כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל של בעלי חיים עם פגיעת ראש סגורה המשחזר את תוצאת הדימוי העצבי של פגיעה מוחית טראומטית קלה לא מסובכת עם מבנה המוח השמור בשלב החריף וניוון מוחי ארוך טווח. הדמיית תהודה מגנטית אורכית היא השיטה העיקרית המשמשת לראיות.

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הידועה בשם זעזוע מוח, אחראית ליותר מ-85% מפגיעות המוח ברחבי העולם. באופן ספציפי, mTBI לא מסובך המציג ממצאים שליליים בהדמיה קלינית שגרתית בשלב האקוטי מעכב טיפול מוקדם ומתאים בחולים אלה. ידוע כי פרמטרי השפעה שונים עשויים להשפיע ואף להאיץ את התקדמות התסמינים הניורופסיכולוגיים הבאים לאחר mTBI. עם זאת, הקשר בין פרמטרי ההשפעה במהלך זעזוע מוח לתוצאה לא נבדק בהרחבה. במחקר הנוכחי תואר והודגם בפירוט מודל של בעלי חיים עם פגיעת ראש סגורה (CHI) ששונה מפרדיגמת פציעת ירידה במשקל. חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים (n = 20) הוקצו באופן אקראי לקבוצות CHI עם פרמטרי השפעה שונים (n = 4 לקבוצה). מחקרי הדמיית MR אורכיים, כולל הדמיה משוקללת T2 והדמיית טנזור דיפוזיה, והערכות התנהגותיות עוקבות, כגון ציון חומרה נוירולוגי שונה (mNSS) ומבחן הליכת קרן, נערכו על פני תקופת מחקר של 50 יום. צביעה אימונוהיסטוכימית לאסטרוגליוזיס בוצעה ביום ה-50 לאחר הפציעה. ביצועים התנהגותיים גרועים יותר נצפו בבעלי חיים לאחר CHI חוזר בהשוואה לקבוצת הפציעה הבודדת והדמה. על ידי שימוש בהדמיית תהודה מגנטית אורכית (MRI), לא נצפתה חבלה מוחית משמעותית ב-24 שעות לאחר הפגיעה. עם זאת, ניוון קליפת המוח ושינוי באניזוטרופיה חלקית בקליפת המוח (FA) הודגמו ביום ה-50 לאחר הפציעה, מה שמרמז על שכפול מוצלח של mTBI קליני לא מסובך. והכי חשוב, שינויים בתוצאות נוירו-התנהגותיות ובתכונות התמונה שנצפו אחרי mTBI היו תלויים במספר הפגיעה, במרווחים בין הפציעות ובאתר הפגיעה שנבחר בבעלי החיים. מודל mTBI in vivo זה בשילוב עם MRI פרה-קליני מספק אמצעי לחקור פגיעה מוחית בקנה מידה מוחי שלם. זה גם מאפשר לחקור סמנים ביולוגיים של הדמיה הרגישים ל-mTBI על פני פרמטרי השפעה ורמות חומרה משתנים.

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) נצפית בעיקר אצל ספורטאים העוסקים בספורט מגע, יוצאי צבא ואנשים המעורבים בתאונות דרכים¹. זה מהווה יותר מ-85% מכלל פגיעות הראש המדווחות². האטיולוגיה העצומה של mTBI והשכיחות העולמית הגוברת שלה מדגישים את הכללת mTBI כגורם סיכון סביבתי טנטטיבי למחלה ניוונית מאוחרת³. TBI קלה לא מסובכת מאופיינת בציון תרדמת גלזגו (GCS) של 13-15, ללא חריגות מבניות שנצפו בסריקות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או הדמיית תהודה מגנטית (MRI). תסמינים נפוצים שחווים מטופלים עם mTBI לא מסובך כוללים כאבי ראש, סחרחורת, בחילות או הקאות ועייפות. עם זאת, הערכה אורכית של תוצאות בעקבות mTBI לא מסובך מציבה אתגרים ניכרים בשל שיעור הנשירה הגבוה בחולים⁴.

החששות מ-mTBI חוזרים וגברו, במיוחד בקרב קהילת הספורטאים המקצועיים של ליגת הפוטבול הלאומית (NFL), וכתוצאה מכך העלו את המודעות בקרב^{ספורטאים לא} מקצועיים. ההנחה היא שפגיעות מוחית גדלה לאחר ה-mTBI הראשוני, כאשר עלבונות לאחר מכן עלולים להחמיר את תוצאות הפציעה. ממצאים אחרונים מקבוצת המוח הגדולה ביותר שנתרמה של שחקני כדורגל לא רק קשרו השתתפות קודמת בכדורגל בחומרת אנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE), אלא גם הציעו מתאם בין גורמים שונים הקשורים לכדורגל לבין הסיכון והחומרה של CTE⁶. לפיכך, החשש מהשפעת מספר זעזועי המוח והמשטר החוזר על תוצאות הפציעות הולך וגובר. מחקר פרה-קליני חקר שינויים נוירופתולוגיים, מפל נוירו-דלקתי וליקוי נוירופסיכולוגי לאחר mTBI חוזר על ידי שימוש במודלים שונים של פגיעות ראש סגורות (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . עם זאת, חקירת פרמטרי ההשפעה על מודל ה-mTBI הלא מסובך, שעשוי לחקות מקרוב פגיעות ראש חוזרות ונשנות הקשורות לספורט וכתוצאה מכך לפגיעה תפקודית בשלב החריף וניוון מוחי בשלב הכרוני, לא נבדקה היטב.

דימות טנזור דיפוזיה (DTI), טכניקה המעריכה דיפוזיה של מולקולות מים, שימשה בדרך כלל במחקרים שחקרו את ההשפעות של mTBI. אניזוטרופיה חלקית (FA), מדד מפתח הנגזר מ-DTI, מכמת את מידת הקוהרנטיות של דיפוזיביות המים ומספק מידע לגבי הארגון המבני של אקסונים וצרורות סיבי עצב. הפרעה של ערכי FA בחומר הלבן (WM) הוצעה בעקבות mTBI במודלים שונים 8,10,11,15,16,17. בנוסף, דיפוזיות צירית (AD) ודיפוזיות רדיאלית (RD), המצביעות על שלמות אקסונלית ומיאלין, השתנו לאחר mTBI במחקרים פרה-קליניים 10,15,16,18,19,20. עם זאת, פערים בממצאי DTI בין מחקרים קודמים נובעים ככל הנראה משינויים בחומרת mTBI, הבדלים בפרמטרי השפעה, מודלים מגוונים של mTBI ונקודות זמן לא עקביות למעקב לאחר פציעה⁹.

מסמך הפרוטוקול הנוכחי, אם כן, שואף לבסס מודל חיות של mTBI שנועד להעריך את ההשפעות המצטברות של mTBI יחיד וחוזר על עצמו. שילבנו הערכות מקיפות ואורכיות, כולל הערכות של רווחת בעלי חיים, תוצאות התנהגותיות, פרמטרים של DTI ונפח קליפת המוח, כדי ללכוד שינויים דינמיים לאחר פציעה ולחקור את ההשפעות של פרמטרי השפעה שונים. על ידי הדגמת ליקוי תפקודי חריף ושינויים מיקרו-מבניים ארוכי טווח, מודל זה משכפל ביעילות את המאפיינים העיקריים של mTBI לא מסובך שלא טופלו במלואם במחקרים קודמים בבעלי חיים. כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט לפיתוח מודל mTBI לא מסובך באמצעות שיטת ירידה במשקל ראש סגור^{שונה 8,11} וביצוע הערכה אורכית בעקבות mTBI.

המחקר בוצע בהתאם להמלצות הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה) והנחיות מחקר בבעלי חיים: דיווח בניסויים in vivo. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג צ'יאו טונג. 20 בעלי חיים חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות (n = 4 לקבוצה): (i) פגיעה בודדת בקליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx/יחיד), (ii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של שעה אחת (SMCx/2 פגיעות/1 שעה), (iii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 10 דקות (SMCx/2 פגיעות/10 דקות), (iv) פגיעות כפולות במוח המרכזי עם מרווח של שעה אחת (מרכזי/2 פגיעות/שעה), ו-(5) קבוצת הדמה עם ניתוח בלבד אך ללא השפעה ישירה על הראש, להערכת תוצאות אורך (איור 1). יש לציין כי המרווחים בין הפציעות שנבחרו למחקר זה (מרווחים של שעה לעומת 10 דקות) תוכננו לחקות את ההשפעות התת-מוחיות החוזרות ונשנות 8,10,11,13,21, שיכולות להיות עד אלף פעמים בעונה אחת, שחווים הספורטאים העוסקים בספורט מגע ^22,23.

1. אינדוקציה של פגיעת ראש סגור (CHI)

הערה: חולדות ספראג-דולי זכרים בוגרים בגילאי 10 עד 12 שבועות ובמשקל של מעל 250 גרם שוכנים במחזור אור/חושך של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה). הוציאו את החולדה מהתא עד שהיא לא מגיבה לצביטה בכפה או בזנב.
2. הניחו את החולדה על כרית החימום.
   הערה: הפעל את כרית החימום במהלך הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדות.
3. הביאו את החולדה למסגרת סטריאוטקסית ואבטחו אותה בעזרת מוט שיניים. מתן איזופלורן ב-2% באמצעות חרוט האף המחובר עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך הניתוח.
4. מקם את מוטות האוזניים. ודא שהחולדה מרוכזת וסימטרית על המסגרת הסטריאוטקסית.
   הערה: כל ההליכים הכירורגיים צריכים להתבצע בתנאים אספטיים. המכשירים עוקרו לפני הניתוח באמצעות חיטוי קיטור, וקצותיהם עוקרו בנוסף עם מעקר חרוזים במהלך ההליך. כדי למנוע זיהום, הונח וילון כירורגי על החיה. המנתח חבש כובע כדי לכסות את שיערם, מסכה כדי לכסות את פניהם, והיה מצויד בחלוק מעבדה וכפפות כירורגיות במהלך ההליך²⁴.
5. שים את החיישן של אוקסימטר הדופק לכף האחורית של החיה כדי לעקוב אחר קצב הנשימה, קצב הלב, רמת החמצן בדם וטמפרטורת הגוף של החיה.
6. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של לידוקאין (20 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך צוואר החולדה כמשכך כאבים.
7. מרחו קרם להסרת שיער על ראש החיה והמתינו 3 דקות. נגב את הקרם עם 70% ספוגיות אלכוהול איזופרופיל.
8. נקו את האזור המגולח מספר פעמים בעזרת צמר גפן סטרילי ספוג ביוד. הסר את שאריות היוד באמצעות צמר גפן ספוג באתנול 70%.
9. צור חתך בקו האמצע באורך של כ-2-2.5 ס"מ בעור המגולח באמצעות להב כירורגי סטרילי כדי לגשת אל פני הגולגולת.
10. הסר את הרקמה על העצם באמצעות כרית כותנה כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את משטח הגולגולת באמצעות צמר גפן ספוג במי מלח 0.9%, ולאחר מכן נקו אותו עם כרית כותנה יבשה.
    הערה: כעת ניתן לזהות בקלות את תפרי הגולגולת וגם ברגמה ולמבדה.
11. זהה את הברגמה כנקודת הייחוס כדי לברר עוד יותר את אזור הפגיעה על סמך הקואורדינטה.
    הערה: בפרוטוקול זה, שתי קבוצות של קואורדינטות משמשות לאינדוקציה של CHI: (-2.5, -2.0) (2.5 מ"מ לרוחב 2.0 מ"מ אחורי הברגמה) על גבי קליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx), כמו גם (0,-3.0) על גבי המוח המרכזי (מרכזי).
12. זהה את הקואורדינטות הנבחרות על פני הגולגולת וצמד קסדת נירוסטה עגולה (קוטר 10 מ"מ ועובי 1 מ"מ) על השטח המיועד באמצעות צמנט דנטלי. הסר את כרית החימום ואת אוקסימטר הדופק.
13. הזיזו את המכשיר הסטריאוטקטי ואת החולדה על שולחן ההרמה (אורך 14 ס"מ, רוחב 8 ס"מ ועומק 6.15 ס"מ) מתחת לפגיעה ב-CHI.
14. הרם את גוף החולדה באמצעות ספוג קצף (19 ס"מ אורך, 10 ס"מ רוחב ו-4 ס"מ עומק, בצפיפות של 18 ק"ג/מ^"ק).
15. הסר את החולדה מסורגי האוזניים של המסגרת הסטריאוטקסית. השאירו את החולדה ללא תנועה על מוט השן המחובר לקונוס האף, והעבירו 2% איזופלורן. ודא שהראש והגוף מיושרים בכיוון הרוסטרלי-זנבי.
16. כוונן את שולחן ההרמה כדי להבטיח שאין רווח בין פגיעת ה-CHI לקסדה. כבה את איזופלורן 5 שניות ממש לפני הפגיעה.
    הערה: כדי לציין את רפלקס היישור עקב פגיעה מוחית, בוצעה הפסקה זמנית של איזופלורן²⁵.
17. זרוק פליז 600 גרם מגובה של 1 מ' דרך צינור נירוסטה (גובה 1 מ' עם קוטר פנימי של 20 מ"מ לפינוי עמוד ממשקולות פליז אל חלד) אל הפגיעה המאובטחת עם קצה עגול המכוון אל קסדת המתכת.
    הערה: בעלי חיים בקבוצת הדמה לא חוו פגיעה, מכיוון שטיפת הפליז שוחררה מבלי ליצור מגע עם הקסדה שעל ראש החולדה.
18. הורד את שולחן ההרמה. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום.
19. רשום את זמן רפלקס היישור, שהוא הזמן שבו החיה מנסה לעבור ממצב שכיבה למצב שכיבה^26,27.
    הערה: בעלי החיים שהיו נתונים ל-CHI החוזר ונשנה הורדמו שוב 3 דקות לפני הפגיעה^השנייה . עבור בעלי החיים בקבוצת SMCx/כפול/10 דקות שלא התהפכו בחזרה למצב הנטייה בזמן, הזמן המקביל של רפלקס היישור נרשם כ-420 שניות.
20. לאחר הקלטת רפלקס היישור, יש להרדים את החולדה באיזופלורן שוב באמצעות שלב 1.1.
21. שתק את החולדה עם המסגרת הסטריאוטקסית באמצעות שלב 1.2.
    הערה: לאחר אישור יציבות הקסדה על גבי הגולגולת, חזור שוב על שלבים 1.13-1.17 כדי לבצע את הפגיעה^השנייה .
22. הסר את הקסדה. הסר את כל רקמת החיבור והמלט על גבי הגולגולת.
23. מכסים את הגולגולת במלט הדנטלי ומניחים לה להתייבש. בדוק שהמלט הדנטלי נוקשה וקשה באמצעות גב הפינצטה.
    הערה: המלט הדנטלי הונח על גבי הגולגולת כדי למנוע חפצי רגישות הנגרמים על ידי ממשקי גולגולת-אוויר או גולגולת-דם בין הגולגולת לקרקפת לאחר הניתוח.
24. סגור את החתך באמצעות 4-0 תפרי ניילון כירורגיים עם 4-5 קשרים עצמאיים.
    הערה: אורך הפצע הוא כ-2-2.5 ס"מ. ודא כי לתפרי הניתוח אין פעולה נימית והם עשויים מחומר משי או ניילון. אין לתפור את החתך באמצעות קשר אחד בודד כדי למנוע את פתיחת הפצע על ידי גירוד החיה.
25. מרחו אנטיביוטיקה מקומית (קרם דרמנסט) על מקום הניתוח כדי למנוע זיהומים.
26. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של קרפרופן (50 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך הצוואר כמשככי כאבים לאחר הניתוח.
27. הניחו את החולדה בכלוב נקי על כרית חימום עד שהיא חוזרת להכרה. ברגע שהחולדה יושבת זקופה, החזירו אותה לכלוב הביתי.
28. יש לתת דרך הפה 5 מ"ל של אצטמינופן (24 מ"ג/מ"ל) מעורבב ב-200 מ"ל מים לבעל החיים מדי יום כמשכך כאבים במשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח.

2. הדמיית תהודה מגנטית (MRI)

הערה: תמונה משוקללת T2 והדמיית דיפוזיה-טנזור מבוצעות באמצעות מערכת PET/MR 7T עוקבת לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר הפציעה (איור 1). MRI בסיסי בוצע תוך שבוע לפני הליך CHI. עבור ההערכות ב-1 ו-50 יום לאחר ה-CHI, ההערכות ההתנהגותיות נערכו בבוקר, ולאחר מכן סריקות MRI אחר הצהריים באותו היום.

1. להרדים את החולדה בתא אינדוקציה קטן מלא בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה).
2. ברגע שהחולדה אינה מגיבה לצביטה בכפה או בזנב, השהה זמנית את ההרדמה בעת העברתה לעריסת החיה במצב נטייה עם הראש תחילה.
3. מקם את החולדה במחזיק הראש המחובר עם חרוט אף, ומספק 2% איזופלורן עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך קליטת התמונה.
4. קבע את הראש בעזרת פיסת סרט קטנה כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה.
   הערה: מרחו מעט משחת שיניים על ראש החולדה ביום הראשון לאחר ה-CHI כדי למנוע חפצי רגישות מגנטית עקב הסרת הקרקפת^28,29.
5. הנח כרית לחץ מתחת לבית החזה של החולדה כדי לפקח על הנשימה. הדביקו את תפסי האוקסימטר לגפה האחורית כדי לעקוב אחר קצב הלב.
6. הכנס את הגשושית הרקטלית כדי למדוד את טמפרטורת פי הטבעת. מכסים את החולדה בשמיכת חימום במים חמים במחזור ועטיפת רקמות במהלך הניסוי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
   הערה: לאורך כל הניסוי, עקוב אחר מצבים פיזיולוגיים, כולל דופק, קצב נשימה וטמפרטורת פי הטבעת. לפני הסריקה, בדוק את כל האותות הפיזיולוגיים של החולדה כדי להבטיח את איכות מוניטור הסימנים החיוניים.
7. השתמש במערכת מיקום הלייזר של סורק PET/MR כדי לסמן את מרכז הראש ליישור מדויק.
8. העבר את החיה לתוך קדח ה-MRI באופן אוטומטי באמצעות מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת עד שמרכז הראש מתיישר עם מרכז האיזו של הסורק.
   הערה: מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת המשולבת במערכת PET/MR מבטיחה מיקום מדויק של בעלי חיים ומייעלת את זרימת העבודה בעת מעבר בין שיטות הדמיה.
9. השג רצף MRI.
   1. ביצוע לוקליזציה ראשונית והתאמה כוללת.
   2. השתמש בפרוסה הסגיטלית האמצעית ויישר את הפרוסה^ה-8 מהחלק הקדמי עם הפרוסה של הקומיסורה הקדמית.
      הערה: פרוסות העטרה ממוקמות בניצב למישור האופקי המוגדר על ידי הקו המחבר בין הקומיסורה הקדמית לבסיס המוח הקטן, המתאים לזווית של כ-15 מעלות ביחס לציר הארוך של הקורפוס קלוסום. הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE עבור הפרוסה הסגיטלית האמצעית הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 2500 אלפיות השנייה, זמן הד (TE) = 44 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) = 3.5 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 1, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 קילו-הרץ, מספר ממוצעים = 1, זמן הרכישה = 1 דקה 20 שניות.
   3. השתמש ברכישה מהירה עם שיפור הרפיה (RARE) עם דיכוי שומן ורצועת רוויה מתחת למוח כדי לקבל תמונות משוקללות T2 עבור התייחסות אנטומית (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 3600 ms, זמן הד (TE) = 40 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 kHz, מספר ממוצעים = 8, זמן הרכישה = 7 דקות 40 שניות.
   4. השתמש ב-EPI ספין-הד של 4 זריקות כדי לרכוש תמונות טנזור דיפוזיה (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת ה-DTI הם כדלקמן: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 96 96, עובי = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, משך הדופק (δ) = 5 ms, זמן בין שני הפולסים (Δ) = 15 ms, מספר B0 = 5, מספר כיוונים = 30, ערך b = 1000 s/mm³, רוחב פס = 150 קילו-הרץ, מספר הממוצע = 4, זמן הרכישה = 14 דקות.
   5. סיים את פרוטוקול הסריקה. החלק את עריסת החיה החוצה מהמגנט. הסר את החיה מהעריסה.
   6. העבירו את החולדה לכלוב נקי עם כרית חימום מתחתיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה. החזירו את החולדה לכלוב הבית שלה ברגע שהיא חוזרת להכרה.
10. עיבוד מקדים של תמונה
    הערה: השתמש בתוכנת MRtrix3, מיפוי פרמטרי סטטיסטי (SPM) וסקריפטים מותאמים אישית של MATLAB לעיבוד וניתוח נתונים.
    1. הפחתת רעש של תמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. הסר את חפצי הצלצול של גיב מתמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. רשום תמונות DTI לתמונות משוקללות T2 של הנושא היחיד על פני סריקות אורך באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m).
    4. בצע הפשטת גולגולת על תמונות משוקללות T2 על ידי עיצוב ידני של אזור המוח פרוסה אחר פרוסה, ולאחר מכן הסרת פיקסלים בעוצמה מתחת לסף המחושב שנקבע על ידי שיטת אוטסו³¹ (סקריפט MATLAB מותאם אישית thr_otsu2.m).
    5. לבצע רישום צולב בין בעלי חיים באותה קבוצת ניסוי באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m). החל את מסכת המוח על תמונות ה-DTI המתאימות.
       הערה: הפשטת הגולגולת מתבצעת כדי לקצר את זמן העיבוד של המחשב.
    6. חשב מפות טנזור על סמך DTI (סקריפט MATLAB מותאם אישית, tensormap.m).
    7. חשב מפות FA (סקריפט MATLAB מותאם אישית, calFA.m)
       הערה: כל הסקריפטים המותאמים אישית של MATLAB זמינים דרך מסד הנתונים הבא (https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.57770/9ZESXD).
11. ניתוח תמונה-FA
    1. צייר אזורי עניין (ROIs) בקליפת המוח ובקורפוס קלוסום (CC) עבור שלוש פרוסות התמונה העוקבות מתחת לקואורדינטות של CHI.
       הערה: כל ההחזר על ההשקעה צויר באופן ידני ונבדק ויזואלית לאיתור שגיאות גסות על ידי 2 חוקרים מנוסים עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. חלץ וממוצע את ערך ה-FA מהחזר על ההשקעה.
       הערה: עבור הקורפוס קלוסום מתחת לקליפת המוח, פיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 לא נכללו בהחזר ההשקעה שנבחר כדי למנוע השפעות נפח חלקיות. עבור קליפת המוח, כל הפיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 בהחזר ההשקעה גויסו לניתוח.
12. ניתוח תמונה - נפח
    1. צייר ידנית החזר ROI המכסים את האזורים בקליפת המוח עבור 11 פרוסות תמונה רצופות ב-Bregma -7 עד +3 מ"מ.
       הערה: כל ההחזר על ההשקעה נלקח באופן ידני על ידי 2 חוקרים מנוסים שהיו עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. סכם את סך הפיקסלים של ההחזר על ההשקעה על פני פרוסות והפוך אותם לנפח על ידי הכפלת עובי הפרוסה (1 מ"מ).
    3. נרמל את עוצמת הקול בקליפת המוח לאחר CHI עם הנפח המתאים לפני CHI של כל חיה.
       הערה: נרמל את הנתונים כדי לבטל הבדלים אינדיבידואליים בנפח המוח בין בעלי חיים לפני ההצגה.

3. הערכת התנהגות

הערה: הניסויים ההתנהגותיים מבוצעים באמצעות מבחן שיווי משקל הליכת אלומה ו-mNSS לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר CHI (איור 1). כל ההערכה בוצעה על ידי לפחות שני משקיפים כדי להבטיח את הדיוק, העקביות והאובייקטיביות של הנתונים שנאספו.

1. מבחן איזון הליכה בקורה
   1. הפעל את מצלמת הווידיאו והפעל את הטיימר.
   2. הניחו את החולדות בקצה אחד של קורת האיזון (3 ס"מ עומק, 3 ס"מ רוחב, 80 ס"מ אורך ו-60 ס"מ מעל הרצפה).
   3. עצור את הטיימר ברגע שהחולדה משלימה הלוך ושוב, נופלת או קופאת מעל 3 דקות.
      1. במהלך הניסוי, התבונן במצב החיה לצורך ההערכה באמצעות mNSS 11,32,33,34. פעל לפי התקנים הבאים להערכה:
      2. אם החולדה שומרת על שיווי משקל עם יציבה יציבה על הקורה, הקצה ציון 0.
      3. אם החולדה תופסת את צד הקורה, הקצה ציון של 1.
      4. אם החולדה נופלת עם איבר אחד מהקורה, הקצה ציון של 2.
      5. אם החולדה נופלת עם שתי גפיים או מסתובבת על הקורה (>60 שניות), הקצה ציון 3.
      6. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>40 שניות), הקצה ציון של 4.
      7. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>20 שניות), הקצה ציון 5.
      8. אם החולדה לא מנסה לאזן או להיתלות על הקורה ונופלת תוך 20 שניות, הקצה ציון של 6.
      9. אם החולדה לא מצליחה להשלים את המשימה, קחו בחשבון שהיא לקחה את הזמן המקסימלי של 3 דקות והקצו לה ציון 6.
   4. קבעו ימי בדיקה בנקודות זמן ספציפיות.
      הערה: אל תכלול חולדות שלא השלימו את הליכת הקורה הלוך ושוב במשך שני ניסויים לפני CHI מהניתוח הבא והערכת התנהגות מעקב.
2. ציון חומרה נוירולוגי שונה (mNSS)
   הערה: הערכת mNSS כוללת בדיקות מוטוריות, בדיקות חושיות, היעדר רפלקס, תנועות חריגות, איזון קרן והליכה על הרצפה ^32,33, שבוצעה במהירות על בסיס יומי.
   1. בצע בדיקות מוטוריות.
      1. הרם את החולדה בבסיס הזנב והתבונן ברפלקסים של הגפיים שלה במשך כ-15 שניות כדי להעריך את הכיפוף וההארכה הנכונים.
      2. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה הקדמית, הקצה ציון 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      3. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה האחורית, הקצה ציון של 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      4. אם הראש נע >10° לציר האנכי תוך 30 שניות לאחר הרמת החולדה בזנב, הקצה ציון 0. אם לא, הקצה ציון של 1.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   2. בצע בדיקות מיקום גפיים.
      הערה: בדיקת המיקום מבוצעת כדי להעריך את התיאום בין תפקוד חושי (חזותי, מישוש ופרופריוספציה) לבין תפקוד מוטורי.
      1. הורד לאט את החולדה לכיוון פני השולחן. שימו לב אם כפות החולדות הגיעו ונמתחו לעבר פני השטח.
      2. אם החולדות הגיעו לפני השטח עם שתי הגפיים מתוחות וקדימה, הקצה ציון 0. אם יש עיכוב או אין תגובה, הקצה ציון של 1.
      3. הניחו את החולדה על פני השטח ומשכו את הכפה אל קצה השולחן. שים לב אם כפו חוזרת למצב רגיל על פני השולחן.
      4. אם נצפות תגובות מיקום מיידיות ונורמליות, הקצה ציון 0. אם נצפות תגובות מיקום מאוחרות, הקצה ציון של 1. אם אין תגובה, הקצה ציון של 2.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   3. התבונן בהיעדר משקף ותנועות חריגות.
      1. שימו לב לנענועי ראש כדי להעריך את רפלקס האפרכסת בעת נגיעה בבשר השמיעה עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      2. אם נצפה רפלקס נורמלי, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      3. העריכו את נוכחות רפלקס הקרנית על ידי נגיעה בקרנית עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      4. אם מתקבלת תגובה נורמלית, הקצה ציון 0. אם לא מתעוררת תגובה למצמוץ, הקצה ציון של 1.
      5. עשו מחיאות כפיים קצרות וחזקות. שימו לב לנוכחות רפלקס הבהלה.
      6. אם נצפה רפלקס, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      7. שימו לב אם לחולדה יש התקפים, מיוקלונוס או מיודיסטוניה.
      8. אם אחד מהם מתרחש, הקצה ציון של 1.
         הערה: מקסימום 4 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   4. בצע את בדיקת איזון האלומה, כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.1).
      הערה: מקסימום 6 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   5. בצע מבחן הליכה על הרצפה.
      1. הכינו את זירת השטח הפתוח (75 ס"מ אורך, 50 ס"מ רוחב ו-40 ס"מ עומק). ודא שהוא נקי וללא כל רמזי ריח קודמים.
      2. מקמו חולדה במרכז זירת השדה הפתוח והתבוננו כיצד החולדה הולכת בזירה.
      3. אם החולדה מבצעת הליכה רגילה, הקצה ציון 0.
      4. אם החולדה לא יכולה ללכת ישר, הקצה ציון של 1.
      5. אם החולדה נופלת לצד הפרטי לאחר הנחתה על הרצפה, הקצה ציון 3.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   6. סכם את כל התוצאות; הציון המקסימלי האפשרי הוא 18.
      הערה: הציון הגבוה יותר מצביע על תוצאה גרועה יותר.

4. אימונוהיסטולוגיה

1. בצע זלוף טרנס-קרדיולוגי³⁵.
   הערה: זלוף טרנס-קרדיולוגי מבוצע לאחר סריקת ה-MRI 50 יום לאחר ה-CHI (איור 1).
   1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה עם איזופלורן (5%) עד שהיא לא מגיבה לכפה או לצביטה בזנב.
   2. יש לתת 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף של זולטיל (50 מ"ג/מ"ל) ו-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קסילזין (רומפון, 23.32 מ"ג/מ"ל) באמצעות הזרקה תוך צפקית להרדמה עמוקה.
   3. הניחו את החולדה במצב שכיבה.
   4. בצע חתך רוחבי באורך של כ-4-5 ס"מ מתחת לבית החזה בעזרת מספריים.
   5. אתר את הסרעפת וחתוך אותה כדי לחשוף את הלב.
   6. השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להדק את עורק הריאה ולאחר מכן בצע חתך באורך של כ-0.5-1 ס"מ בפרוזדור הימני.
   7. חבר את המחט לצינור המחובר למשאבת העירוי.
   8. הכנס את המחט לחדר השמאלי.
   9. שטפו את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 0.9% מי מלח עד לניקוי הדם.
   10. לחלחל את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע.
   11. הסר את ראש החולדה, וקלף בזהירות את רקמת המוח מהגולגולת.
   12. שמור את המוח בכ-20 מ"ל של 4% PFA בבקבוק למשך 48 שעות לאחר הקיבוע.
2. בצע עיבוד רקמות וצביעה IHC ^36,37.
   הערה: בצע צביעה אימונוהיסטוכימית על קטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
   1. השתמש בקטעי רקמה קבועים בפורמלין ובפרפין.
   2. בצע דה-פראפיניזציה וטפל בשקופיות עם 3% H₂O₂ כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. בצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר ציטראט ב-90 מעלות צלזיוס.
   3. בצע צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
      הערה: הליכי הצביעה מתבצעים בהתאם להמלצות היצרן.
   4. השתמש בהמטוקסילין כדי להכתים דגימות.
   5. הרכיבו דגימות עם מגיב נגד דהייה.
   6. השתמש בנוגדנים לחלבון חומצי סיבי (GFAP) נגד גליה לצביעה אימונוהיסטוכימית.
   7. רכשו את התמונות של החזר ROI באמצעות סורק שקופיות מיקרוסקופ אור (איור 6).

5. ניתוח סטטיסטי של התנהגות ותוצאות תדמיתיות

הערה: במחקר הנוכחי בוצע ניתוח סטטיסטי ב-SPSS; עם זאת, ניתן לבצע את הניתוח הסטטיסטי בארגזי כלים סטטיסטיים אחרים.

1. טען את הנתונים בפורמט הרחב בקובץ SPSS *.sav.
2. לבצע ניתוח מדידות חוזרות של שונות (ANOVA) כדי להשוות את תוצאות ההתנהגות (משקל מנורמל, mNSS ומשך הליכת האלומה) והתמונה (ערכי FA בקליפת המוח וב-CC) לאורך זמן בין קבוצות.
   1. לחץ על נתח > מודל ליניארי כללי > מדידות חוזרות.
   2. הקצה שם בתיבה שם גורם בתוך הנושא (למשל, זמן) ושים '3' בתיבה מספר רמות (שלוש רמות עם נקודות זמן שונות למעקב). הקצה שם בתיבה Measure Name (לדוגמה, mNSS) בתיבת הדו-שיח Repeated Measures Define Factor(s).
   3. טען את המשתנים בתוך הנבדק (נתונים שנרכשו בטרום, D1 ו-D50 לאחר CHI) שיש לבדוק וציין את הגורם בין הנבדקים (למשל, קבוצות בעלי חיים עם פרמטרי השפעה שונים) בתיבת הדו-שיח מדידות חוזרות .
   4. בחר בונפרוני כמבחן פוסט הוק עבור גורמי (ים) (למשל, קבוצות בעלי חיים) בתיבת הדו-שיח של השוואות מרובות פוסט-הוק עבור אמצעים נצפים .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, השגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/3) עבור ההשוואות לאורך זמן. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).
3. בצע ניתוח ANOVA חד כיווני כדי להשוות את רפלקס היישור והשינוי בנפח קליפת המוח בין הקבוצות.
   1. לחץ על נתח > השווה אמצעים > ANOVA חד-כיווני.
   2. טען את המשתנים (רפלקס יישור ושינוי נפח קליפת המוח) ברשימה התלויה ואת הקבוצות כגורם בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיוונית .
   3. בחר Bonferroni כבדיקת פוסט הוק בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיווני: השוואות מרובות פוסט הוק .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, שגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/5) עבור ההשוואות בין הקבוצות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).

איור 2 מציג MRI אורכי מבעל חיים מייצג עם CHI מזויף וחוזר ב-SMCx. לא נמצא שבר משמעותי בגולגולת או חבלה מוחית בתמונות משוקללות T2 ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. לא נמצאה בצקת או עיוות משמעותי של זיכרון העבודה במפות FA ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. כל בעלי החיים שנחשפו ל-CHI במחקר זה שרדו את כל משך הניסוי של 50 יום, והפגינו תמותה נמוכה (0-5%)⁷ במודל CHI.

מידת הפגיעה בתודעה מיד לאחר הפגיעה המוחית הוערכה על ידי אובדן רפלקס הנכון, הנטייה הפנימית לתקן את מיקומו בעצמו, של בעלי חיים. בהשוואה ל-CHI דמה ויחיד ב-SMCx, הזמן להחזיר את רפלקס היישור גדל בחיות אחרי CHI חוזר (איור 3A). הרווחה הכללית של בעלי החיים לאחר CHI באה לידי ביטוי בשינוי במשקל הגוף המנורמל וב-mNSS. לא נצפתה ירידה משמעותית במשקל לאחר CHI בקרב הקבוצות (איור 3B). בעוד שציון mNSS גבוה יותר נמצא ביום ה-50 לאחר CHI יחיד, עלייה משמעותית בציון mNSS נצפתה ביום הראשון לאחר CHI חוזר ונשנה ונשמרה גבוהה עד היום ה-50 ללא קשר לחומרת ואתר הפגיעה (איור 3C). ה-mNSS המוגבר המושרה על ידי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי ירד ביום ה-50, נמוך משמעותית מה-CHI המקביל ב-SMCx. שיווי המשקל והתפקוד המוטורי המתואם בחולדות לאחר CHI הוערכו על ידי מבחן הליכת האלומה. עלייה משמעותית במשך ההליכה נצפתה ביום הראשון לאחר CHI חוזר ונשנה ונשמרה גבוהה עד היום ה-50, ללא קשר לחומרת הפגיעה ולאתר הפגיעה (איור 3D). משך הליכת הקרן המוארכת המושרה על ידי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי ירד ביום 50, קצר משמעותית מה-CHI המקביל ב-SMCx.

ירידה משמעותית בנפח קליפת המוח נצפתה ב-50 יום לאחר CHI (איור 4A). נפחי קליפת המוח ביום ה-50 היו 99.63% ±-2.15%, 95.98% ±-1.65%, 92.26% ±-2.22% ו-90.28% ±-1.17% מהנפח הבסיסי, בהתאמה, ב-CHI הדמה ולאחר CHI יחיד וחוזר עם מרווחים של שעה ו-10 דקות ב-SMCx (איור 4B). נפח קליפת המוח ביום ה-50 היה 91.54% ±-1.98% מהנפח הבסיסי לאחר CHI חוזר עם מרווח של שעה במוח המרכזי. בהשוואה לקבוצת הדמה, נצפה אובדן משמעותי בקליפת המוח לאחר CHI. בהשוואה לקבוצת CHI בודדת, נצפה אובדן משמעותי בקליפת המוח לאחר CHI חוזר. ירידה משמעותית בנפח קליפת המוח נצפתה בפרוסות בברגמה -4 עד +0 ובברגמה -5 עד +1 לאחר CHI חוזר במרווחים של שעה ו-10 דקות, בהתאמה (איור 4C). בהשוואה בין חיות CHI עם אתרי פגיעה שונים, נפח קליפת המוח נמצא קטן משמעותית רק בפרוסה בברגמה 0 לאחר CHI במרכז המוח. בעוד שדווח על ניוון משמעותי בקליפת המוח^ב-11 המחקרים הקודמים ובמחקרים הנוכחיים, תמונות משוקללות T2 עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הנרכשות באופן אידיאלי בתלת מימד, מוצעות לניתוח נפחי מדויק. בנוסף, מחקרים עתידיים המיישמים גישת רישום דיפאומורפית מבוססת אטלס³⁸ עשויים לטפל טוב יותר בשינויים המוחיים האזוריים הקשורים לפגיעה מוחית קלה.

ערכי FA קליפת המוח במהלך סריקות MRI אורכיות חושבו כדי להצביע על השינויים המיקרו-מבניים הטנטטיביים לאחר CHI. לאחר CHI בודד ב-SMCx, לא נצפו שינויים משמעותיים ב-FA מתחת לאתר הפגיעה. לאחר CHI חוזר ב-SMCx, נצפתה עלייה משמעותית ב-IPSI-נגעי בקליפת המוח ביום 50 בהשוואה ל-CHI חוזר יום אחד לאחר החזרה עם מרווח של שעה (איור 5A). בנוסף, הפחתה משמעותית של FA בקליפת המוח ה-ipsi-נגעית הודגמה ביום אחד לאחר CHI חוזר במרווח של 10 דקות, שהוא נמוך משמעותית מזה שלאחר CHI בודד וחוזר עם מרווח של שעה. CHI ב-SMCx לא גרם לשינויים משמעותיים ב-FA בקליפת המוח המרכזית (איור 5B). אחרי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי, נצפתה עלייה משמעותית של FA בקליפת המוח מתחת למוח המרכזי בקליפת המוח ביום ה-50 בהשוואה לנקודת ההתחלה וביום הראשון (איור 5B).

לאחר CHI בודד ב-SMCx, לא נצפו שינויים משמעותיים ב-FA ב-CC מתחת ל-SMCx ה-ipsi-נגעי (איור 5A). לאחר CHI חוזר ב-SMCx, נצפתה ירידה משמעותית של FA נגעי ב-CC בקליפת המוח ביום 50 בהשוואה ל-CHI חוזר יום אחד לאחר החזרה במרווח של שעה (איור 5A). ירידה של FA ב-CC הנגעי של ipsi ביום 1 ולאחר מכן התאוששה ביום 50 נצפתה לאחר CHI חוזר עם מרווח של 10 דקות. ב-CC ה-ipsi-נגעי, לאחר CHI חוזר עם מרווח של 10 דקות, הוצג ערך FA נמוך משמעותית ביום הראשון בהשוואה ל-CHI חוזר במרווח של שעה; ערך FA גבוה משמעותית ביום 50 הוצג בהשוואה ל-CHI מזויף, יחיד וחוזר על עצמו במרווח של שעה. לאחר CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי, נצפתה עלייה משמעותית של FA ב-CC מתחת ל-ipsi-Lesional SMCx ביום הראשון בהשוואה ל-CHI ב-SMCx וביום ה-50 בהשוואה לקבוצת הדמה (איור 5A).

דלקת עצבית לאחר CHI הוערכה על ידי ביטוי GFAP ביום 50 לאחר הפציעה. התוצאות של צביעה חיסונית הראו שאסטרוציטים הצטברו ב-SMCx ה-ipsilesional אחרי CHI, ללא קשר לחומרה ולמקום הפגיעה (איור 6).

איור 1: סכמטי של תכנון ניסוי. סכימות המציגות את השלבים המרכזיים, כולל השראת פציעת ראש סגורה וציר הזמן המתאים לכל הערכה. סריקות MRI והערכות התנהגותיות לפני CHI נערכו תוך 7 ימים לפני הניתוח. הזמן להחזרת רפלקס היישור הוערך כמידת הפגיעה בתודעה. MRI אורכי ונתוני התנהגות נאספו ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. חולדות הוקרבו עם השלמת כל הניסויים, ואחריהם אימונוהיסטולוגיה. קיצור: SMCx/single = פגיעה בודדת בקליפת המוח התחושתית-מוטורית; SMCx/2 פגיעות/1 h = פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 1 שעות; SMCx/2 פגיעות/10 דקות = פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 10 דקות; מרכז/2 פגיעות/שעה = פגיעות כפולות במוח המרכזי במרווח של שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות MR מייצגות לאחר CHI. התמונות המשוקללות T2 (השורה העליונה) ומפות FA (השורה התחתונה) מהחיה הייצוגית לפני ובימים 1 ו-50 לאחר דמה ו-CHI כפול ב-SMCx במרווח של 10 דקות. אין חבלה מוקדית בתמונות משוקללות T2 לאחר CHI ניסיוני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ליקויים התנהגותיים אחרי CHI עם פרמטרי השפעה שונים. (A) הזמן להחזיר את רפלקס היישור לאחר הפגיעה האחרונה. זמן רפלקס היישור גדל לאחר CHI חוזר ב-SMCx. (B) אין הבדל משמעותי במשקל הגוף המנורמל לאחר CHI (מנורמל לקו הבסיס שלפני CHI) בין הקבוצות. עלייה ב-(C) mNSS ו-(D) משך ההליכה על קרן נצפתה לאחר CHI חוזר. בעוד ש-mNSS ומשך ההליכה על הקרן נותרו גבוהים לאחר CHI ב-SMCx, הם התאוששו לאחר CHI במוח המרכזי ביום ה-50. ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni לזמן רפלקס התיקון; ANOVA חוזר עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni עבור המשקל המנורמל, mNSS ומשך התעוררות האלומה: *, p < .017 בין נקודות זמן; +, עמ' <.05 מול שאם; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, p <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/1 שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניוון קליפת המוח ב-50 יום לאחר CHI עם פרמטרי השפעה שונים. (A) יישור פרוסה על התמונה הסגיטלית האמצעית. הקו הכחול מציין את המישור האופקי המחבר בין הקומיסורה הקדמית לבסיס המוח הקטן; קו הקו המקווקו מראה את הציר הארוך של הקורפוס קלוסום. (B) החזר ROI קליפת המוח להמחשה (אדום) על תמונות משוקללות T2 בפרוסות התמונה המייצגות למדידת נפח קליפת המוח. (C) השינוי בנפח קליפת המוח אחרי CHI יוצג כאחוז מנפח הבסיס בין פרוסות שונות בברגמה -7 עד +3 מ"מ. הודגמה ירידה בנפח קליפת המוח ב-50 יום לאחר CHI ותלויה בפרמטר ההשפעה. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעי ± std. ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni: +, p < .05 לעומת זיוף; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, עמ' <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/1 שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שינויים אורכיים ב-FA לאחר CHI עם פרמטרי השפעה שונים. החזר ROI מפולח אוטומטית הוא קליפת המוח (ירוק) וקורפוס קלוסום (CC) (אדום) עמוק לאתר הפגיעה במוח המרכזי (A) SMCx ו-(B). הכניסה מציגה את תמונת המוח התלת-ממדית עם הפרוסה מתחת לאתר הפגיעה. מעקב אורכי של ערכי FA שנרכשו לפני ו-1 ו-50 יום לאחר CHI הוצגו כממוצע ± std. שינוי ב-FA לאחר CHI חוזר היה בולט ותלוי בפרמטר ההשפעה. ANOVA חוזר עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni: *, p < .05 בין נקודות זמן; +, p <.05 לעומת שאם; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, עמ' <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/שעה אחת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דלקת עצבית הנגרמת על ידי CHI 50 יום לאחר הפציעה בקליפת המוח מתחת לאתר הפגיעה. תמונות מייצגות של קליפת המוח מתחת לאתר הפגיעה עם צביעת GFAP. הצטברות של אסטרוציטים (חיצים) בקליפת המוח נצפתה אחרי CHI. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

מחקר זה נועד לבסס מודל של בעלי חיים של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) כדי להעריך את ההשפעות המצטברות של פגיעות בודדות וחוזרות על עצמן, כמו גם את התוצאות של השפעות על אזורי מוח שונים. מודל פציעת הראש הסגור (CHI), המותאם מפרדיגמת פציעות ירידה במשקל בראש סגור, תוכנן לחקות זעזועי מוח שחווים בדרך כלל ספורטאים ואנשים עם הגנה על קסדה. מודל זה ממזער נזק מוחי מוקדי תוך שהוא מאפשר מניפולציה מדויקת של פרמטרי השפעה מרכזיים, כולל מספר הפגיעות, מרווחי הפציעות ואזורי הפגיעה. הממצאים כאן הראו כי פרמטרים אלה השפיעו באופן משמעותי על התקדמות התוצאות ההתנהגותיות וערכי האניזוטרופיה החלקית (FA). יש לציין כי ניוון קליפת המוח המשמעותי, מאפיין מובהק של אנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE), נצפתה במהלך השלב הכרוני, ללא קשר לעומס הפגיעה או למיקום. מודל ניסיוני זה מספק מסגרת חזקה למחקרי אורך של שינויים תפקודיים ומיקרו-מבניים בעקבות mTBI לא מסובך, תוך התייחסות לפערים במודלים קודמים של בעלי חיים.

כדי לשכפל mTBI שנצפה בתרחישים קליניים כגון ספורט מגע או תאונות אופנוע, עיצובים מגוונים של קסדות מכרסמים יושמו במודלים שונים של בעלי חיים⁷. הפגיעה בגולגולת או בראש הסגור גורמת בדרך כלל לפגיעה מוחית קלה ומפוזרת יותר בהשוואה לאלה המכוונות למשטח המוח החשוף^15,39. עם זאת, הוכר כי נצפתה שונות גדולה בתוצאה בין בעלי חיים בעת שימוש בקסדות מודבקות, בעיקר בשל חוסר העקביות של מיקום אתר הפגיעה⁴⁰. מודל ה-CHI במחקר זה שונה ממודל ירידת המשקל של מרמרו, שבו הונח דיסק מתכת מעל הגולגולת⁴¹. חידדנו עוד יותר את המתודולוגיה המקורית על ידי שימוש בדיסק דק יותר (1 מ"מ) ושילוב קצה פגיעה קבוע כדי להפחית את הסיכון לשבר בגולגולת. תוצאות המיקרו-טומוגרפיה הממוחשבת הקודמות שלנו (CT) אישרו את היעדרם של מיקרו-שברים ניתנים להבחנה לאחר CHI¹¹. יתרון נוסף של שימוש בקצה פגיעה קבוע המכוון לכיוון הדיסק המלט הוא שהוא מאפשר שליטה מדויקת על אתר הפגיעה, ומאפשר לנו לחקור באופן שיטתי את השפעת אתר הפגיעה על תוצאות הניסוי. יש לציין כי חתך הקרקפת וההרדמה במודל הנוכחי עשויים לגרום לתגובות חיסוניות ודלקתיות נוספות, במיוחד בשלב החריף. שימוש בבעלי חיים ערים ושלמים בקרקפת יכול לעזור להפחית את ההשפעות הללו ולשפר את יכולת התרגום למקרים קליניים של פגיעה מוחית תת-מוחית¹⁰.

ההשפעה המצטברת של CHI על התוצאה ההתנהגותית והתמונה הודגמה על ידי ציוני mNSS גבוהים משמעותית, משך זמן ארוך יותר להשלמת משימות הליכה על קרן (איור 3), נפח קליפת המוח קטן יותר (איור 4B) ושינוי בערכי FA (איור 5A) בחיות שעקבו אחר rCHI בהשוואה לקבוצות דמה או פציעה בודדת. יתר על כן, ערכי FA נמוכים משמעותית בקליפת המוח וב-CC ביום הראשון לאחר הפציעה (איור 5A) ונפח קליפת המוח מופחת ביום ה-50 (איור 4B) הוצגו בבעלי חיים שנחשפו ל-CHI חוזר ונשנה במרווח של 10 דקות בהשוואה לאלה עם מרווח של שעה, מה שמרמז על תוצאות גרועות יותר עם מרווחים קצרים יותר בין פציעות. כאשר הפגיעה החוזרת בוצעה במרווח של שעה, חיות עם פגיעות מעל SMCx הראו ציוני mNSS גבוהים יותר (איור 3C) ומשכי הליכה ארוכים יותר בהשוואה לפגיעות על המוח המרכזי, מה שמצביע על כך שתוצאות ה-CHI תלויות באתר הפגיעה. בנוסף לשינוי ב-FA, הוצעו ירידה של AD ב-WM ^10,11,19 ועלייה של RD ב-GM 10,16,18 לאחר CHI. מחקר עתידי המשלב ניתוח מקיף של הספקטרום המלא של פרמטרי DTI יכול לספק תובנות עמוקות יותר לגבי האופן שבו פרמטרי השפעה שונים משפיעים על ההתקדמות והתוצאות של CHI. המודל המוצע עשוי להיות מיושם גם על חולדות ועכברים מתבגרים. עם זאת, התאמות נוספות, כולל גובה ומשקל הטיפות, כמו גם ממד הקסדה, מצדיקות חקירה ואימות מראש.

רפלקס הנכון, התנהגות חייתית מולדת המאופיינת ביכולת להתמצא מחדש ולעמוד על רגליהם באופן ספונטני, משמש כמדד חלופי להערכת אובדן הכרה (LOC) בבני אדם⁴². על מנת לתעד את הזמן שלוקח להחזיר את רפלקס היישור לאחר CHI, יש להשתמש בהרדמה בשאיפה במקום בחומרי הרדמה הניתנים להזרקה במהלך השראת CHI. יתר על כן, יש צורך בהפסקה זמנית של איזופלורן מיד לפני CHI²⁵. מומלץ לעקוב אחר שינויים במשקל הגוף לאחר TBI כדי להצביע על ליקוי כללי⁴³. אין שינוי משמעותי במשקל הגוף המנורמל לאחר CHI מצביע על הקלות של הפגיעה המוחית במודל המתואר כאן. NSS שונה ומשך הליכת קרן שימשו באופן נרחב להערכת רווחה כללית ותפקוד וסטיבולומוטורי לאחר פגיעה מוחית⁴⁴. בהתחשב בכך שהערכה התנהגותית וניסויי MRI בוצעו באותו יום לאחר ה-CHI, המבחנים ההתנהגותיים נערכו לפני סריקות MRI עבור כל הערכות המעקב כדי למנוע הפרעה של ההרדמה לתוצאות ההתנהגות שנמדדו (איור 1). בנוסף, יש לשלול את בעלי החיים המציגים קואורדינציה מוטורית גרועה, מה שעלול להגדיל גם את ציון ה-mNSS, על סמך מבחן קדם-CHI. התוצאות שלנו, בהתאם למחקר הקודם, הראו ציוני mNSS גבוהים משמעותית ומשך הליכה ממושך לאחר CHI¹¹ חוזר. יתר על כן, הראינו שציוני mNSS ומשך הליכת הקורה תלויים באתר הפגיעה של CHI, במיוחד ביום ה-50 לאחר הפציעה.

MRI אורכי, המאפשר הערכה של מבני מוח בקנה מידה מאקרו ומזו לאורך זמן, מייצג כלי מכריע לאימות הנאמנות של מודל CHI המוצג כאן בשכפול מאפיינים של mTBI לא מסובך. במהלך רכישת תמונה, במיוחד ביום הראשון לאחר CHI, יש לעקוב היטב אחר הפרמטרים הפיזיולוגיים, כולל טמפרטורה, קצב נשימה וקצב לב של בעל החיים. כתוצאה מכך, יש להתאים בקפידה את ריכוז האיזופלורן בזמן כדי לשמור על יציבות פיזיולוגית. בעוד ש-EPI של ארבע יריות שימש במחקר הנוכחי לרכישת תמונות DTI, ניתן להשתמש ב-EPI בזריקה אחת גם כדי להפחית חפצי תנועה בגלל זמן הסריקה הקצר יחסית. עיבוד תמונה וניתוח של MRI פרה-קליני הוא חיוני מכיוון שרוב המחקרים עדיין מסתמכים על צינורות ניתוח מותאמים אישית שפותחו על ידי צוותי מחקר בודדים⁴⁵. אם האלגוריתם המותאם אישית, כמו Matlab במחקר הנוכחי, אינו נגיש, מדידת הנפח וחילוץ עוצמת האות עשויים להתבצע באמצעות ImageJ, תוכנת קוד פתוח, לתמונות מדעיות המבוססות על תמונות משוקללות T2 ומפות FA, בהתאמה. לניתוח מדויק של תמונות MRI שנרכשו בנקודות זמן מרובות, יש לבצע תחילה רישום משותף של נבדקים פנימיים. בהתחשב בשינויים בין נבדקים בנפח המוח אפילו באותם גילאים שלאחר הלידה, נורמליזציה של נפח המוח לאחר הפציעה לנפח הבסיס שלו עבור כל נבדק חיונית כדי לתאר ניוון קליפת המוח הנגרמת על ידי CHI⁴⁶. עבור ניתוח FA, יש לבצע את הסף להפרדת חומר אפור סמוך (GM) ו-WM כדי למנוע השפעות נפח חלקיות. חשוב לציין שערכי FA מושפעים מעוצמת השדה המגנטי⁴⁷ וממספר שיפועי הדיפוזיה המופעלים ב-DTI⁴⁸. קביעת סף ה-FA במחקר הנוכחי עשויה, לפיכך, לא להיות ישימה באופן כללי לתמונות DTI שנרכשו באמצעות פרוטוקולים שונים או סורקי MR.

מכיוון ש-mTBI, במיוחד mTBI לא מסובך, לעתים קרובות בלתי נראה על ידי דימוי עצבי קונבנציונלי בשלב האקוטי, מאמצי המחקר התמקדו בזיהוי סמני תמונה יעילים ומתקדמים כדי ללכוד ולספק מידע פרוגנוסטי על התסמינים הבאים לאחר הפציעה^49,50. ההטרוגניות של מקרי mTBI קליניים מוסיפה מורכבות נוספת וחוסר עקביות בנתונים. במודל mTBI לא מסובך זה, ראינו שינויים מיקרו-מבניים ומקרו-מבניים משמעותיים בהדמיה לצד ליקויים התנהגותיים מדידים, מה שמספק פלטפורמה למעקב לאורך זמן אחר סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של הדמיה מוחית לאחר פציעה. יש לציין כי השינויים התלויים בפרמטר ההשפעה הן בהדמיה והן בתוצאות התפקודיות במודל CHI מציעים את האפשרות לזהות סמנים ביולוגיים של הדמיה מוחית הרגישים לחומרת הפציעה ולפרמטרי ההשפעה. בהתאם לממצאים הקודמים המראים מתאמים בין מדדי DTI ספציפיים לבין אסטרוגליוזיס⁸, מחקרים עתידיים הבוחנים את הקשר בין תכונות תמונה שונות, שינויים מיקרוסקופיים ותוצאות תפקודיות עשויים לבסס סמנים ביולוגיים לא פולשניים מבטיחים לשינויים תאיים בסיסיים ופרוגנוזה של תסמינים לאחר mTBI.

במחקר זה היה צורך לקחת בחשבון מספר מגבלות. ראשית, גודל המדגם עבור כל קבוצת פרמטרי השפעה קטן יחסית (n = 4 לקבוצה), וטווח פרמטרי ההשפעה שנבדקו מוגבל. למרות גודל המדגם הקטן, ראינו הבדלים משמעותיים במדידה התנהגותית, ערכי FA ונפח קליפת המוח בין קבוצות CHI. יחד עם המחקרים הקודמים שהשתמשו בפרמטרי השפעה שונים ^8,11, התוצאות שלנו תומכות במחקר נוסף במדגמים גדולים עם מגוון רחב יותר של פרמטרים לבדיקה. שנית, כמו ברוב המחקרים בחיות TBI ^7,9, רק חולדות זכרים שימשו בניסויים הנוכחיים. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על הבדלים בין המינים בשינויים במדדי DTI בזיכרון העבודה בעקבות CHI חוזר בעכברים, תוך הדגשת תגובות ספציפיות למין לאחר פגיעה מוחית¹⁰. מחקרים עתידיים המשלבים בעלי חיים זכרים ונקבות יחקרו את התגובה השונה לפרמטרים של השפעת CHI בין המינים. לבסוף, בעוד ששינויים ב-FA נצפו לאחר CHI ובקרב קבוצות CHI שונות, ניתן היה לחדד עוד יותר את העיבוד המקדים של אות הדיפוזיה. שילוב טכניקות מתוחכמות יותר, כגון תיקון זרם מערבולת, תיקון הטיית שדה מגנטי וכו', יחד עם תמונה¹⁷ של דיפוזיה מרובת פגזים עשוי לשפר עוד יותר את הרגישות של אותות DTI לאיתור נזק מיקרו-מבני הנגרם על ידי mTBI.

עם הפרוטוקול הנוכחי, הדגמנו את מבנה המוח השמור לצד ליקוי התנהגותי משמעותי בשלב החריף לאחר CHI. ניתוח עוקב חשף אובדן נפח מוח קליפת המוח הבולט וערכי FA משתנים בשלב הכרוני. חשוב מכך, התוצאות ההתנהגותיות והנוירו-דימוי היו תלויות בפרמטרי ההשפעה המשמשים לגרימת CHI, כולל מספר ההשפעה, מרווח בין הפגיעות ואתר הפגיעה. בהשוואה למודלים של mTBI שפורסמו, המתמקדים בעיקר בתוצאות התנהגותיות או דלקת עצבית במוח, מחקר זה השתמש בגישה מקיפה הכוללת את ההערכה המערכתית והמוחית השלמה לאחר CHI. על ידי בדיקה באמצעות MRI אורכי, מודל CHI הציג שלמות מבנית שמורה בשלב האקוטי אך ניוון קליפת המוח בולט בשלב הכרוני, מה שמרמז על שכפול מוצלח של mTBI לא מסובך. חשיבות המחקר היא שניתן לחקור כיצד פרמטרי ההשפעה המגוונים משנים את המוח לאחר mTBI ולפתח סמנים ביולוגיים טנטטיביים של תמונה לפגיעה שקטה קלינית זו.

למחברים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (NSTC) של טייוואן (NSTC 113-2314-B-A49-047).