. DTI(사용자 지정 MATLAB 스크립트, tensormap.m)를 기반으로 텐서 맵을 계산합니다.
    7. FA 맵 계산(사용자 정의 MATLAB 스크립트, calFA.m)
       참고: 모든 사용자 정의 MATLAB 스크립트는 다음 데이터베이스(https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.57770/9ZESXD)를 통해 사용할 수 있습니다.
11. 이미지 분석-FA
    1. CHI 좌표 아래에 있는 세 개의 연속된 이미지 조각에 대해 피질과 말뭉치 callosum(CC)에 관심 영역(ROI)을 그립니다.
       참고: 모든 ROI는 수동으로 작성되었으며 실험 그룹에 대해 맹검된 2명의 숙련된 조사관이 전체 오류를 육안으로 검사했습니다.
    2. ROI에서 FA 값을 추출하고 평균을 구합니다.
       참고: 피질 아래의 말뭉치(corpus callosum)의 경우, FA < 0.35 값을 가진 픽셀은 부분 부피 효과를 제거하기 위해 선택한 ROI에서 제외되었습니다. 피질의 경우, ROI에서 FA < 0.35 값을 가진 모든 픽셀이 분석을 위해 모집되었습니다.
12. 이미지 분석-볼륨
    1. Bregma -7에서 +3mm까지 11개의 연속 이미지 슬라이스에 대해 피질 영역을 포함하는 ROI를 수동으로 그립니다.
       참고: 모든 ROI는 실험 그룹에 맹검된 2명의 숙련된 조사관이 수동으로 도출했습니다.
    2. 슬라이스에 걸친 ROI의 총 픽셀을 합산하고 슬라이스 두께(1mm)를 곱하여 볼륨으로 변환합니다.
    3. CHI 이후의 피질 부피를 각 동물의 CHI 이전의 해당 부피로 정규화합니다.
       참고: 발표 전에 동물 간의 뇌 용적의 개인차를 제거하기 위해 데이터를 정규화합니다.

3. 행동 평가

참고: 행동 실험은 CHI 전과 CHI 후 1일 및 50일 전에 빔 워크 밸런스 테스트와 mNSS를 사용하여 수행됩니다(그림 1). 모든 평가는 수집된 데이터의 정확성, 일관성 및 객관성을 보장하기 위해 최소 2명의 관찰자에 의해 수행되었습니다.

1. 빔 워크 밸런스 테스트
   1. 비디오 카메라를 켜고 타이머를 시작합니다.
   2. 밸런스 빔의 한쪽 끝(깊이 3cm, 너비 3cm, 길이 80cm, 바닥 위 60cm)에 쥐를 놓습니다.
   3. 쥐가 한 번의 왕복 여행을 완료하거나 넘어지거나 3분 이상 멈추면 타이머를 중지합니다.
      1. 실험하는 동안 mNSS 11,32,33,34를 사용하여 평가를 위해 동물의 상태를 관찰합니다. 평가를 위해 다음 표준을 따르십시오.
      2. 쥐가 빔에서 안정된 자세로 균형을 유지하면 0점을 할당합니다.
      3. 쥐가 빔의 측면을 잡으면 1점을 할당합니다.
      4. 쥐가 한쪽 팔다리를 들보에서 떨어뜨리면 2점을 할당합니다.
      5. 쥐가 두 팔다리를 떼고 넘어지거나 빔에서 회전하면(>60초) 3점을 할당합니다.
      6. 쥐가 빔에서 균형을 잡으려고 시도했지만 떨어지면(>40초) 4점을 부여합니다.
      7. 쥐가 빔에서 균형을 잡으려고 시도했지만 떨어지면(>20초) 5점을 부여합니다.
      8. 쥐가 균형을 잡으려고 시도하지 않거나 빔에 매달리지 않고 20초 이내에 떨어지면 6점을 할당합니다.
      9. 쥐가 작업을 완료하지 못하면 최대 3분의 시간이 소요된 것으로 간주하고 6점을 할당합니다.
   4. 특정 시점에 테스트 날짜를 예약합니다.
      참고: CHI 전에 두 번의 시험에서 빔 워크 왕복 여행을 완료하지 않은 쥐는 후속 수술 및 후속 행동 평가에서 제외합니다.
2. 수정된 신경학적 중증도 점수(mNSS)
   참고: mNSS 평가에는 운동 검사, 감각 검사, 반사 부재, 비정상적인 움직임, 빔 균형 및 바닥에서 걷기 ^32,33이 포함되며, 이는 매일 신속하게 수행되었습니다.
   1. 모터 테스트를 수행합니다.
      1. 쥐의 꼬리 밑부분을 들어 올리고 약 15초 동안 팔다리의 반사 신경을 관찰하여 적절한 굴곡과 신전을 평가합니다.
      2. 앞다리에서 정상적인 굴곡이 관찰되면 0점을 부여합니다. 굴곡이 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      3. 뒷다리에서 정상적인 굴곡이 관찰되면 0점을 부여합니다. 굴곡이 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      4. 꼬리로 쥐를 들어 올린 후 30초 이내에 머리가 수직 축으로 >10° 이동하면 점수를 0으로 할당합니다. 그렇지 않은 경우 1점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   2. 팔다리 배치 테스트를 수행합니다.
      참고: 배치 테스트는 감각(시각, 촉각 및 고유 감각)과 운동 기능 간의 조정을 평가하기 위해 수행됩니다.
      1. 쥐를 테이블 표면쪽으로 천천히 내립니다. 쥐의 발이 표면에 닿아 뻗어 있는지 관찰하십시오.
      2. 쥐가 양쪽 팔다리를 앞으로 뻗고 표면에 도달한 경우 점수를 0으로 할당합니다. 지연이 있거나 응답이 없는 경우 점수 1을 할당합니다.
      3. 쥐를 표면에 놓고 앞발을 테이블 가장자리로 당깁니다. 발이 테이블 표면의 정상 위치로 돌아가는지 관찰합니다.
      4. 즉각적이고 정상적인 배치 응답이 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 지연된 배치 응답이 관찰되면 1점을 할당합니다. 응답이 없으면 2점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   3. 부재 및 비정상적인 움직임을 반영하는 것을 관찰하십시오.
      1. 면봉의 솜 끝으로 청각 고기를 만질 때 귓바퀴 반사를 평가하기 위해 머리를 흔드는 것을 관찰합니다.
      2. 정상적인 반사가 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 반사가 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      3. 면봉의 솜 끝으로 각막을 만져 각막 반사의 존재를 평가합니다.
      4. 정상적인 응답이 도출되면 점수를 0으로 할당합니다. 눈 깜빡임 반응이 이끌어지지 않으면 점수 1을 할당합니다.
      5. 짧고 강한 손뼉을 칩니다. 놀람 반사의 존재를 관찰하십시오.
      6. 반사가 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 반사가 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      7. 쥐가 발작, 근긴장성 또는 근긴장돌증이 있는지 관찰합니다.
      8. 그 중 하나라도 발생하면 1점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 4점의 점수가 할당됩니다.
   4. 앞서 설명한 대로 빔 밸런스 테스트를 수행합니다(3.1단계).
      참고: 이 테스트 세션에서는 최대 6점의 점수가 할당됩니다.
   5. 바닥 위에서 걷기 테스트를 수행합니다.
      1. 오픈 필드 아레나(길이 75cm, 너비 50cm, 깊이 40cm)를 준비합니다. 깨끗하고 이전의 냄새 신호가 없는지 확인하십시오.
      2. 탁 트인 경기장 중앙에 쥐를 놓고 쥐가 경기장에서 어떻게 걷는지 관찰합니다.
      3. 쥐가 규칙적인 산책을 하면 점수를 0으로 할당하십시오.
      4. 쥐가 똑바로 걸을 수 없으면 1점을 할당합니다.
      5. 쥐를 바닥에 눕힌 후 마비 쪽으로 떨어지면 3점을 부여하십시오.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   6. 모든 점수를 합산하십시오. 가능한 최대 점수는 18입니다.
      참고: 점수가 높을수록 결과가 더 나쁘다는 것을 나타냅니다.

4. 면역조직학

1. 경심 관류^{수행 35}.
   참고: 경심 관류는 CHI 후 50일 후에 MRI 스캔 후에 수행됩니다(그림 1).
   1. 쥐를 작은 유도실에 넣고 발이나 꼬리 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 이소플루란(5%)으로 마취합니다.
   2. 체중 50mg/kg의 졸레틸(50mg/mL)과 체중 10mg/kg의 자일라진(Roumpun, 23.32mg/mL)을 복강내 주사를 통해 심부 마취를 위해 투여합니다.
   3. 쥐를 누운 자세로 놓습니다.
   4. 가위를 사용하여 흉부 아래 약 4-5cm 길이의 가로 절개를 만듭니다.
   5. 횡격막을 찾아 절단하여 심장이 드러나도록 합니다.
   6. 지혈 겸자를 사용하여 폐동맥을 고정한 다음 우심방을 약 0.5-1cm 길이로 절개합니다.
   7. 주입 펌프에 부착된 파이프라인에 바늘을 연결합니다.
   8. 좌심실에 바늘을 삽입합니다.
   9. 혈액이 맑아질 때까지 0.9% 식염수 500mL로 경심장 관류(40mL/분)를 통해 동물을 헹굽니다.
   10. 고정을 위해 500mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)와 함께 경심 관류(40mL/분)를 통해 동물을 관류합니다.
   11. 쥐의 머리를 제거하고 두개골에서 뇌 조직을 조심스럽게 벗겨냅니다.
   12. 고정 후 48시간 동안 병에 담긴 약 20mL의 4% PFA로 뇌를 보존합니다.
2. 조직 처리 및 IHC 염색^{수행 36,37}.
   참고: immunoperoxidase secondary detection system kit를 사용하여 포르말린이 고정되고 파라핀이 포함된 조직 절편에 대해 면역조직화학적 염색을 수행합니다.
   1. 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직 절편을 사용하십시오.
   2. 탈파라핀화를 수행하고 슬라이드를 3%_H2O2로 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다. 90°C에서 구연산염 완충액을 사용하여 항원 회수를 수행합니다.
   3. immunoperoxidase secondary detection system kit를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행합니다.
      참고: 염색 절차는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행됩니다.
   4. 헤마톡실린을 사용하여 표본을 반대 염색합니다.
   5. 퇴색 방지 시약으로 표본을 장착합니다.
   6. 면역조직화학 염색을 위해 항신경교섬유산단백질(GFAP) 항체를 사용합니다.
   7. 광학 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여 ROI 이미지를 획득합니다(그림 6).

5. 행동 및 이미지 결과의 통계적 분석

참고: 본 연구에서는 통계 분석이 SPSS에서 수행되었습니다. 그러나 통계 분석은 다른 통계 도구 상자에서 수행할 수 있습니다.

1. SPSS *.sav 파일에서 와이드 형식의 데이터를 로드합니다.
2. 그룹 간에 시간 경과에 따른 행동(정규화된 가중치, mNSS 및 빔 보행 시간)과 이미지 결과(피질 및 CC의 FA 값)를 비교하기 위해 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 수행합니다.
   1. 반복 측도를 > 일반 선형 모형> 분석을 클릭합니다.
   2. Within-Subject Factor Name 상자에 이름(예: 시간)을 할당하고 Number of Levels 상자(후속 조치 시점이 다른 3개 수준)에 '3'을 입력합니다. 반복된 측정 정의 요인(Repeated Measures Define Factor(s)) 대화 상자의 측정 이름(Measure Name) 상자에 이름(예: mNSS)을 지정합니다.
   3. 검정해야 하는 개체내 변수 (CHI 이전, D1 및 D50 이후에 획득한 데이터)를 로드하고 반복 측정 대화 상자에서 개체-간 요인(예: 영향 모수가 다른 동물 그룹)을 지정합니다.
   4. 관측된 평균에 대한 사후 다중 비교 대화 상자에서 요인(예: 동물 그룹)에 대한 사후 검정으로 Bonferroni를 선택합니다.
      참고: 다중 비교를 수정하기 위해 시간 경과에 따른 비교에 대해 Bonferroni 보정(0.05/3)을 사용하여 유형 I 오류를 조정했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05(SPSS 조정)로 정의되었습니다.
3. 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 분석을 수행하여 그룹 간의 우측 반사(righting reflex)와 대뇌피질 용적(cortical volume)의 변화를 비교합니다.
   1. 분석을 클릭하여 평균> 일원 분산 분석> 비교합니다.
   2. 변수(우측 반사 및 피질 용적의 변화)를 Dependent List에 불러오고 그룹을 One-Way ANOVA 대화 상자에서 Factor로 불러옵니다.
   3. One-Way ANOVA: Post Hoc Multiple Comparisons 대화 상자에서 Bonferroni를 사후 검정으로 선택합니다.
      참고: 다중 비교를 수정하기 위해 그룹 간 비교에 대해 Bonferroni 보정(0.05/5)을 사용하여 유형 I 오류를 조정했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05(SPSS 조정)로 정의되었습니다.

그림 2는 SMCx에서 가짜 및 반복적 CHI를 가진 대표 동물의 종방향 MRI를 보여줍니다. CHI 후 1일 및 50일 동안 T2 가중치 이미지에서 심각한 두개골 골절이나 뇌 타박상이 발견되지 않았습니다. CHI 후 1일과 50일 동안 FA 맵에서 WM의 심각한 부종이나 변형이 발견되지 않았습니다. 이 연구에서 CHI를 투여받은 모든 동물은 50일의 전체 실험 기간 동안 생존하여 CHI 모델의 낮은 폐사율(0-5%)⁷ 을 보여주었습니다.

뇌 손상 직후의 의식 손상 정도는 동물의 위치를 스스로 교정하려는 타고난 성향인 바로잡기 반사(righting reflex)의 상실에 의해 평가되었다. SMCx의 가짜 및 단일 CHI와 비교했을 때, 동물에서 반복적인 CHI 후 우측 반사를 회복하는 데 걸리는 시간이 증가했습니다(그림 3A). CHI를 따른 동물의 전반적인 웰빙은 정상화된 체중과 mNSS의 변화에 의해 반영되었습니다. 그룹 간에 CHI 후 유의미한 체중 감소는 관찰되지 않았습니다(그림 3B). 단일 CHI 후 50일째에 더 높은 mNSS 점수가 발견되었지만, 반복적인 CHI 후 1일째에 mNSS 점수의 유의한 증가가 관찰되었으며 심각도 및 영향 부위에 관계없이 50일째까지 높은 상태를 유지했습니다(그림 3C). 중추 뇌에서 반복적인 CHI에 의해 유도된 mNSS 상승은 50일째에 감소했으며, 이는 SMCx의 해당 CHI보다 현저히 낮았습니다. CHI 후 쥐의 균형 및 조정 운동 기능은 빔 워크 테스트로 평가되었습니다. 반복적인 CHI 후 1일차에 빔 보행 지속 시간의 유의한 증가가 관찰되었으며 심각도 및 충격 부위에 관계없이 50일까지 높게 유지되었습니다(그림 3D). 중추 뇌에서 반복적인 CHI에 의해 유도된 길쭉한 빔 보행 시간은 50일째에 감소했으며, 이는 SMCx에서 해당 CHI보다 현저히 짧았습니다.

대뇌피질 부피의 현저한 감소는 CHI 후 50일 동안 관찰되었습니다(그림 4A). 50일째의 대뇌피질 용적은 각각 기준선 용적에서 99.63%± 2.15%, 95.98%± 1.65%, 92.26%± 2.22%, 90.28%± 1.17%였으며, SMCx에서 1시간 및 10분 간격으로 단일 및 반복 CHI 후에 각각 측정되었습니다(그림 4B). 50일째의 대뇌피질 용적은 중추 뇌에서 1시간 간격으로 반복적인 CHI 투여 후 기준선 부피의 91.54%± 1.98%였다. 가짜 그룹과 비교하여, CHI 후 유의한 대뇌피질 손실이 관찰되었다. 단일 CHI 그룹과 비교하여, 반복적인 CHI 후에 유의한 대뇌피질 손실이 관찰되었다. 1시간 및 10분 간격으로 반복적인 CHI 후 Bregma -4에서 +0 및 Bregma -5에서 +1까지의 절편에서 대뇌피질 부피의 상당한 감소가 관찰되었다. 각각(그림 4C). 서로 다른 충격 부위를 가진 CHI 동물들 사이와 비교했을 때, 현저히 더 작은 피질 부피는 중추 뇌에서 CHI 후 Bregma 0의 절편에서만 발견되었습니다. 이전¹¹ 개 및 현재 연구에서 상당한 대뇌피질 위축이 보고되었지만, 정확한 체적 분석을 위해서는 3D로 이상적으로 획득된 높은 공간 해상도의 T2 가중치 이미지가 제안됩니다. 또한, 아틀라스 기반 회절 정합 접근법³⁸ 을 적용하는 향후 연구는 경미한 뇌 손상과 관련된 국소 뇌 변화를 더 잘 다룰 수 있습니다.

종방향 MRI 스캔 중 피질 FA 값은 CHI 후 잠정적인 미세 구조 변화를 나타내기 위해 계산되었습니다. SMCx에서 단일 CHI 후 충돌 부위 아래에서 중요한 FA 변화가 관찰되지 않았습니다. SMCx에서 반복적인 CHI 후, 기준선과 비교하여 50일째에 피질에서 동병변 피질 FA의 유의한 증가가 관찰되었고, 1시간 간격으로 반복 CHI 1일 후에 관찰되었습니다(그림 5A). 또한, 동측 병변 피질의 FA가 유의하게 감소한 것은 반복 CHI 1일 후 10분 간격에서 나타났으며, 이는 1시간 간격의 단일 및 반복 CHI 후보다 현저히 낮았습니다. SMCx에서의 CHI는 중추 뇌의 피질에서 FA에 유의한 변화를 유도하지 않았습니다(그림 5B). 중추 뇌에서 반복적인 CHI 후, 기준선 및 1일째에 비해 50일째에 중추 뇌 아래의 피질 FA가 크게 증가하는 것이 관찰되었습니다(그림 5B).

SMCx에서 단일 CHI 후, 동측 병변 SMCx 아래의 CC에서 FA의 유의미한 변화는 관찰되지 않았습니다(그림 5A). SMCx에서 반복적인 CHI 후, 기준선과 비교하여 50일째에 피질에서 CC의 동측 병변 FA의 현저한 감소가 관찰되었고, 1시간 간격으로 반복 CHI 1일 후에 관찰되었습니다(그림 5A). 1일째에 동병변 CC에서 FA가 감소한 후 50일째에 회복되는 것이 10분 간격으로 반복 CHI 후 관찰되었습니다. 동정심 병변 CC에서, 10분 간격의 반복적인 CHI 후, 1-h 간격의 반복적 CHI에 비해 1일차에 유의하게 낮은 FA 값이 나타났다. 50일째에 유의하게 높은 FA 값이 1시간 간격의 가짜, 단일 및 반복 CHI에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 중추 뇌에서 반복적인 CHI 후, 동측 병변 SMCx 아래의 CC에서 FA의 유의한 증가가 SMCx의 CHI와 비교하여 1일째, 가짜 그룹과 비교하여 50일째에 관찰되었습니다(그림 5A).

CHI 후 신경염증은 손상 후 50일째에 GFAP의 발현으로 평가되었습니다. 면역염색 결과는 중증도와 영향 부위에 관계없이 CHI 후 입실레셔널 SMCx에 성상세포가 축적되는 것을 보여주었습니다(그림 6).

그림 1: 실험 설계의 개략도. 폐쇄성 두부 부상의 유도 및 각 평가에 대한 해당 일정을 포함한 주요 단계를 보여주는 개략도. CHI 전 MRI 스캔 및 행동 평가는 수술 전 7일 이내에 수행되었습니다. 바른 반사를 회복하는 시간은 의식 손상의 정도에 따라 평가되었다. 종단 MRI 및 행동 데이터는 CHI 후 1일 및 50일에 수집되었습니다. 모든 실험이 완료되면 쥐를 희생한 후 면역조직학을 수행했습니다. 약어 : SMCx / 단일 = 감각 운동 피질에서 단일 충격; SMCx/2 hits/1 h = 1-h 간격으로 SMCx에서 이중 충격; SMCx/2 hits/10 min = 10분 간격으로 SMCx에서 이중 충격; 중추/2안타/1시간 = 1시간 간격으로 중추 뇌에 이중 충격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: CHI에 따른 대표 MR 이미지. 대표 동물의 T2 가중치 이미지(위 행)와 FA 맵(아래 행)은 10분 간격으로 SMCx에서 가짜 및 이중 CHI 및 이중 CHI 전후 1일차와 50일차 전과 50일차에 있습니다. CHI 실험 후 T2 가중 영상에서 국소 타박상이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다양한 충격 매개변수를 사용한 CHI 후 행동 결핍. (A) 마지막 충격 후 우측 반사를 회복하는 시간. SMCx에서 반복적인 CHI 후 righting 반사 시간이 증가했습니다. (B) 그룹 간에 CHI 후 정규화된 체중(CHI 이전 기준선으로 정규화됨)에 유의한 차이가 없습니다. 반복적인 CHI 후 (C) mNSS 및 (D) 빔 보행 지속 시간의 증가가 관찰되었습니다. SMCx에서 CHI 후 mNSS와 빔 보행 지속 시간이 높게 유지되었지만, 50일째에 중추 뇌에서 CHI 후 회복되었습니다. Righting Reflex(오른쪽 반사 시간에 대한 Bonferroni 사후 테스트)를 사용한 One-way ANOVA(편도 분산분석); 정규화된 가중치, mNSS 및 빔 깨우기 기간에 대한 Bonferroni 사후 테스트를 사용한 반복 분산분석: *, p < .017 시점 사이; +, p < .05 대 가짜; #, p < .05 대 SMCx/single; §, p < .05 vs. SMCx/2 hits/1 h. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: CHI 후 50일 동안 다양한 충격 매개변수를 사용한 피질 위축. (A) 중간 시상 이미지의 절편 정렬. 파란색 선은 전방 commissure와 소뇌 기저부를 연결하는 수평면을 나타냅니다. 점선 선은 말뭉치 callosum의 긴 축을 보여줍니다. (B) 피질 부피 측정을 위한 대표 이미지 슬라이스의 T2 가중치 이미지에 오버레이된 예시적인 피질 ROI(빨간색). (C) CHI 후 피질 부피의 변화는 Bregma -7에서 +3mm까지 서로 다른 슬라이스 간의 기준선 부피의 백분율로 표시되었습니다. CHI 후 50일 동안 대뇌피질 부피의 감소가 입증되었으며 영향 매개변수에 따라 다릅니다. 데이터는 std± 수단으로 표현됩니다. Bonferroni 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석: +, p < .05 vs. 가짜; #, p < .05 대 SMCx/single; §, p < .05 vs. SMCx/2 hits/1 h. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 다양한 임팩트 파라미터에 따른 CHI 후 FA의 종적 변화. 자동으로 세분화된 ROI는 (A) SMCx 및 (B) 중앙 뇌의 충격 부위까지 깊은 피질(녹색) 및 CC(corpus callosum)(빨간색)입니다. 삽입은 충격 부위 아래에 슬라이스가 있는 3D 뇌 이미지를 보여줍니다. CHI 1일 전후 및 50일 전에 획득한 FA 값에 대한 종단 추적 조사는 평균 ± 표준으로 제시되었습니다. 반복된 CHI 후 FA의 변화는 두드러졌으며 영향 매개변수에 따라 달랐습니다. Bonferroni 사후 검정을 사용한 반복 분산분석: *, p < .05 시점 사이; +, p < .05 대 가짜; #, p < .05 대 SMCx/single; §, p < .05 vs. SMCx/2 hits/1 h. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 충돌 부위 아래 피질에서 손상 후 50일 동안 CHI로 인한 신경염증. GFAP 염색이 있는 충격 부위 아래의 대뇌 피질의 대표 이미지. 피질에서 성상세포(화살표)의 축적은 CHI 후에 관찰되었습니다. 스케일 바 = 40 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 연구는 단순 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)의 동물 모델을 구축하여 단일 및 반복 손상의 누적 효과와 다양한 뇌 영역에 대한 충격의 결과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 폐쇄 머리 체중 감소 부상 패러다임에서 채택된 폐쇄 머리 부상(CHI) 모델은 운동선수와 헬멧 보호 장비를 착용한 개인이 일반적으로 경험하는 뇌진탕을 모방하도록 설계되었습니다. 이 모델은 국소 뇌 손상을 최소화하는 동시에 충돌 횟수, 부상 간 간격 및 충격 영역을 포함한 주요 충격 매개변수를 정밀하게 조작할 수 있습니다. 여기서의 연구 결과는 이러한 매개변수가 행동 결과와 분수 이방성(FA) 값의 진행에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 특히, 만성 외상성 뇌병증(CTE)의 특징인 상당한 피질 위축이 충격 부하나 위치에 관계없이 만성 단계에서 관찰되었습니다. 이 실험 모델은 복잡하지 않은 mTBI에 따른 기능 및 미세 구조 변화에 대한 종단 연구를 위한 강력한 프레임워크를 제공하여 이전 동물 모델의 격차를 해결합니다.

접촉 스포츠나 오토바이 사고와 같은 임상 시나리오에서 관찰된 mTBI를 재현하기 위해 다양한 설치류 헬멧 디자인이 다양한 동물 모델에 구현되었습니다⁷. 닫힌 두개골이나 머리에 가해지는 충격은 일반적으로 노출된 뇌 표면을 표적으로 하는 손상에 비해 더 경미하고 더 확산된 뇌 손상을 초래합니다^15,39. 그럼에도 불구하고, 부착된 헬멧을 사용할 때 동물들 사이에서 결과의 큰 차이가 관찰되었음이 인정되었는데, 이는 주로 충돌 부위 위치⁴⁰의 불일치에 기인한다. 이 연구의 CHI 모델은 Marmarou의 체중 감소 모델에서 수정되었으며, 여기서 금속 디스크는 두개골⁴¹ 위에 배치되었습니다. 우리는 두개골 골절의 위험을 완화하기 위해 더 얇은 디스크(1mm)를 사용하고 고정 임팩터 팁을 통합하여 원래 방법론을 더욱 개선했습니다. 이전의 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 결과는 CHI¹¹ 이후 눈에 띄는 미세 골절이 없음을 확증했습니다. 시멘트가 발라진 디스크를 향하는 고정 충격 팁을 사용하는 또 다른 이점은 충격 부위를 정밀하게 제어할 수 있어 충격 부위가 실험 결과에 미치는 영향을 체계적으로 조사할 수 있다는 것입니다. 주목할 점은 현재 모델에서 두피 절개 및 마취는 특히 급성기에서 추가적인 면역 및 염증 반응을 유발할 수 있다는 것입니다. 깨어 있고 두피가 손상되지 않은 동물을 사용하면 이러한 영향을 완화하고 뇌진탕 하 뇌 손상의 임상 사례에 대한 번역성을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다¹⁰.

행동 및 이미지 결과에 대한 CHI의 누적 효과는 가짜 또는 단일 부상 그룹에 비해 rCHI 후 동물에서 현저히 높은 mNSS 점수, 빔 보행 작업 완료 시간 연장(그림 3), 더 작은 피질 부피(그림 4B) 및 FA 값의 변화(그림 5A)에 의해 입증되었습니다. 더욱이, 부상 후 1일차에 피질과 CC의 FA 수치가 현저히 낮고(그림 5A), 50일차에 대뇌피질 부피가 감소(그림 4B)는 1시간 간격으로 반복적인 CHI를 받은 동물에서 1시간 간격의 동물에 비해 더 나쁜 결과를 시사하는 것으로 나타났다. 1시간 간격으로 반복적인 손상을 입었을 때, SMCx에 충격을 받은 동물은 중추 뇌에 가해진 충격에 비해 더 높은 mNSS 점수(그림 3C)와 더 긴 빔 보행 시간(그림 3D)을 보였는데, 이는 CHI 결과가 충격 부위에 따라 달라진다는 것을 나타냅니다. FA의 변경과 더불어, WM^10,11,19의 AD의 감소와 GM 10,16,18의 RD의 증가가 CHI의 이후 제안되었다. DTI 매개변수의 전체 스펙트럼에 대한 포괄적인 분석을 통합한 향후 연구는 다양한 영향 매개변수가 CHI의 진행과 결과에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있습니다.제안된 모델은 청소년기 쥐와 생쥐에도 적용될 수 있습니다. 그러나 낙하물의 높이와 무게, 헬멧 치수를 포함한 추가 조정은 사전에 조사와 검증을 필요로 합니다.

오른손 반사(Righting Reflex)는 방향을 바꾸고 자발적으로 일어설 수 있는 능력을 특징으로 하는 타고난 동물 행동으로, 인간의 의식 상실(LOC)을 평가하기 위한 대리 지표 역할을 합니다⁴². CHI 유도 후 오른쪽 반사를 회복하는 데 걸리는 시간을 문서화하려면 CHI 유도 중 주사 가능한 마취제 대신 흡입 마취제를 사용해야 합니다. 더욱이, CHI 직전에 이소플루란을 일시적으로 중단하는 것이 필요하다²⁵. TBI 후 체중 변화를 모니터링하여 전반적인 장애를 나타내는 것이 좋다⁴³. CHI 후 정규화된 체중의 유의미한 변화가 없다는 것은 여기에 설명된 모델에서 뇌 손상의 경미함을 나타냅니다. 변형된 NSS와 빔 보행 시간은 뇌 손상 후 일반적인 웰빙과 전정 운동 기능을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다⁴⁴. 행동 평가와 MRI 실험이 CHI 접종 후 같은 날에 수행되었다는 점을 감안할 때, 측정된 행동 결과에 대한 마취의 간섭을 방지하기 위해 모든 후속 평가를 위해 MRI 스캔 전에 행동 테스트를 수행했습니다(그림 1). 또한, 운동 협응력이 좋지 않아 mNSS 점수도 증가할 가능성이 있는 동물은 pre-CHI 테스트를 기반으로 제외해야 합니다. 이전 연구와 일치하는 본 연구의 결과에서는 반복적인 CHI¹¹ 후 mNSS 점수가 유의하게 높았고 빔 보행 시간이 길어졌다. 또한, mNSS 점수와 빔 보행 시간은 특히 부상 후 50일째에 CHI의 충격 부위에 따라 달라진다는 것을 입증했습니다.

시간 경과에 따른 거시적 및 중간규모 뇌 구조의 평가를 용이하게 하는 종적 MRI는 복잡하지 않은 mTBI의 특성을 복제하는 데 있어 여기에 제시된 CHI 모델의 충실도를 검증하기 위한 중요한 도구입니다. 이미지 획득 중, 특히 CHI 후 1일차에는 동물의 온도, 호흡수 및 심박수를 포함한 생리학적 매개변수를 잘 모니터링해야 합니다. 따라서 이소플루란의 농도는 생리학적 안정성을 유지하기 위해 적시에 신중하게 조정해야 합니다. DTI 이미지 획득을 위해 현재 연구에서는 4샷 EPI가 사용되었지만, 스캔 시간이 상대적으로 짧기 때문에 모션 아티팩트를 줄이는 데에도 싱글샷 EPI를 사용할 수 있습니다. 전임상 MRI의 이미지 처리 및 분석은 대부분의 연구가 여전히 개별 연구팀이 개발한 맞춤형 분석 파이프라인에 의존하기 때문에 매우 중요하다⁴⁵. 현재 연구의 Matlab과 같은 맞춤형 알고리즘에 액세스할 수 없는 경우 T2 가중치 이미지 및 FA 맵을 기반으로 하는 과학 이미지에 대해 각각 오픈 소스 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 볼륨 측정 및 신호 강도 추출을 수행할 수 있습니다. 여러 시점에서 획득한 MRI 이미지의 정확한 분석을 위해서는 먼저 내부 피험자 공동 정합을 수행해야 합니다. 동일한 출생 후 연령에서도 뇌 용적의 피험자 간 변화를 감안할 때, 손상 후 뇌 용적을 각 피험자에 대한 기준 부피로 정상화하는 것은 CHI⁴⁶에 의해 유발된 피질 위축을 설명하는 데 필수적입니다. FA 분석의 경우, 부분 부피 효과를 제거하기 위해 인접한 회백질(GM)과 WM을 분리하기 위한 임계값을 수행해야 합니다. FA 값은 자기장 강도⁴⁷ 및 DTI⁴⁸에 사용된 확산 구배의 수에 의해 영향을 받는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 본 연구에서 FA 임계값 설정은 다른 프로토콜 또는 MR 스캐너를 사용하여 획득한 DTI 이미지에는 일반적으로 적용되지 않을 수 있습니다.

mTBI, 특히 복잡하지 않은 mTBI는 급성기에서 기존의 신경영상으로는 보이지 않는 경우가 많기 때문에 연구 노력은 후속 손상 후 증상에 대한 예후 정보를 포착하고 제공하기 위해 효과적이고 진보된 이미지 마커를 식별하는 데 중점을 두었습니다^49,50. 임상 mTBI 사례의 이질성은 데이터의 복잡성과 불일치를 더욱 가중시킵니다. 이 복잡하지 않은 mTBI 모델에서 측정 가능한 행동 결함과 함께 이미징에서 상당한 미시적 및 거시적 구조적 변화를 관찰하여 부상 후 잠재적인 신경 이미징 바이오마커를 종단적으로 추적할 수 있는 플랫폼을 제공했습니다. 특히, CHI 모델에서 이미징 및 기능적 결과 모두에서 영향 매개변수에 따른 변화는 부상의 중증도 및 충격 매개변수에 민감한 신경영상 바이오마커를 식별할 수 있는 가능성을 시사합니다. 특정 DTI 지표와 성상교세포⁸ 사이의 상관관계를 보여주는 이전 연구 결과와 일관되게, 다양한 이미지 특성, 미시적 변화 및 기능적 결과 간의 관계를 조사하는 향후 연구는 mTBI 후 기저 세포 변화 및 증상 예후에 대한 유망한 비침습적 바이오마커를 확립할 수 있습니다.

이 연구에서는 몇 가지 제한 사항을 고려해야 했습니다. 첫째, 각 충격 매개변수 그룹의 표본 크기가 상대적으로 작고(그룹당 n = 4) 테스트된 충격 매개변수의 범위가 제한적입니다. 표본 크기가 작음에도 불구하고 CHI 그룹 간에 행동 측정, FA 값 및 피질 부피에서 상당한 차이가 관찰되었습니다. 다양한 충격 매개변수 ^8,11을 사용한 이전 연구와 함께, 본 연구의 결과는 테스트할 매개변수의 범위가 더 넓은 대규모 샘플에 대한 추가 연구를 뒷받침합니다. 둘째, 대부분의 TBI^{동물실험7,9}과 마찬가지로, 이번 실험에서는 수컷 쥐만을 사용하였다. 최근 연구에서는 생쥐의 반복적인 CHI에 따른 WM의 DTI 지표 변화에서 성별 차이를 보고했으며, 이는 뇌 손상 후 성별에 따른 특정 반응을 강조합니다¹⁰. 수컷과 암컷 동물을 모두 포함하는 향후 연구에서는 암수 간의 CHI 영향 매개변수에 대한 다양한 반응을 탐구할 것입니다. 마지막으로, CHI 후 및 다른 CHI 그룹 사이에서 FA 변화가 관찰되는 동안 확산 신호 전처리는 더욱 정교해질 수 있었습니다. 와전류 보정, 자기장 바이어스 보정 등과 같은 보다 정교한 기술을 멀티쉘 확산 이미지¹⁷과 함께 통합하면 DTI 신호의 감도를 더욱 향상시켜 mTBI에 의해 유도된 미세 구조 손상을 감지할 수 있습니다.

현재 프로토콜을 통해 우리는 CHI 후 급성기에서 상당한 행동 결핍과 함께 보존된 뇌 구조를 입증했습니다.후속 분석에서 만성기에서 현저한 대뇌 피질 용적 손실과 변화된 FA 값이 밝혀졌습니다. 더 중요한 것은 행동 및 신경 이미지 결과가 충격 수치, 부상 간 간격 및 충격 부위를 포함하여 CHI를 유도하는 데 사용되는 충격 매개변수에 따라 달라졌다는 것입니다. 주로 뇌의 행동 결과 또는 신경염증에 초점을 맞춘 발표된 mTBI 모델과 비교하여, 본 연구는 CHI 후 전신 및 전뇌 평가를 포괄하는 포괄적인 접근 방식을 채택했습니다.종단 MRI를 사용한 검사에서 CHI 모델은 급성기에서 구조적 무결성이 보존되었지만 만성기에서 피질 위축이 뚜렷하여 복잡하지 않은 mTBI의 성공적인 복제를 시사했습니다. 이 연구의 의의는 mTBI 후 다양한 충격 매개변수가 뇌를 어떻게 변화시키는지 탐구하고 임상적으로 조용한 이 손상에 대한 잠정적인 이미지 바이오마커를 개발할 수 있다는 것입니다.

저자는 공개할 잠재적인 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 대만 국가과학기술위원회(NSTC)의 연구 보조금(NSTC 113-2314-B-A49-047)으로 지원되었습니다.