在这里，我们提出了一种协议，以建立一个闭合性颅脑损伤动物模型，该模型复制了无并发症的轻度创伤性脑损伤的神经影像结果，在急性期和长期脑萎缩中保留了大脑结构。纵向磁共振成像是用于证据的主要方法。

轻度创伤性脑损伤 （mTBI），也称为脑震荡，占全球脑损伤的 85% 以上。具体来说，急性期常规临床影像学检查显示阴性结果的无并发症 mTBI 阻碍了这些患者的早期和适当护理。已经认识到，不同的影响参数可能会影响甚至加速 mTBI 后后续神经心理症状的进展。然而，脑震荡期间冲击参数与结果的关联尚未得到广泛检查。在本研究中，详细描述和演示了从体重下降损伤范式修改而来的闭合性颅脑损伤 （CHI） 动物模型。将成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠 （n = 20） 随机分配到影响参数不同的 CHI 组 （每组 n = 4）。在 50 天的研究期间进行了纵向 MR 成像研究，包括 T2 加权成像和弥散张量成像，以及序贯行为评估，例如改良神经严重程度评分 （mNSS） 和光束行走测试。在受伤后第 50 天进行星形胶质细胞增生的免疫组织化学染色。与单一损伤和假手术组相比，重复 CHI 后动物的行为表现更差。通过使用纵向磁共振成像 （MRI），在受伤后 24 小时未观察到明显的脑挫伤。然而，皮质萎缩和皮质各向异性分数 （FA） 的改变在受伤后第 50 天得到证实，表明临床无并发症的 mTBI 成功复制。最重要的是，mTBI 后观察到的神经行为结果和图像特征的变化取决于动物的影响次数、损伤间隔和选择的撞击部位。这种 体内 mTBI 模型与临床前 MRI 相结合，提供了一种在全脑尺度上探索脑损伤的方法。它还允许研究在不同影响参数和严重程度下对 mTBI 敏感的成像生物标志物。

轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 主要见于从事接触性运动的运动员、退伍军人和参与交通事故的个人¹。它占所有报告的头部受伤的 85%^{以上 2}。mTBI 的广泛病因及其不断增加的全球发病率强调了将 mTBI 作为迟发性神经退行性疾病的暂定环境危险因素³。单纯性轻度 TBI 的特征是格拉斯哥昏迷评分 （GCS） 为 13-15，在计算机断层扫描 （CT） 或磁共振成像 （MRI） 扫描中未观察到结构异常。无并发症的 mTBI 患者的常见症状包括头痛、头晕、恶心或呕吐以及疲劳。然而，由于患者的高退出率，无并发症的 mTBI 后结局的纵向评估带来了相当大的挑战⁴。

对重复性 mTBI 的担忧有所增加，尤其是在美国国家橄榄球联盟 （NFL） 职业运动员社区内，随后提高了非职业运动员的认识⁵。据推测，在最初的 mTBI 后，大脑脆弱性会增加，随后的损伤可能会加剧损伤结果。最大的足球运动员捐献大脑队列的最新发现不仅表明先前的足球参与与慢性创伤性脑病 （CTE） 的严重程度有关，而且还表明不同的足球相关因素与 CTE⁶ 的风险和严重程度之间存在相关性。因此，人们越来越担心脑震荡的数量和重复治疗方案对受伤结果的影响。临床前研究通过使用各种闭合性颅脑损伤 （CHI） 模型探索了重复 mTBI 后的神经病理学变化、神经炎症级联反应和神经心理障碍 7,8,9,10,11,12,13,14 .然而，对简单的 mTBI 模型的影响参数的研究尚未得到很好的检验，该模型可能密切模拟与运动相关的重复脑震荡头部撞击，导致急性期功能障碍和慢性期脑萎缩。

弥散张量成像 （DTI） 是一种评估水分子扩散的技术，通常用于调查 mTBI 影响的研究。分数各向异性 （FA） 是源自 DTI 的关键指标，它量化了水扩散相干的程度，并提供有关轴突和神经纤维束结构组织的信息。在各种模型中，mTBI 之后提出了白质 （WM） 中 FA 值的扰动 8,10,11,15,16,17。此外，在临床前研究中，指示轴突和髓鞘完整性的轴向扩散率 （AD） 和径向扩散率 （RD） 在 mTBI 后发生了变化 10,15,16,18,19,20。然而，先前研究之间 DTI 结果的差异可能是由于 mTBI 严重程度的变化、影响参数的差异、不同的 mTBI 模型以及受伤后随访时间点不一致⁹。

因此，目前的方案文件旨在建立 mTBI 的动物模型，旨在评估单次和重复 mTBI 的累积效应。我们纳入了全面的纵向评估，包括对动物健康状况、行为结果、DTI 参数和皮质体积的评估，以捕捉受伤后的动态变化并探索不同影响参数的影响。通过证明急性功能障碍和长期微观结构变化，该模型有效地复制了以前动物研究中未完全解决的简单 mTBI 的关键特征。在这里，我们提供了一个详细的方案，用于使用改进的闭头减重法 ^8,11 开发简单的 mTBI 模型，并在 mTBI 后进行纵向评估。

该研究是根据美国国立卫生研究院动物研究指南（实验动物护理和使用指南）和动物研究：体内实验报告指南的建议进行的。所有动物实验均已获得国立阳明交通大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。将 20 只动物随机分配到 5 组（每组 n = 4）：（i） 感觉运动皮层的单次冲击（SMCx/单次），（ii） SMCx 的双重冲击，间隔为 1 小时（SMCx/2 次打击/1 小时），（iii） SMCx 的双重冲击，间隔为 10 分钟（SMCx/2 次打击/10 分钟），（iv） 1 小时间隔对中枢脑的双重冲击（中枢/2 次打击/1 小时）， （v） 仅手术但不直接影响头部的假手术组，用于纵向结果评估（图1）。值得注意的是，为本研究选择的损伤间隔（1 小时与 10 分钟间隔）旨在模拟重复的亚脑震荡冲击 8,10,11,13,21，在一个赛季内可以多达一千次，运动员参与接触性运动 ^22,23。

1. 闭合性颅脑损伤 （CHI） 的诱导

注意：将 10 至 12 周龄且体重超过 250 克的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠饲养在 12/12 小时的光照/黑暗循环下，随意获取食物和水。

1. 将大鼠置于一个小的诱导室中，并用异氟醚 （5%） 和医用空气 （2.5-3 L/min） 的混合物麻醉。将大鼠从腔室中取出，直到它对爪子或尾巴捏没有反应。
2. 将大鼠放在加热垫上。
   注意：在手术过程中打开加热垫以维持大鼠的体温。
3. 将大鼠放在立体定位框架上并用齿条固定。使用连接的鼻锥和医用空气以 2-1.5 L/min 的流速施用 2% 的异氟醚，以便在手术期间进行维护。
4. 放置耳杆。确保大鼠在立体定位框架上居中且对称。
   注意：所有外科手术都应在无菌条件下进行。手术前使用蒸汽高压灭菌器对器械进行消毒，并在手术过程中额外使用珠子灭菌器对其尖端进行消毒。为了防止污染，在动物身上放置了手术单。外科医生戴着帽子遮住头发，戴着口罩遮住脸，并在手术过程中配备了实验服和手术手套²⁴。
5. 将脉搏血氧仪的传感器戴在动物的后爪上，以监测动物的呼吸频率、心率、血氧水平和体温。
6. 将 1 mL/kg 体重的利多卡因 （20 mg/mL） 皮下注射到大鼠的颈部作为镇痛药。
7. 将脱毛霜涂抹在动物的头部并等待 3 分钟。用 70% 异丙醇棉签擦去乳霜。
8. 使用浸泡在碘中的无菌棉签清洁剃须区域数次。使用浸泡在 70% 乙醇中的棉签去除碘残留物。
9. 使用无菌手术刀片在剃光的皮肤上创建一个约 2-2.5 厘米长的中线切口，以进入颅骨表面。
10. 使用化妆棉去除骨头上的组织，露出颅骨。使用蘸有 0.9% 盐水的棉签清洁颅骨表面，然后用干燥的化妆棉清洁。
    注意：颅骨缝合线以及前囟和 lambda 现在都可以轻松识别。
11. 将前囟识别为参考点，根据坐标进一步找出撞击区域。
    注意：在该协议中，使用两组坐标进行 CHI 诱导：（-2.5，-2.0）（前囟后外侧 2.5 毫米）（前囟后 2.0 毫米）在感觉运动皮层 （SMCx） 顶部，以及 （0，-3.0） 在中枢脑（中枢）顶部。
12. 确定颅骨表面的选定坐标，并使用牙科粘接剂将圆形不锈钢头盔（直径 10 毫米，厚度 1 毫米）粘接在指定区域。取下加热垫和脉搏血氧仪。
13. 将立体定向装置和大鼠移动到 CHI 撞击器下方的升降台（14 厘米长、8 厘米宽和 6.15 厘米深）上。
14. 使用泡沫海绵（长 19 厘米，宽 10 厘米，深 4 厘米，密度为 18 kg/m³）抬高大鼠的身体。
15. 从立体定位框架的耳杆上取下大鼠。让大鼠静止在与鼻锥相连的齿条上，输送 2% 的异氟醚。确保头部和身体在喙尾方向上对齐。
16. 调整升降台，确保 CHI 撞击器和头盔之间没有空间。在撞击前 5 秒关闭异氟醚。
    注意：为了指定由于脑损伤引起的扶正反射，进行了异氟醚的暂时停止²⁵。
17. 将 600 克的黄铜从 1 m 高处穿过不锈钢管（1 m 高，内径为 20 mm，用于清除不锈钢砝码柱）落到带有圆头瞄准金属头盔的固定撞击器上。
    注意：假组中的动物没有受到撞击，因为黄铜液滴在没有接触老鼠头上的头盔的情况下被释放。
18. 降低升降台。将大鼠从立体定位框架中取出，将大鼠仰卧在加热垫上。
19. 记录扶正反射的时间，即动物试图从仰卧位转变为俯卧位的时间^26,27。
    注意：在^{第 2 次} 撞击前 3 分钟再次麻醉接受重复 CHI 的动物。对于 SMCx/双/10 min 组中未及时翻转回俯卧位的动物，相应的扶正反射时间为 420 s。
20. 扶正反射记录后，使用步骤 1.1 再次用异氟醚麻醉大鼠。
21. 使用步骤 1.2 用立体定位框架固定大鼠。
    注意： 确认头盔在支架顶部的稳定性后，再次重复步骤 1.13-1.17 以执行^{第 2 次} 冲击。
22. 取下头盔。去除颅骨顶部的所有结缔组织和粘接剂。
23. 用牙科粘接剂覆盖颅骨，让它干燥。使用镊子背检查牙科粘接剂是否坚硬。
    注意：将牙科粘固剂涂在颅骨顶部，以消除手术后颅骨和头皮之间的颅骨-空气或颅骨-血液界面引起的磁化伪影。
24. 使用具有 4-0 个独立结的 4-5 尼龙手术缝合线闭合切口。
    注意：伤口大约有 2-2.5 厘米长。确保手术缝合线没有毛细管作用，并且由丝绸或尼龙材料制成。不要用一个结缝合切口，以防止因抓挠动物而打开伤口。
25. 在手术部位涂抹局部抗生素（Dermanest 乳膏）以防止感染。
26. 将 1 mL/kg 体重的卡洛芬 （50 mg/mL） 皮下注射到颈部作为术后镇痛药。
27. 将大鼠放在加热垫上的干净笼子中，直到它恢复意识。一旦老鼠坐直，就将其放回家笼中。
28. 手术后连续 3 天每天向动物口服 5 mL 混合在 200 mL 水中混合的对乙酰氨基酚 （24 mg/mL） 作为镇痛剂。

2. 磁共振成像 （MRI）

注意：在 CHI 之前以及受伤后 1 天和 50 天使用序贯 PET/MR 7T 系统进行 T2 加权图像和弥散张量成像（图 1）。在 CHI 手术前 1 周内进行基线 MRI。对于 CHI 后 1 天和 50 天的评估，行为评估在上午进行，随后在同一天下午进行 MRI 扫描。

1. 在充满异氟醚 （5%） 和医用空气 （2.5-3 L/min） 混合物的小型诱导室中麻醉大鼠。
2. 一旦大鼠对爪子或尾巴捏没有反应，当以头先俯卧姿势转移到动物摇篮时，暂时暂停麻醉。
3. 将大鼠置于与鼻锥连接的头架中，以 1.5-2 L/min 的流速用医用空气输送 2% 异氟醚，以便在图像采集期间进行维护。
4. 用一小块胶带固定头部，以避免在扫描过程中移动。
   注意：在 CHI 后的第一天在大鼠的头部涂抹一些牙膏，以防止由于头皮去除而出现磁化伪影^28,29。
5. 在大鼠的胸部下方放置一个压力垫以监测呼吸。将血氧仪夹子贴在后肢上以监测心率。
6. 插入直肠探头以测量直肠温度。在实验过程中，用加热毯和循环温水和组织包裹物盖住大鼠，以保持体温。
   注意：在整个实验过程中，监测生理状况，包括心率、呼吸频率和直肠温度。扫描前，检查大鼠的所有生理信号，以确保生命体征监护仪的质量。
7. 使用 PET/MR 扫描仪的激光定位系统标记头部中心，以实现精确对准。
8. 使用电动动物运输系统自动将动物移动到 MRI 孔中，直到头部中心与扫描仪的等中心对齐。
   注：集成到 PET/MR 系统中的电动动物运输系统可确保准确的动物定位，并简化在成像模式之间转换时的工作流程。
9. 获取 MRI 序列。
   1. 执行初始定位和整体调整。
   2. 使用中间矢状片，将前部的^第 8 片与前连合的分离对齐。
      注意：冠状切片垂直于由连接前连合和小脑基部的线定义的水平面定位，对应于相对于胼胝体长轴约 15° 的角度。中矢状切片的 T2-RARE 扫描的关键参数如下：重复时间 （TR） = 2500 ms，回波时间 （TE） = 44 ms，视场 （FOV） = 3.5 cm，矩阵尺寸 = 256 256，切片厚度 = 1 mm，切片数量 = 1，稀有因子 = 8，带宽 = 75 kHz，平均值数 = 1，采集时间 = 1 分 20 秒。
   3. 使用具有脂肪抑制和大脑下方饱和带的快速采集和松弛增强 （RARE） 来获得 T2 加权图像以供解剖参考（图 2）。
      注：T2-RARE 扫描的关键参数如下：重复时间 （TR） = 3600 ms，回波时间 （TE） = 40 ms，视场 （FOV） = 2 cm，矩阵尺寸 = 256 256，切片厚度 = 1 mm，切片数 = 16，稀有因子 = 8，带宽 = 75 kHz，平均值数 = 8，采集时间 = 7 分 40 秒。
   4. 使用 4 次自旋回波 EPI 获取扩散张量图像（图 2）。
      注意：DTI 扫描的关键参数如下：TR = 3000 ms，TE = 28 ms，视场 （FOV） = 2 cm，矩阵尺寸 = 96 96，厚度 = 1 mm，切片数 = 16，脉冲持续时间 （δ） = 5 ms，两个脉冲之间的时间 （Δ） = 15 ms，B0 的数量 = 5，方向数 = 30， b 值 = 1000 s/mm³，带宽 = 150 kHz，平均值数 = 4，采集时间 = 14 分钟。
   5. 完成扫描协议。将动物摇篮从磁铁中滑出。将动物从摇篮中取出。
   6. 将大鼠转移到一个干净的笼子中，笼子下面有加热垫以保持其体温。一旦老鼠恢复意识，就将其放回笼子里。
10. 图像预处理
    注意：使用 MRtrix3、统计参数映射 （SPM） 软件和自定义 MATLAB 脚本进行数据处理和分析。
    1. 使用 MRtrix3 命令 （dwidenoise） 对 DTI 图像进行去噪³⁰。
    2. 使用 MRtrix 命令 （mrdegibbs）³⁰ 从 DTI 图像中删除 Gibb 的振铃伪影。
    3. 使用 SPM 函数 （spm_coreg.m 和 spm_powell.m） 在纵向扫描中将 DTI 图像与单个主题的 T2 加权图像共配准。
    4. 通过手动逐个切片绘制大脑区域的轮廓，然后删除强度低于 Otsu 方法³¹ （自定义 MATLAB 脚本 thr_otsu2.m）确定的计算阈值的像素，在 T2 加权图像上执行颅骨剥离。
    5. 使用 SPM 函数 （spm_coreg.m 和 spm_powell.m） 在同一实验组的动物之间进行跨受试者共注册。将脑罩应用于相应的 DTI 图像。
       注意：进行颅骨剥离术是为了减少计算机处理时间。
    6. 根据 DTI（自定义 MATLAB 脚本，tensormap.m）计算张量映射。
    7. 计算 FA 映射（自定义 MATLAB 脚本，calFA.m）
       注意：所有自定义 MATLAB 脚本都可通过以下数据库 （https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.57770/9ZESXD） 获得。
11. 图像分析-FA
    1. 在 CHI 坐标下方的皮层和胼胝体 （CC） 中绘制感兴趣的区域 （ROI）。
       注意：所有 ROI 均由 2 名对实验组不知情的经验丰富的研究人员手动绘制并目视检查是否存在严重错误。
    2. 从 ROI 中提取并平均 FA 值。
       注意：对于皮层下方的胼胝体，在选定的 ROI 中排除了 FA 值为 0.35 <像素，以消除部分体积效应。对于皮层，招募了 ROI 中 FA 值为 < 0.35 的所有像素进行分析。
12. 图像分析 - 体积
    1. 在 Pregma -7 至 +3 mm 处手动绘制覆盖皮层区域的 11 个连续图像切片的 ROI。
       注意：所有 ROI 均由 2 名对实验组不知情的经验丰富的研究人员手动绘制。
    2. 将切片中 ROI 的总像素相加，并通过乘以切片厚度 （1 mm） 将它们转换为体积。
    3. 将 CHI 后的皮质体积与每只动物 CHI 之前的相应体积标准化。
       注：在呈现前对数据进行标准化以消除动物之间脑容量的个体差异。

3. 行为评估

注意：在 CHI 之前以及 CHI 后 1 天和 50 天使用光束行走平衡测试和 mNSS 进行行为实验（图 1）。所有评估均由至少两名观察员进行，以确保所收集数据的准确性、一致性和客观性。

1. 光束行走平衡测试
   1. 打开摄像机并启动计时器。
   2. 将大鼠放在平衡木的一端（深 3 厘米，宽 3 厘米，长 80 厘米，离地面 60 厘米）。
   3. 一旦老鼠完成一次往返、跌倒或冻结超过 3 分钟，就停止计时器。
      1. 在实验过程中，使用 mNSS^{11、32、33、34} 观察动物状况以进行评估。请遵循以下评估标准：
      2. 如果大鼠在横梁上保持平衡并保持稳定的姿势，则分配 0 分。
      3. 如果老鼠抓住了横梁的侧面，则分配一个分数 1。
      4. 如果老鼠跌落时一条肢体离开横梁，则分配 2 分。
      5. 如果大鼠跌倒时两条肢体脱落或在横梁上旋转 （>60 s），则分配 3 分。
      6. 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但掉落（>40 秒），则分配 4 分。
      7. 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但跌落（>20 秒），则分配 5 分。
      8. 如果老鼠没有尝试平衡或挂在横梁上并在 20 秒内脱落，则给 6 分。
      9. 如果大鼠未能完成任务，则将其视为花费了最大 3 分钟的时间并分配 6 分。
   4. 将检测日期安排在特定时间点。
      注意：将未完成 CHI 前两次试验束行走往返的大鼠排除在随后的手术和后续行为评估中。
2. 改良神经严重程度评分 （mNSS）
   注意：mNSS 评估包括运动测试、感觉测试、无反射、异常运动、光束平衡和在地板上行走 ^32,33，每天快速进行。
   1. 执行电机测试。
      1. 通过尾巴的根部抬起大鼠，观察其四肢的反射约 15 秒，以评估适当的屈曲和伸展。
      2. 如果观察到前肢正常屈曲，则评分为 0。如果未观察到屈曲，则分配 1 分。
      3. 如果观察到后肢正常屈曲，则评分为 0。如果未观察到屈曲，则分配 1 分。
      4. 如果用尾巴抬起大鼠后 30 s 内头部向纵轴移动 >10°，则给 0 分。如果没有，则分配分数 1。
         注意：此测试时段最多分配 3 个分数。
   2. 进行肢体放置测试。
      注意：进行放置测试是为了评估感觉（视觉、触觉和本体感觉）和运动功能之间的协调性。
      1. 慢慢地将大鼠降低到桌子表面。观察老鼠的爪子是否伸向表面。
      2. 如果大鼠到达水面时双肢伸展并向前伸展，则分配 0 分。如果存在延迟或没有响应，则分配一个分数 1。
      3. 将老鼠放在表面上，将爪子拉到桌子边缘。观察它的爪子是否回到桌子表面的正常位置。
      4. 如果观察到即时和正常放置响应，则分配分数 0。如果观察到延迟放置响应，则分配 1 分。如果没有响应，则分配分数 2。
         注意：此测试时段最多分配 3 个分数。
   3. 观察反映缺失和异常运动。
      1. 观察头部抖动，以评估用棉签的棉签接触耳道时的耳廓反射。
      2. 如果观察到反射正常，则分配 0 分。如果未观察到反射，则分配 1 分。
      3. 用棉签的棉签接触角膜，评估角膜反射的存在。
      4. 如果引发正常反应，则分配 0 分。如果没有引起眨眼反应，则分配 1 分。
      5. 短促而有力地拍手。观察惊吓反射的存在。
      6. 如果观察到反射，则分配 0 分。如果未观察到反射，则分配 1 分。
      7. 观察大鼠是否有癫痫发作、肌阵挛或肌张力障碍。
      8. 如果出现其中任何一个，则分配一个分数 1。
         注意：此测试时段最多分配 4 个分数。
   4. 如前所述（步骤 3.1）执行光束平衡测试。
      注意：此测试时段最多分配 6 个分数。
   5. 进行地板行走测试。
      1. 准备旷场竞技场（75 厘米长、50 厘米宽和 40 厘米深）。确保它是干净的，没有任何以前的气味线索。
      2. 在空旷场地的中央放置一只老鼠，观察老鼠在场地中是如何行走的。
      3. 如果大鼠进行常规行走，则分配 0 分。
      4. 如果老鼠不能直走，则给 1 分。
      5. 如果大鼠放在地板上后跌倒到麻痹侧，则打 3 分。
         注意：此测试时段最多分配 3 个分数。
   6. 将所有分数相加;最高可能分数为 18。
      注意：分数越高表示结果越差。

4. 免疫组织学

1. 进行经心灌注³⁵。
   注意：经心灌注在 CHI 后 50 天的 MRI 扫描后进行（图 1）。
   1. 将大鼠放在一个小的诱导室中，用异氟醚 （5%） 麻醉它，直到它对爪子或尾巴捏没有反应。
   2. 通过腹膜内注射给予 50 mg/kg 体重的 zoletil （50 mg/mL） 和 10 mg/kg 体重的甲苯噻嗪 （Roumpun，23.32 mg/mL） 进行深度麻醉。
   3. 将大鼠置于仰卧位。
   4. 用剪刀在胸部下方做一个大约 4-5 厘米长的横向切口。
   5. 找到隔膜并切开以露出心脏。
   6. 使用止血钳夹住肺动脉，然后在右心房做一个大约 0.5-1 cm 长的切口。
   7. 将针头连接到连接到输液泵的管道。
   8. 将针头插入左心室。
   9. 通过 40 mL 0.9% 生理盐水经心灌注 （50 mL/min） 冲洗动物，直至血液清除。
   10. 通过经心灌注 （40 mL/min） 用 500 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 灌注动物进行固定。
   11. 取下大鼠的头部，小心地从头骨上剥下脑组织。
   12. 将大脑在瓶中约 20 mL 的 4% PFA 中保存 48 小时以进行后固定。
2. 进行组织处理和 IHC 染色^36,37。
   注：使用免疫过氧化物酶二级检测系统试剂盒对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学染色。
   1. 使用福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片。
   2. 进行脱蜡并用 3% H₂O₂ 处理载玻片以阻断内源性过氧化物酶活性。使用 90 °C 的柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。
   3. 使用 Immunoperoxidase 二级检测系统试剂盒进行免疫组织化学染色。
      注意：染色程序按照制造商的建议进行。
   4. 使用苏木精对标本进行复染。
   5. 用抗淬灭试剂封片标本。
   6. 使用抗神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 抗体进行免疫组织化学染色。
   7. 使用光学显微镜载玻片扫描仪获取 ROI 的图像（图 6）。

5. 行为和图像结果的统计分析

注：在目前的研究中，统计分析是在 SPSS 中进行的;但是，可以在其他统计工具箱中执行统计分析。

1. 将宽格式数据加载到 SPSS *.sav 文件中。
2. 进行重复测量方差分析 （ANOVA），以比较各组随时间推移的行为（标准化权重、mNSS 和光束行走持续时间）和图像结果（皮层和 CC 中的 FA 值）。
   1. 单击 Analyze > General Linear Model > Repeated Measures。
   2. 在 Within-Subject Factor Name 框中分配一个名称（例如，时间），并在 Number of Levels 框中输入“3”（三个级别具有不同的后续时间点）。在重复测量定义因子对话框的测量名称框中分配一个名称（例如，mNSS）。
   3. 加载需要测试的 主体内变量 （在 CHI 后 D1 和 D50 采集的数据），并在 “重复测量 ”对话框中指定主体间因子（例如，具有不同影响参数的动物群体）。
   4. 在“观测均值”的事后多重比较对话框中，选择 Bonferroni 作为因子（例如，动物组）的事后检验。
      注：为了校正多重比较，使用 Bonferroni 校正 （0.05/3） 调整了 I 型误差，以便随时间进行比较。统计显着性定义为 p < 0.05 （SPSS 调整）。
3. 进行单因素方差分析，比较各组之间的扶正反射和皮质体积的变化。
   1. 单击 分析>比较均值>单因子方差分析。
   2. 将变量（扶正反射和皮质体积变化）加载到 Dependent List 中，并将组作为 One-Demand ANOVA 对话框中的因子加载。
   3. 在“ 单因子方差分析：事后多重比较 ”对话框中选择 Bonferroni 作为事后检验。
      注：为了校正多重比较，使用 Bonferroni 校正 （0.05/5） 调整 I 型误差以进行组间比较。统计显着性定义为 p < 0.05 （SPSS 调整）。

图 2 显示了在 SMCx 处具有假和重复 CHI 的代表性动物的纵向 MRI。在 CHI 后 1 天和 50 天的 T2 加权图像中未发现明显的颅骨骨折或脑挫伤。在 CHI 后 1 天和 50 天的 FA 图中未发现明显的水肿或WM变形。在本研究中，所有接受 CHI 的动物都存活了 50 天的整个实验持续时间，表明 CHI 模型的死亡率较低 （0-5%）⁷ 。

脑损伤后立即意识受损的程度是通过动物的扶正反射丧失来评估的，这是动物自我纠正其位置的内在倾向。与 SMCx 的假和单一 CHI 相比，重复 CHI 后动物恢复扶正反射的时间增加（图 3A）。CHI 后动物的总体健康状况通过正常体重和 mNSS 的变化来反映。各组之间 CHI 后未观察到显着体重减轻（图 3B）。虽然在单次 CHI 后第 50 天发现较高的 mNSS 评分，但在重复 CHI 后第 1 天观察到 mNSS 评分显着增加，并且无论严重程度和影响部位如何，都保持高位直到第 50 天（图 3C）。中枢脑重复 CHI 诱导的 mNSS 升高在第 50 天降低，显著低于 SMCx 的相应 CHI。通过光束行走试验评估 CHI 后大鼠的平衡和协调运动功能。在重复 CHI 后第 1 天观察到光束行走持续时间显着增加，并且无论严重程度和影响部位如何，都保持高位直到第 50 天（图 3D）。中枢脑重复 CHI 诱导的拉长光束行走持续时间在第 50 天减少，显著短于 SMCx 的相应 CHI。

在 CHI 后 50 天观察到皮质体积显着减少（图 4A）。第 50 天的皮质体积分别为 99.63% ± 2.15%、95.98% ± 1.65%、92.26% ± 2.22% 和 90.28% ± 1.17%，分别在假手术和单次和重复 CHI 后，在 SMCx 的间隔为 1 小时和 10 分钟（图 4B）。在中枢脑重复 CHI ± 1 小时间隔后，第 50 天的皮质体积为基线体积的 91.54% 和 1.98%。与假手术组相比，CHI 后观察到显著的皮质丢失。与单一 CHI 组相比，重复 CHI 后观察到显著的皮质丢失。在 1 小时和 10 分钟间隔的重复 CHI 后，在前囟 -4 至 +0 和前囟 -5 至 +1 处观察到皮质体积显着减少， 分别（图 4C）。与不同影响部位的 CHI 动物相比，中枢脑 CHI 后仅在前囟 0 处的切片中发现皮质体积显着减小。虽然在之前的¹¹ 项和当前的研究中报告了显着的皮质萎缩，但建议使用具有高空间分辨率的 T2 加权图像，最好以 3D 形式获取，用于精确的体积分析。此外，应用基于图谱的差分同形配准方法³⁸ 的未来研究可能会更好地解决与轻度脑损伤相关的区域脑变化。

计算纵向 MRI 扫描期间的皮质 FA 值以指示 CHI 后暂定的微观结构变化。在 SMCx 进行单次 CHI 后，在撞击部位下方未观察到显着的 FA 变化。在 SMCx 重复 CHI 后，与基线相比，第 50 天在皮层中观察到同侧病变皮质 FA 的显着增加，重复 CHI 后 1 天以 1 小时间隔观察到（图 5A）。此外，重复 CHI 后 1 天（间隔为 10 分钟）显示同侧皮层皮层中 FA 的显著降低，这显着低于单次重复 CHI 后 1 小时间隔。SMCx 的 CHI 没有诱导中枢脑皮层 FA 的显着变化（图 5B）。在中枢脑重复 CHI 后，与基线和第 1 天相比，第 50 天在皮层中观察到中枢脑下方皮质 FA 的显着增加（图 5B）。

在 SMCx 进行单次 CHI 后，在 ipsi 病灶 SMCx 下方的 CC 中未观察到 FA 的显着变化（图 5A）。在 SMCx 重复 CHI 后，与基线相比，第 50 天在皮层中观察到 CC 中 ipsi 病变 FA 的显着降低，与基线相比，重复 CHI 后 1 天以 1 小时间隔观察到（图 5A）。在重复 CHI 后观察到第 1 天同侧病变 CC 中 FA 的减少，然后在第 50 天恢复，间隔为 10 分钟。在 ipsi 病变 CC 中，在 10 分钟间期重复 CHI 后，与间隔 1 小时的重复 CHI 相比，第 1 天的 FA 值显着降低;与具有 1 小时间期的假、单次和重复 CHI 相比，第 50 天的 FA 值显着升高。在中枢脑重复 CHI 后，与 SMCx 的 CHI 相比，在第 1 天观察到同侧病变 SMCx 下方 CC 中 FA 的显着增加，与假手术组相比，在第 50 天观察到 FA 的显着增加（图 5A）。

通过损伤后 50 天 GFAP 的表达评估 CHI 后神经炎症。免疫染色结果表明，无论严重程度和影响部位如何，CHI 后星形胶质细胞都在同侧 SMCx 中积累（图 6）。

图 1：实验设计示意图。 显示关键步骤的示意图，包括闭合性脑损伤的诱导和每次评估的相应时间表。CHI 前的 MRI 扫描和行为评估在手术前 7 天内进行。恢复扶正反射的时间被评估为意识受损的程度。在 CHI 后 1 天和 50 天收集纵向 MRI 和行为数据。完成所有实验后处死大鼠，然后进行免疫组织学检查。缩写：SMCx/single = 感觉运动皮层的单次冲击;SMCx/2 次命中/1 小时 = SMCx 的双重冲击，间隔为 1 小时;SMCx/2 次命中/10 分钟 = SMCx 的双重冲击，间隔为 10 分钟;中枢/2 次命中/1 小时 = 1 小时间隔对中枢脑的双重冲击。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：CHI 后的代表性 MR 图像。 假手术前和假手术后第 1 天和第 50 天来自代表性动物的 T2 加权图像（上行）和 FA 图（下行）以及 SMCx 双 CHI，间隔为 10 分钟。实验性 CHI 后 T2 加权图像上无局灶性挫伤。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：具有不同影响参数的 CHI 后的行为缺陷。 （A） 最后一次撞击后恢复扶正反射的时间。在 SMCx 重复 CHI 后，扶正反射的时间增加。（B） 各组之间 CHI 后正常化体重 （标准化为 CHI 前基线） 无显著差异。重复 CHI 后观察到 （C） mNSS 和 （D） 光束行走持续时间的增加。虽然 SMCx 的 CHI 后 mNSS 和光束行走持续时间仍然很高，但在中枢脑 CHI 后第 50 天它们恢复了。使用 Bonferroni 事后 检验对扶正反射时间进行单向方差分析;使用 Bonferroni 事后检验对归一化权重、mNSS 和光束唤醒持续时间进行重复方差分析：*， 时间点之间的 p < .017;+， p < .05 vs. 假;#， p < .05 vs. SMCx/single;§， p < .05 vs. SMCx/2 次命中/1 小时。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：CHI 后 50 天的皮质萎缩，具有不同的影响参数。 （A） 中矢状位图像上的切片对齐。蓝线表示连接前连合和小脑基底的水平面;虚线 B 线表示胼胝体的长轴。（B） 说明性皮质 ROI（红色）叠加在代表性图像切片中的 T2 加权图像上，用于测量皮质体积。（C） CHI 后皮质体积的变化表示为前囟 -7 至 +3 mm 处不同切片之间基线体积的百分比。证明 CHI 后 50 天皮质体积减少，并且影响参数依赖性。数据表示为 std ±均值。使用 Bonferroni 事后 检验的单因素方差分析：+， p < .05 vs. sham;#， p < .05 vs. SMCx/single;§， p < .05 vs. SMCx/2 次命中/1 h。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：不同影响参数的 CHI 后 FA 的纵向变化。 自动分割的 ROI 是 （A） SMCx 和 （B） 中枢脑撞击部位深处的皮层（绿色）和胼胝体 （CC）（红色）。插图显示了 3D 大脑图像，其中切片位于撞击部位下方。对 CHI 之前、之后 1 天和 50 天获得的 FA 值的纵向随访表示为 ± 标准平均值。重复 CHI 后 FA 的改变很突出，并且依赖于影响参数。使用 Bonferroni 事后检验重复方差分析：*， 时间点之间的 p < .05;+， p < .05 vs. 假;#， p < .05 vs. SMCx/single;§， p < .05 vs. SMCx/2 次命中/1 小时。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：受伤后 50 天，撞击部位下方皮层 CHI 诱导的神经炎症。 撞击部位下方大脑皮层的代表性图像，采用 GFAP 染色。在 CHI 后观察到星形胶质细胞（箭头）在皮层中积累。比例尺 = 40 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

本研究旨在建立单纯性轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 动物模型，以评估单次和重复性损伤的累积影响，以及对不同脑区影响的结果。闭合性头部损伤 （CHI） 模型改编自闭合头部减重损伤范式，旨在模拟运动员和有头盔保护的个人通常经历的脑震荡。该模型最大限度地减少了局灶性脑损伤，同时能够精确纵关键影响参数，包括撞击次数、损伤间隔和撞击区域。这里的研究结果表明，这些参数显着影响了行为结果和各向异性分数 （FA） 值的进展。值得注意的是，在慢性期观察到严重的皮质萎缩，这是慢性创伤性脑病 （CTE） 的标志性特征，无论冲击负荷或位置如何。该实验模型为简单 mTBI 后功能和微观结构变化的纵向研究提供了一个强大的框架，解决了以前动物模型中的空白。

为了复制在接触性运动或摩托车事故等临床场景中观察到的 mTBI，已经在各种动物模型中实施了不同的啮齿动物头盔设计⁷。与针对暴露的脑表面的冲击相比，对闭合颅骨或头部的冲击通常会导致更轻微和更弥漫的脑损伤 ^15,39。然而，已经承认，在使用固定头盔时，观察到动物之间的结果存在很大差异，这主要是由于撞击部位位置的不一致⁴⁰。本研究中的 CHI 模型是从 Marmarrou 的 weight-drop 模型修改而来的，其中金属盘放置在头骨⁴¹ 上。我们进一步完善了原始方法，采用更薄的椎间盘 （1 mm） 并集成固定撞击器尖端，以降低颅骨骨折的风险。我们之前的显微计算机断层扫描 （CT） 结果证实了 CHI¹¹ 后没有明显的微骨折。使用直接指向胶结盘的固定冲击头的另一个优点是，它有助于精确控制冲击部位，使我们能够系统地探测撞击部位对实验结果的影响。值得注意的是，当前模型中的头皮切口和麻醉可能会诱发额外的免疫和炎症反应，尤其是在急性期。使用清醒和头皮完整的动物可以帮助减轻这些影响并提高对亚脑震荡性脑损伤临床病例的可转化性¹⁰。

与假损伤组或单损伤组相比，rCHI 后动物的 mNSS 评分显著提高、完成光束行走任务的持续时间更长（图 3）、皮质体积更小（图 4B）和 FA 值的变化（图 5A），证明了 CHI 对行为和图像结果的累积影响。此外，与间隔为 1 小时间期的动物相比，在受伤后第 1 天接受重复 CHI 的动物皮层和 CC 的 FA 值显着降低（图 5A）和第 50 天皮质体积减少（图 4B），表明损伤间期较短的结果更差。当以 1 小时的间隔进行重复性损伤时，与对中枢脑的影响相比，对 SMCx 产生影响的动物表现出更高的 mNSS 评分（图 3C）和更长的光束行走持续时间（图 3D），表明 CHI 结果取决于影响部位。除了 FA 的改变外，还提出了 CHI 后 WM 10,11,19 的 AD 减少和 GM 10,16,18 的 RD 增加。未来的研究结合对 DTI 参数的全部范围进行全面分析，可以更深入地了解不同的影响参数如何影响 CHI 的进展和结果。拟议的模型也可以应用于青少年大鼠和小鼠。然而，进一步的调整，包括水滴的高度和重量，以及头盔的尺寸，都需要提前探索和验证。

扶正反射是一种动物与生俱来的行为，其特征是能够重新定向并自发地站起来，可作为评估人类意识丧失 （LOC） 的替代指标⁴²。为了记录 CHI 后恢复扶正反射所需的时间，在 CHI 诱导期间必须使用吸入麻醉剂而不是注射麻醉剂。此外，在 CHI 之前立即暂时停止异氟醚是必要的²⁵。建议监测 TBI 后体重的变化以表明整体损伤⁴³。CHI 后正常体重没有显着变化表明此处描述的模型中脑损伤的轻度。改良的 NSS 和束行走持续时间已广泛用于评估脑损伤后的整体健康状况和前庭运动功能⁴⁴。鉴于行为评估和 MRI 实验是在 CHI 后同一天进行的，因此所有后续评估都在 MRI 扫描之前进行行为测试，以防止麻醉干扰测量的行为结果（图1）。此外，应根据 pre-CHI 测试排除表现出运动协调性差的动物，也可能增加 mNSS 评分。我们的结果与之前的研究一致，显示重复 CHI¹¹ 后 mNSS 评分显着升高，射束行走持续时间延长。此外，我们证明 mNSS 评分和射束行走持续时间取决于 CHI 的影响部位，尤其是在受伤后第 50 天。

纵向 MRI 有助于随着时间的推移评估宏观和中尺度大脑结构，是验证此处介绍的 CHI 模型在复制无并发症 mTBI 特征方面的保真度的重要工具。在图像采集过程中，尤其是在 CHI 后第 1 天，应很好地监测动物的生理参数，包括体温、呼吸频率和心率。因此，应及时仔细调整异氟醚的浓度，以保持生理稳定。虽然目前的研究中采用了四次 EPI 进行 DTI 图像采集，但由于扫描时间相对较短，单次 EPI 也可用于减少运动伪影。临床前 MRI 的图像处理和分析至关重要，因为大多数研究仍然依赖于由各个研究团队开发的定制分析管道⁴⁵。如果无法访问自定义算法，如当前研究中的 Matlab，则可以使用开源软件 ImageJ 分别基于 T2 加权图像和 FA 图的科学图像来完成体积测量和信号强度提取。为了准确分析在多个时间点获得的 MRI 图像，应首先进行内部受试者共同配准。即使在相同的出生后年龄，鉴于受试者间脑容量的变化，每个受试者的损伤后脑容量正常化到其基线体积对于描述 CHI⁴⁶ 诱导的皮质萎缩至关重要。对于 FA 分析，必须执行分离相邻灰质 （GM） 和 WM 的阈值，以消除部分体积效应。需要注意的是，FA 值受磁场强度⁴⁷ 和 DTI⁴⁸ 中采用的扩散梯度数量的影响。因此，当前研究中 FA 阈值的设置可能通常不适用于使用不同协议或 MR 扫描仪获取的 DTI 图像。

由于 mTBI，尤其是简单的 mTBI，在急性期通常被常规神经影像学所忽视，因此研究工作集中在识别有效和先进的图像标志物，以捕获并提供有关后续损伤后症状的预后信息^49,50。临床 mTBI 病例的异质性进一步增加了数据的复杂性和不一致性。在这个简单的 mTBI 模型中，我们观察到成像中显着的微观和宏观结构变化以及可测量的行为缺陷，提供了一个纵向跟踪受伤后潜在神经影像生物标志物的平台。值得注意的是，CHI 模型中成像和功能结果的影响参数依赖性变化表明有可能识别对损伤严重程度和影响参数敏感的神经影像学生物标志物。与先前显示特定 DTI 指标与星形胶质细胞增生症⁸ 之间相关性的研究一致，未来检查各种图像特征、微观改变和功能结果之间关系的研究可能会为 mTBI 后的潜在细胞变化和症状预后建立有希望的非侵入性生物标志物。

在这项研究中，必须考虑几个限制。首先，每个影响参数组的样本量相对较小（每组 n = 4），并且测试的影响参数范围有限。尽管样本量小，但我们观察到 CHI 组之间在行为测量、FA 值和皮质体积方面存在显着差异。结合之前使用不同影响参数的研究 ^8,11，我们的结果支持在大样本中进一步研究，测试参数范围更广。其次，与大多数 TBI 动物研究 ^7,9 一样，目前的实验只使用雄性大鼠。最近的研究报告了小鼠重复 CHI 后 WM 中 DTI 指标变化的性别差异，突出了脑损伤后的性别特异性反应¹⁰。未来纳入雄性和雌性动物的研究将探讨两性之间对 CHI 影响参数的不同反应。最后，虽然在 CHI 后和不同 CHI 组之间观察到 FA 变化，但扩散信号预处理可以进一步细化。结合更复杂的技术，如涡流校正、磁场偏置校正等，以及多壳扩散图像¹⁷ 可以进一步提高 DTI 信号的灵敏度，以检测由 mTBI 引起的微观结构损伤。

使用当前的方案，我们证明了 CHI 后急性期保留的大脑结构以及显着的行为缺陷。随后的分析显示，慢性期皮质脑体积显着丢失和 FA 值改变。更重要的是，行为和神经影像学结果取决于用于诱导 CHI 的影响参数，包括影响次数、损伤间隔和影响部位。与已发表的主要关注大脑行为结果或神经炎症的 mTBI 模型相比，本研究采用了一种包括 CHI 后全身和全脑评估在内的综合方法。通过使用纵向 MRI 检查，CHI 模型在急性期表现出保留的结构完整性，但在慢性期表现出明显的皮质萎缩，表明成功复制了简单的 mTBI。该研究的意义在于，可以探索各种影响参数如何改变 mTBI 后的大脑，并为这种临床无症状的损伤开发试探性图像生物标志物。

作者没有需要披露的潜在利益冲突。

这项工作得到了台湾国家科学技术委员会 （NSTC） （NSTC 113-2314-B-A49-047） 的研究资助。