시뮬레이션 연구에서 복잡한 지질 혼합물을 사용한 사실적인 막 모델링

구조와 구성의 막 지질 다양성은 세포 과정에 중요한 기여를 하며 질병의 표지자가 될 수 있습니다. 분자 역학 시뮬레이션을 통해 원자 분해능에서 멤브레인과 생체 분자와의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 복잡한 멤브레인 시스템을 구축, 실행 및 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

지질은 세포막의 구조적 구성 요소입니다. 지질 종은 세포 소기관과 유기체에 따라 다릅니다. 이러한 다양성은 멤브레인에서 서로 다른 기계적 및 구조적 특성을 발생시켜 이 계면에서 발생하는 분자와 과정에 직접적인 영향을 미칩니다. 지질 조성은 동적이며 세포 신호 전달 과정을 조절하는 역할을 할 수 있습니다. 생체 분자 간의 상호 작용을 예측하고 실험적 관찰 대상에 대한 분자 통찰력을 제공하기 위해 계산 접근 방식이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 분자 역학(MD)은 원자에 작용하는 힘을 기반으로 원자의 움직임을 예측하는 통계 역학을 기반으로 하는 기술입니다. MD 시뮬레이션은 생체 분자의 상호 작용을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 이 기법을 간략하게 소개하고, 지질 이중층 시뮬레이션에 관심이 있는 초보자를 위한 실용적인 단계를 간략하게 설명하고, 초보자에게 친숙한 소프트웨어로 프로토콜을 시연하고, 공정의 대안, 과제 및 중요한 고려 사항에 대해 논의합니다. 특히, 복잡한 지질 혼합물을 사용하여 관심 세포막을 모델링하여 시뮬레이션에서 적절한 소수성 및 기계적 환경을 캡처하는 것의 관련성을 강조합니다. 또한 막 조성 및 특성이 다른 생체 분자와 이중층의 상호 작용을 조절하는 몇 가지 예에 대해서도 논의합니다.

지질은 세포막의 주요 구성 요소로, 세포의 경계를 제공하고 세포 내 구획화를 가능하게 합니다 ^1,2,3. 지질은 양극성이며 극성 머리 그룹과 두 개의 소수성 지방산 꼬리가 있습니다. 이들은 소수성 사슬과 물 ^3,4의 접촉을 최소화하기 위해 이중층으로 자체 조립됩니다. 친수성 헤드 그룹과 소수성 꼬리의 다양한 조합은 생체막에서 글리세로인지질, 스핑고지질 및 스테롤과 같은 다양한 종류의 지질을 생성합니다(그림 1)^1,5,6. 글리세로인지질(Glycerophospholipids)은 글리세로인산염(glycerophosphate), 장쇄 지방산(long-chain fatty acids), 저분자량의 머리(head) 그룹으로 구성된 진핵 세포막의 주요 구성 요소이다⁷. 지질 명명법은 머리 그룹의 차이를 기반으로 합니다. 예를 들면 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜-에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜-글리세롤(PG), 포스파티딜-이노시톨(PI) 또는 변형되지 않은 포스파티드산(PA)^5,6이 있습니다. 소수성 꼬리의 경우 포화도의 길이와 정도는 골격 구조와 함께 다양합니다. 가능한 조합은 셀 수 없이 많아 포유류 세포에서 수천 종의 지질이 생성된다⁶. 막 지질 조성의 변화는 통합 막 단백질과 말초 단백질 모두의 활성에 영향을 미치는 다양한 기계적 및 구조적 막 특성으로 이어집니다 ^2,6.

그림 1. 대표적인 지질 구조. 지방산 꼬리는 파란색 상자로, 일반적인 지질 머리 그룹은 주황색으로, 샘플 백본은 보라색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

지질은 세포 과정, 신호 전달 캐스케이드의 단백질 활성화, 건강한 세포 항상성 ^8,9에서 활발한 역할을 합니다. 변화된 지질 역학은 감염의 결과이거나 질병 10,11,12,13,14,15의 발병 기전의 표지자일 수 있다. 세포의 장벽으로서, 막 지질과 작은 분자의 투과에서의 역할에 대한 연구는 약물 전달 시스템 및 막 파괴 메커니즘과 관련이 있습니다^16,17. 화학적 다양성과 세포기관, 조직 및 유기체에 걸친 지질 종의 다양한 비율은 복잡한 막 역학을 야기합니다². 따라서 지질 이중층의 모델링 연구에서 이러한 특성을 유지하는 것이 중요하며, 특히 연구의 목표가 다른 생체 분자와 막의 상호 작용을 검사하는 것인 경우 더욱 그렇습니다. 모델에서 고려해야 할 지질 종은 관심 있는 유기체와 세포 구획에 따라 다릅니다. 예를 들어, PG 지질은 광합성 바테리아(¹⁸)에서 전자 전달에 중요한 반면, 인산화된 이노시톨 지질(PIP)은 포유류 세포에서 원형질막(PM) 역학 및 신호 캐스케이드의 주요 역할을 합니다^19,20. 세포 내부의 PM, 소포체(ER), 골지체, 미토콘드리아 막에는 기능에 영향을 미치는 고유한 지질이 풍부하게 포함되어 있습니다. 예를 들어, 응급실은 지질 생물 발생의 허브이며 콜레스테롤을 PM과 골지로 운반합니다. PC와 PE가 풍부하고 지질 다양성이 높지만 스테롤 함량이 낮아 막 유동성^21,22,23,24를 촉진합니다. 대조적으로, PM은 유기체(²⁵)에 따라 수백, 심지어 수천 종의 지질 종을 포함하며, 세포(²⁴)의 다른 막에 비해 특징적인 강성을 부여하는 높은 수준의 스핑고지질과 콜레스테롤을 함유하고 있다. 소엽 비대칭은 스핑고미엘린, PC, 콜레스테롤이 풍부한 외부 전단과 신호전달 캐스케이드에 중요한 PE, PI 및 PS가 풍부한 내부 전단이 있는 PM과 같은 막에 대해 고려해야 한다²⁴. 마지막으로, 지질 다양성은 또한 지질 뗏목(lipid rafts)으로 알려진 패킹 및 내부 순서가 다른 미세 도메인(micro-domain)의 형성을 촉진한다(^24,26); 이들은 측면 비대칭을 나타내고, 세포 신호전달에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되며(²⁶), 일시적인 특성으로 인해 연구하기 어렵다.

형광투시, 분광법 및 거대 단층 소포(GUV)와 같은 모델 막 시스템과 같은 실험 기술은 생체 분자와 막의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 그러나 관련된 구성 요소의 복잡하고 역동적인 특성은 실험 방법만으로는 포착하기 어렵습니다. 예를 들어, 단백질의 막관통 도메인의 이미징, 이러한 연구에 사용되는 막의 복잡성 및 관심 과정 중 중간 또는 과도 상태의 식별에 제한이 있습니다^27,28,29. 1980년대에 지질 단층과 이중층의 분자 시뮬레이션이 출현한 이후(²⁹), 지질-단백질 시스템과 그 상호 작용은 이제 분자 수준에서 정량화될 수 있습니다. 분자 역학(MD) 시뮬레이션은 분자 간 힘을 기반으로 입자의 움직임을 예측하는 일반적인 계산 기술입니다. 부가적 상호작용 전위는 시스템⁽³⁰)의 입자들 사이의 결합 및 비결합 상호작용을 설명한다. 이러한 상호 작용을 모델링하는 데 사용되는 파라미터 집합을 시뮬레이션 포스필드(FF)라고 합니다. 이러한 파라미터는 ab initio 계산, 반경험적 및 양자 역학적 계산으로부터 얻어지며, X선 및 전자 회절 실험, NMR, 적외선, 라만 및 중성자 분광법, 기타 방법(³¹)의 재현된 데이터에 최적화되어 있다.

MD 시뮬레이션은 해상도^32,33,34의 다양한 수준에서 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 생체 분자 상호 작용, 수소 결합 및 기타 고해상도 세부 사항을 특성화하는 것을 목표로 하는 시스템은 모든 원자(AA) 시뮬레이션으로 연구됩니다. 대조적으로, 거친 입자 (CG) 시뮬레이션은 계산 비용을 줄이고 더 큰 규모의 역학을 검사하기 위해 원자를 더 큰 작용기로 묶습니다³³. 이 둘 사이에는 수소 원자가 각각의 무거운 원자와 결합하여 계산^33,35을 가속화하는 단일 원자(UA) 시뮬레이션이 있습니다. MD 시뮬레이션은 지질막의 역학 및 다른 분자와의 상호 작용을 탐구하기 위한 강력한 도구이며 막 계면에서 관심 프로세스에 대한 분자 수준 메커니즘을 제공하는 역할을 할 수 있습니다. 또한 MD 시뮬레이션은 실험 대상의 범위를 좁히고 미세한 상호 작용을 기반으로 주어진 시스템의 고분자 특성을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.

간단히 말해서, 초기 좌표, 속도 및 일정한 온도 및 압력과 같은 조건 집합이 주어지면 각 입자의 위치와 속도는 상호 작용 전위와 뉴턴의 운동 법칙의 수치적 적분을 통해 계산됩니다. 이것은 반복적으로 반복되어, 시뮬레이션 궤적⁽³⁰)을 생성한다. 이러한 계산은 MD 엔진으로 수행됩니다. 여러 오픈 소스 패키지 중에서 GROMACS³⁶은 가장 일반적으로 사용되는 엔진 중 하나이며 여기에서 설명하는 엔진입니다. 또한 시뮬레이션할 시스템의 초기 좌표를 분석하고 구성하기 위한 도구(³⁷)를 포함한다. 다른 MD 엔진에는 NAMD³⁸이 포함됩니다. CHARMM³⁹ 및 AMBER⁴⁰은 사용자가 주어진 시스템의 계산 성능에 따라 재량에 따라 선택할 수 있습니다. 시뮬레이션 중에 궤적을 시각화하고 결과를 분석하고 해석하는 것이 중요합니다. 다양한 도구를 사용할 수 있습니다. 여기서는 광범위한 드로잉 및 채색 방법을 사용한 3차원(3차원) 시각화, 체적 데이터 시각화, MD 시뮬레이션 시스템의 궤적 구축, 준비 및 분석, 시스템 크기에 제한이 없는 궤적 동영상 제작(메모리를 사용할 수 있는 경우)을 포함하여 광범위한 기능을 제공하는 시각 분자 역학(VMD)에 대해 논의합니다(41,42,43).

시스템 구성 요소 간에 예측된 동역학의 정확도는 궤적의 전파를 위해 선택한 FF의 직접적인 영향을 받습니다. 경험적 FF 매개 변수화 노력은 소수의 연구 그룹에 의해 추구됩니다. MD에 대한 가장 확립되고 일반적인 FF에는 CHARMM³⁹, AMBER 40, Martini⁴⁴, OPLS 45 및 SIRAH ⁴⁶이 있습니다. 모든 원자 첨가제 CHARMM36(C36) 역장(⁴⁷)은 실험 구조 데이터를 정확하게 재현하기 때문에 멤브레인 시스템의 AA MD에 널리 사용됩니다. 원래 CHARMM 커뮤니티에서 개발했으며 GROMACS 및 NAMD와 같은 여러 MD 엔진과 호환됩니다. 공통 FF에 걸친 개선에도 불구하고, 특정 연구 시스템^48,49에 대한 관심에 의해 주도된 실험적 관측 가능 물체를 밀접하게 재현하는 예측을 허용하기 위해 매개변수 세트를 개선하려는 지속적인 노력이 있습니다.

지질막을 시뮬레이션할 때 어려운 점은 시뮬레이션 궤적의 길이를 결정하는 것입니다. 이는 분석할 메트릭과 특성화하려는 프로세스에 따라 크게 달라집니다. 일반적으로 복잡한 지질 혼합물은 평형에 도달하는 데 더 오랜 시간이 필요한데, 이는 더 많은 종이 막 평면에서 확산되고 안정적인 측면 조직에 도달하는 데 충분한 시간이 필요하기 때문입니다. 시뮬레이션은 관심 속성이 안정기에 도달하고 일정한 값을 중심으로 변동할 때 평형 상태에 있다고 합니다. 관심 있는 특성 및 상호 작용에 대한 적절한 통계 분석을 수행하기 위해 최소 100-200ns의 평형 궤적을 얻는 것이 일반적입니다. 지질 혼합물의 복잡성과 연구 질문에 따라 200-500ns 사이의 멤브레인 전용 시뮬레이션을 실행하는 것이 일반적입니다. 단백질-지질 상호 작용은 일반적으로 500-2000ns 사이의 더 긴 시뮬레이션 시간이 필요합니다. 멤브레인 시스템으로 샘플링 및 관찰 가능한 동역학을 가속화하기 위한 몇 가지 접근법은 다음과 같다: (i) 멤브레인 내 지질의 말단 탄소를 유기 용매로 대체하여 샘플링을 가속화하는 HMMM(Highly Mobile Membrane Mimetic) 모델(⁵⁰); 및 (ii) 수소 질량 재분할(HMR)은 시스템 내의 무거운 원자의 질량의 일부를 수소 원자의 질량과 결합하여 더 큰 시뮬레이션 시간단계⁽⁵¹)를 사용할 수 있도록 한다.

다음 프로토콜은 AA MD를 사용하여 사실적인 멤브레인 모델을 구축, 실행 및 분석하기 위한 초보자 친화적인 접근 방식에 대해 설명합니다. MD 시뮬레이션의 특성을 감안할 때 결과의 재현성과 적절한 통계 분석을 설명하기 위해 여러 궤적을 실행해야 합니다. 현재 관심 있는 시스템당 최소 3개의 복제본을 실행하는 것이 좋습니다. 관심 있는 유기체 및 공정에 대해 지질 종을 선택한 후에는 멤브레인 전용 시스템의 시뮬레이션 궤적을 구축, 실행 및 분석하기 위한 기본 단계가 그림 2에 요약되어 있습니다.

그림 2. MD 시뮬레이션을 실행하기 위한 회로도. 주황색 상자는 프로토콜에 설명된 세 가지 주요 단계에 해당합니다. 아래에는 시뮬레이션 프로세스의 작업 흐름이 있습니다. 시스템 설정 중에 용매 멤브레인 시스템의 초기 좌표를 포함하는 시스템은 CHARMM-GUI 멤브레인 빌더와 같은 시스템 입력 발생기로 구축됩니다. 입력 파일을 고성능 컴퓨팅 클러스터로 전송한 후 시뮬레이션 궤적은 GROMACS와 같은 MD 엔진을 사용하여 전파됩니다. 궤적 분석은 시각화와 함께 컴퓨터 클러스터 또는 로컬 작업 스테이션에서 수행할 수 있습니다. 그런 다음 GROMACS 및 VMD와 같은 분석 코드가 내장된 패키지를 사용하거나 Bash 스크립트 또는 다양한 Python 라이브러리를 사용하여 분석을 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 시스템 좌표 작성

1. 웹 브라우저를 사용하여 CHARMM-GUI.org(C-GUI)로 이동합니다. 상단 메뉴에서 Input Generator로 이동한 다음 화면 왼쪽의 수직 옵션에서 Membrane Builder 를 선택합니다.
2. 이중층을 생성하려면 이중층 빌더(Bilayer Builder)를 선택하십시오.
   참고: 처음 사용자는 첫 번째 좌표 세트를 작성하기 전에 무료 계정을 활성화해야 합니다.
3. 멤브레인 전용 시스템을 선택합니다. 생성된 작업 ID를 저장하여 시스템을 검색하고 필요한 경우 프로세스 중에 중단한 부분부터 계속하십시오.
   1. 페이지 상단에 있는 상자에서 구조 보기를 클릭하거나 결과 PDB 파일을 다운로드하여 빌드 프로세스의 모든 단계에서 시스템을 시각화합니다. 누락된 성분, 선택한 입력 지질 종 또는 패치 크기의 실수를 주의하십시오.
4. 시스템의 구성 요소를 선택합니다.
   1. Heterogeneous Lipid 옵션을 선택하면 단일 성분 이중층을 구축하는 경우에도 마찬가지입니다. 그런 다음 직사각형 상자 유형을 선택합니다.
   2. 수화 옵션을 위해 지질당 45개의 물 분자를 선택하십시오. 이것은 완전히 수화된 이중층을 보장하기에 충분합니다.
   3. 지질 성분의 수를 기준으로 XY의 길이를 설정합니다. 그런 다음 모델에 앞서 결정된 각 지질 종에 대해 포함할 지질 수를 선택합니다. 다음 섹션에서 논의된 사례 연구를 위해 600개의 지질이 두 개의 리플렛에 대칭으로 분포된 멤브레인 모델을 구축했습니다. 진핵 세포의 ER을 모델링하기 위해 336 DOPC, 132 DPPE, 60 CHOL, 72 POPI 지질의 혼합물을 PI 모델에 사용했습니다. 및 PI-PS 모델에 대한 330 DOPC, 126 DPPE, 54 CHOL, 66 POPI 및 24 DOPS 지질.
      참고: C-GUI는 선택할 수 있는 지질 구조 라이브러리를 제공합니다. 화학 구조에 대한 종 이름 옆에 있는 이미지를 클릭하십시오.
   4. 지질 이름 옆에 있는 두 개의 상자에 위쪽 및 아래쪽 전단지에 원하는 분자 수를 입력합니다. 사례 연구의 경우, 대칭적인 막 조성이 필요합니다 - 상부 전단과 하부 전단에 일치하지 않는 수의 지질에 대한 오류가 없는지 확인하십시오. 비대칭이 필요한 경우 각 전단지의 총 지질 수가 정확한지 확인하십시오. 비대칭 이중층 구축에 대한 자세한 내용은 Park et ^al.52,53의 연구를 참조하십시오.
   5. 지질 종 목록의 맨 위로 이동하여 시스템 정보 표시 버튼을 클릭합니다. 구성 요소를 조립하고 시스템을 완성합니다.
   6. 더 빠른 수렴을 위해 거리 기반 알고리즘을 사용하여 중화 이온을 포함하는 옵션을 선택합니다⁵⁴.
   7. KCl의 기본 용액 농도를 0.15mM로 둡니다. 이것은 멤브레인 이중층에 대한 시뮬레이션 상자를 중성화하기 위한 일반적인 염분 농도입니다.
      참고: 다른 농도를 사용하려면 편집 후 Calculate Solvent Composition 버튼을 클릭해야 합니다.
5. 시뮬레이션 조건 및 설정을 선택합니다.
   1. FF 옵션으로 CHARMM36m 을 선택합니다. 일반적으로 지질 및 단백질 시뮬레이션에 사용되지만 사용자는 소개에서 논의된 다른 옵션을 선택할 수 있습니다.
   2. MD 엔진으로 GROMACS 를 선택하여 해당 형식의 샘플 입력 파일을 가져옵니다.
      참고: GROMACS는 지원을 위한 여러 온라인 리소스, 자습서 및 포럼이 있으므로 신규 사용자에게 권장됩니다. 사용자는 여러 MD 엔진 중에서 선택하여 시뮬레이션 성능 및 코드 구문 측면에서 옵션을 탐색할 수 있습니다.
   3. 지질 이중층 시뮬레이션에서 가장 많이 사용되는 동적 앙상블인 NPT(Constant Particle-Pressure-Temperature) 앙상블을 선택합니다.
   4. 켈빈과 바 단위의 온도와 압력을 각각 303K와 1bar로 설정합니다. 액체 무질서 상태의 이중층을 보장하기 위해 생물학적 과정 연구를 위해 온도를 298K에서 310K 사이로 설정하는 것이 일반적입니다.
      알림: 온도는 시뮬레이션할 프로세스의 조건에 따라 다르며 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 모델의 지질 종에 따라 시뮬레이션을 실행하기 전에 온도를 순수 지질 성분의 전이 온도보다 높게 설정합니다.
6. 결과 파일을 다운로드하고 컴퓨터 클러스터로 전송합니다.
   1. VMD 또는 PyMol과 같은 선택한 소프트웨어에서 최종 시스템을 시각화하고 적절한 설정을 검사합니다.
      참고: 예를 들어, 시뮬레이션 중에 지질이 이미지 원자와 상호 작용하지 않도록 멤브레인 주변에 충분한 물이 있는지 확인하고 적절한 리플릿 설정(사이에 공간이나 물이 없는 이중층)을 확인하는 것이 좋습니다.

2. MD 시뮬레이션 실행

1. 컴퓨팅 클러스터의 C-GUI에서 파일을 업로드하고 압축을 풉니다. Gromacs 디렉토리로 이동합니다. 완화 제출 스크립트를 만듭니다.
2. 제출 스크립트의 형식에 대한 클러스터의 지침을 따릅니다.
   1. README 파일의 # Production 주석 바로 위까지 나열된 명령을 제출 스크립트에 복사합니다.
      참고: C-GUI의 이 기본값은 시스템의 6단계 완화를 실행하는 루프입니다. 다른 잘 정립된 프로토콜이 필요한 경우 C-GUI에서 방금 빌드하고 다운로드한 좌표를 읽도록 편집합니다.
3. 완화 스크립트를 제출하고 프로덕션 실행으로 이동하기 전에 모든 단계에 대해 모든 출력 파일이 다운로드되었는지 확인합니다. 완료되면 6단계 실행 중에 생성된 GROMACS의 출력 파일(*.log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc)을 확인합니다.
4. 프로덕션 실행 스크립트를 만듭니다.
   1. 완화 단계의 샘플 gmx grompp 및 gmx mdrun 명령 중 하나를 템플리트로 사용합니다.
   2. 스크립트를 사용하기 전에 제공된 step7_production.mdp 파일과 유사한 시뮬레이션 옵션이 포함된 *.mdp 파일을 만들어야 합니다.
      참고: 제공된 기본 옵션은 멤브레인 시뮬레이션의 표준입니다. ditances는 nm 단위로 나열되고 시간은 피코초 또는 단계 수(피코초/적분 시간 단계)로 표시됩니다. nsteps를 업데이트하여 원하는 시뮬레이션 길이(dt * nsteps와 같음)까지 실행하고, nst[x,v,f]out을 업데이트하여 적분 스텝 개수에 따라 데이터 저장 빈도를 업데이트합니다. 사례 연구의 경우, 시뮬레이션 길이가 500ns인 경우 nsteps를 250,000,000으로 설정하고(시뮬레이션 시간/적분 단계 = 500,000ps/0.002ps), nst[x,v,f]out을 50,000으로 설정하여 100ps마다 데이터를 저장합니다
5. 실제 시뮬레이션을 실행하기 전에 벤치마크 스터디를 실행하여 리소스를 가장 잘 사용할 수 있는지 확인합니다.
   1. 서로 다른 수의 컴퓨팅 노드를 사용하여 1-2ns 동안 시스템을 실행합니다.
      참고: ER 사례 연구는 UB CCR(Center for Computational Research) 고성능 컴퓨팅 클러스터⁵⁵ (2ns)에 제출되었으며, 여기서 1-10개 노드에 대한 성능을 테스트했습니다.
   2. 각 설정에 대한 ns/day 단위의 성능을 비교하여 실행에 대한 최적의 리소스를 결정합니다. 최대 성능의 75%-80%를 초래하는 노드 수를 선택하는 것이 일반적입니다.
6. 프로덕션 실행을 실행합니다.
   1. 각 시스템을 세 번에 걸쳐 실행하여 재현성을 보장하고 데이터에 대한 통계 분석을 수행합니다.
   2. 컴퓨팅 클러스터에서 제출에 허용되는 대기열 시간이 만료된 경우 벤치마크를 기반으로 궤적을 확장합니다. gmx convert-tpr을 사용한 다음 gmx mdrun 명령을 사용하여 궤적 수집을 계속합니다.
      참고: 옵션은 GROMACS 설명서 온라인(https://manual.gromacs.org/)에 설명되어 있습니다.
   3. 멤브레인 전용 시스템의 경우 시간 경과에 따른 지질당 면적을 계산하여 시스템이 평형에 도달했는지 검사합니다. 그렇지 않은 경우 시뮬레이션 궤적을 확장합니다.

3. 궤적 분석

1. 분석을 실행하기 전에 시스템을 시각화하여 관심 분자와 특성 분석을 위한 궤적의 일부를 결정합니다.
2. 파일 형식을 *.xtc로 변경하거나 프레임을 건너뛰어 원시 궤적 파일(*.trr)을 압축하여 파일 크기를 줄이고 시각화 및 분석을 위해 로컬 스테이션으로 보다 효율적으로 전송할 수 있습니다.
   알림: 대형 멤브레인 시스템의 경우 파일 크기를 더 줄이기 위해 궤적에서 물을 제거하도록 선택할 수 있습니다. 이 작업은 GROMACS의 인덱스 파일, VMD의 TCL 스크립트 또는 MDAnalysis 및 MDTraj와 같은 Python 라이브러리를 사용하여 수행할 수 있습니다.
3. 지질당 면적 시계열에서 결정된 궤적의 평형 부분 동안 선택한 분석을 수행합니다.
   참고: 일반적인 멤브레인 분석 및 실행 방법에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.

프로토콜의 사용과 얻을 수 있는 결과를 설명하기 위해 소포체(ER)에 대한 막 모델에 대한 비교 연구가 논의됩니다. 이 연구의 두 모델은 (i) ER에서 발견되는 상위 4개 지질 종을 포함하는 PI 모델과 (ii) 음이온 포스파티딜세린(PS) 지질 종을 추가한 PI-PS 모델이었습니다. 이 모델은 나중에 바이러스 단백질과 그것이 막과 어떻게 상호 작용하는지에 대한 연구에 사용되었으며, PS에 대한 관심은 바이러스 단백질²³의 투과화 활성에 중요한 것으로 인용되었습니다. 지질 꼬리 구조의 다양성을 통합하기 위해, 막 조성은 DOPC:DPPE:CHOL:POPI (56:22:10:12 mol%) 및 DOPC:DPPE:CHOL:POPI:DOPS (55:21:11:9:4 mol %)로 설정하였다.

멤브레인은 CHARMM-GUI 멤브레인 빌더로 생성되었습니다. 4가지 다른 지질 종과 나중에 단백질을 수용하기 위해 대칭 막은 600개의 지질/전단을 포함하도록 설정되었습니다. 프로토콜에서 권장하는 설정은 303K의 온도로 사용되었습니다. 독립적인 복제를 보장하기 위해 각 멤브레인 모델에 대해 구축 공정을 세 번 반복하여 매번 다른 무작위 지질 혼합물을 생성했습니다. 시스템을 구축한 후, 입력 파일들은 GROMACS 버전 2020.5를 사용하여 MD 시뮬레이션을 실행하기 위해 UB CCR(Center for Computational Research) 고성능 컴퓨팅 클러스터(⁵⁵ )로 이동되었다. 6단계 완화 프로토콜이 완료된 후, 원자 수가 모든 복제본에서 유사하기 때문에 모델당 하나의 시스템에서만 벤치마킹을 수행했습니다(그림 3). 최대 성능의 75%는 ~78ns/일이었으므로 프로덕션 실행을 위해 클러스터에서 최대 6개의 노드가 요청되었습니다. 각 복제본은 *.mdp 파일에서 nstep = 25 x 10⁷ 을 설정하고 벤치마크에 따라 필요에 따라 클러스터에 확장을 제출하여 최대 500ns 동안 실행되었습니다.

그림 3. 샘플 벤치마크 실행. PI Model(원자 315,000개)의 성능을 결정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

각 복제본의 지질당 면적(APL)은 그림 4에 나와 있습니다. 이는 에너지 내장 프로그램을 사용하여 GROMACS의 *edr 시뮬레이션 출력 파일에 저장된 시뮬레이션 상자의 XY 치수에서 계산되었습니다. 그런 다음, 전체 표면적을 전단당 총 지질의 수로 나누어 각 모델에서 APL의 추정치를 제공하였다. 모든 시스템에서 평형은 APL이 정체기에 도달하고 상수 값을 중심으로 변동하는 지점으로 결정되었습니다. 이러한 모든 시스템에서 평형은 궤적의 처음 100ns 이내에 도달합니다( 그림 4 참조). 이 메트릭에 따라 500ns의 궤적은 이러한 시스템에 충분한 것으로 간주되었습니다. 이러한 이중층에 대한 다른 모든 분석은 평형 또는 생산 단계로 알려진 궤적의 마지막 400ns에 걸쳐 수행되었습니다. 계산된 각 값의 불확실성을 결정하려면 10-20ns마다 블록 평균을 내는 것이 좋습니다. APL 분석에서 PI-PS 멤브레인 모델은 PI 모델보다 평균적으로 0.7 Ų 더 큰 표면적을 갖습니다.

그림 4. 지질당 면적의 예. (A) PI 및 (B) PI-PS 모델. 각 모형에 대한 반복실험 1, 반복실험 2 및 반복실험 3은 빨간색, 파란색 및 녹색으로 표시됩니다. 모든 시스템에 대한 평형은 처음 100ns 이내에 발생합니다. 불확실성은 평균의 표준 오차(SEM)로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

또한 멤브레인 구조에 대한 두 가지 간단한 분석이 제시됩니다. 그림 5 는 상단 및 하단 전단지에서 인지질의 인산염 원자의 질량 중심(COM) 사이의 거리로 추정된 멤브레인 두께를 보여줍니다. 이것은 GROMACS의 거리 프로그램을 사용하여 계산되었으며, 여기에는 두 개의 원자 그룹, 즉 상단 전단지의 인산염 그룹에 대한 그룹과 하단 전단지에 있는 인산염 그룹에 대한 다른 그룹을 나열하는 색인 파일이 필요합니다. 결과는 두 멤브레인 모델의 두께 간의 통계적 차이를 보여주며, APL과 멤브레인 두께 간의 반비례 관계를 보여줍니다. 마지막으로, 도 6 은 각 지질 종의 중수소 순서 파라미터를 나타내는데, 이는 이중층 소수성 코어(⁵⁶) 내의 지질 꼬리의 순서를 정량화하는 척도이다. 지방산 꼬리는 글리세롤 골격의 말단 산소에 부착된 sn1과 글리세롤기의 중앙 산소에 부착된 sn2로 분류됩니다. 결과는 PI 모델에서 sn1 꼬리의 순서가 약간 증가하는 DPPE를 제외하고는 모델 간의 지질 꼬리 순서 간에 차이가 거의 또는 전혀 없음을 보여줍니다.

그림 5. 멤브레인 두께의 예. (A) PI 및 (B) PI-PS 모델. 각 모형에 대한 반복실험 1, 반복실험 2 및 반복실험 3은 빨간색, 파란색 및 녹색으로 표시됩니다. 불확실성은 평균의 표준 오차(SEM)로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 중수소 차수 매개 변수 예. (A) DOPC, (B) DPPE, (C) POPI 및 (D) DOPS 지질 종. sn1의 실선, sn2의 점선, PI 모델은 빨간색, PI-PS 모델은 파란색입니다. 불확실성은 평균의 표준 오차(SEM)로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

복잡한 막 모델은 특정 지질 종의 관련성과 이러한 지질이 생체 분자와 막의 상호 작용을 조절하는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 실험실의 샘플 연구는 (1) 막 조성이 단백질¹⁹의 상호 작용을 조절하고 (2) 지질 꼬리 포화 및 막 표면 전하가 침투 및 소분자^17,57의 측면 조직에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 위에서 설명한 프로토콜과 이전 단락에서 제시된 것과 유사한 분석을 사용하여, Li et al.의 연구는 잠재적인 광역학 치료제인 D112와 상이한 지질 혼합물 사이의 상호작용에 대한 실험 및 시뮬레이션의 통찰력을 제공한다¹⁷. 이중층에서 D112 분할을 특성화하기 위한 실험에서 PC 및 PS 지질이 있는 이중층을 조사했습니다. 우리는 D112 막 상호 작용에 대한 표면 전하와 소수성 환경의 영향을 결정하기 위해 다양한 지방산 꼬리 길이와 포화도, 즉 이중 결합 수를 가진 PC 및 PS 지질의 다양한 배합에 대한 시뮬레이션을 수행했습니다. 정전기 상호 작용은 음이온 PS 지질에 대한 D112의 초기 결합을 유도하는 반면, 소수성 상호 작용은 두 가지 가능한 메커니즘을 통해 분자를 막 코어로 끌어당깁니다(그림 7A-B 참조). 멤브레인 내부에서 D112는 단량체 또는 이량체로 PC가 풍부한 도메인에 우선적으로 국한됩니다.

그림 7. 제시된 프로토콜을 따르는 추가 샘플 시스템. 두 개의 삽입 메커니즘 (A) 작살 및 (B) 플립을 식별하는 모델 멤브레인을 사용한 D112 시뮬레이션; (C) D112 이량체의 배향; (D) 하전된 지질(주황색 클러스터)에 대한 멤브레인 모델에서 D112 분자의 측면 분포(파란색 등고선 지도). 전체 연구는 ¹⁷에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험 기술은 초저온 전자 현미경(Cryo-EM)⁵⁸, 형광 기술 및 원자력 현미경(AFM)⁵⁹을 사용하여 생체 분자를 고해상도로 시각화할 수 있습니다. 그러나 생물학적 경로, 질병 발병기전 및 원자 또는 아미노산 수준에서 치료 전달의 기초가 되는 분자 상호 작용의 상호 작용과 역학을 포착하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 지질막을 연구하기 위한 MD 시뮬레이션의 기능과 이러한 시스템을 설계, 구축, 실행 및 분석하는 주요 단계에 대해 논의했습니다. 이 계산 방법의 장점은 분자 상호 작용을 모델링하여 막 계면에서 분자 메커니즘을 제안하고 특성화하는 원자론적 세부 사항과 기본 방정식입니다.

세포막을 시뮬레이션할 때 중요한 단계는 연구할 생물학적 시스템에 대한 확실한 이해입니다. 포함할 지질 종은 유기체, 세포 구획 및 가장 중요한 연구 과정에 따라 다릅니다. 대칭 멤브레인을 사용한 시뮬레이션은 초보 MD 사용자에게 좋은 출발점입니다. 비대칭은 PM과 같은 멤브레인의 알려진 특징이지만, 측면 확산 및 전단지 간 스테롤 교환을 적절하게 샘플링하기 위해 더 긴 시뮬레이션 시간이 필요하기 때문에 잠재적인 어려움을 가중시킵니다. 비대칭은 또한 시뮬레이션^52,53에서 주의 깊게 처리되어야 하는 각 전단의 APL에 불일치를 초래한다. 또 다른 중요한 단계는 시뮬레이션할 멤브레인 패치의 크기를 결정하는 것인데, 이는 지질 혼합물의 복잡성과 사용 가능한 계산 리소스에 따라 달라집니다. 더 큰 멤브레인 패치는 컴퓨팅 시간이 더 오래 걸리며, 이는 항상 실현 가능하지 않을 수 있습니다. 균질 또는 이원 시스템의 경우 최소 150개의 지질/리플릿 크기, 더 복잡한 구성의 경우 최대 600개의 지질/리플릿 크기가 권장됩니다. 멤브레인 모델이 단백질-멤브레인 연구에 사용되는 경우, 단백질의 가장 긴 치수의 2-3배를 수용할 수 있는 멤브레인 패치를 만드는 것이 좋습니다. 작은 분자를 검사할 때 패치 크기 범위는 유한 크기 효과를 피하기 위해 30%-40% 미만으로 유지되어야 합니다. 평형을 결정하기 위한 메트릭에 따라 복잡한 지질 혼합물은 순수 지질 또는 이원 혼합물에 비해 시뮬레이션 시간이 최소 3배 더 오래 걸릴 수 있습니다.

생체 분자 시뮬레이션을 위한 초기 좌표를 설정하는 여러 가지 옵션이 있습니다. 일반적인 소프트웨어 패키지에는 GROMACS³⁶, VMD⁴², PACKMOL 60, Moltemplate⁶¹ 및 CHARMM-GUI⁶²가 포함됩니다. C-GUI는 지질 라이브러리에 다양한 분자를 사용하여 이러한 시스템을 쉽게 구축할 수 있도록 설계된 웹 기반 플랫폼입니다. 다양한 MD 엔진 및 역장 매개변수에 대한 입력 파일을 제공하므로 초보자에게 좋은 출발점이 됩니다. 빌드 단계에서 C-GUI는 개별 지질 종에 대한 지질당 면적 추정치를 제공합니다. 복합 지질 혼합물(5+ 종)을 구축할 때, 특히 모델에서 스테롤을 사용하는 경우 이 추정치를 10%-15% 늘리는 것이 유용합니다. C-GUI 라이브러리에서 관심 지질을 찾을 수 없는 경우 가까운 지질 구조를 자리 표시자로 사용한 다음 시스템 구축 및 초기 완화 후 VMD 또는 Python 스크립트를 사용하여 구조를 수정할 수 있습니다. C36m은 부가적인 역장(⁶³)이기 때문에, 새로운 분자 내의 모든 원자 유형이 역장에 존재한다면, 일반적으로 업데이트된 지질 구조에 대해 재-파라미터화가 필요하지 않다. C-GUI에서 사용할 수 있는 모든 옵션이 이 프로토콜에서 다루어진 것은 아니지만 초보자와 관련된 옵션 및 해당 분야의 일반적인 관행에 부합하는 옵션이 표시되었습니다. 고급 옵션은 개발자^54,62,64에 의해 처리되고 게시되었습니다.

열역학적 앙상블, 온도 및 압력과 같은 시뮬레이션 조건은 연구의 성격에 따라 달라집니다. 이 프로토콜의 경우 조건은 C-GUI에서 기본값으로 유지되었으며, 이는 유체 상의 멤브레인 시뮬레이션에 일반적입니다. 겔상은 생체막을 모델링하는 것이 바람직하지 않고, 지질의 전이 온도 이하에서 발생하며, 지질 꼬리가 비스듬히 평행하게 정렬되어 인식하기 쉽다. 이것은 다른 연구 목표 또는 공동 연구자의 실험에 따라 변경될 수 있습니다. MD 실행 동안, 막 이중층에 대한 일반적인 설정은 다음을 포함한다: (1) AA MD가 수소-산소 결합(⁶⁵)의 가장 빠른 진동 운동을 포착하기 위한 1-4 fs 시간 단계; 일반적으로 생산에는 2fs가 사용되지만 완화 및 최소화 단계에서는 1fs가 사용되며 HMR⁵¹ 을 사용하는 경우 4fs를 사용할 수 있습니다. (2) 0.05-0.2ns 사이의 데이터 저장 주파수가 일반적입니다. (3) van der Waal 상호 작용에 대해 1.0 및 1.2nm의 연질 및 경질 절단이 있는 Verlet 컷오프 방식⁶⁶. 차단 반경을 더 크게 설정하면 원자 쌍 간에 더 많은 상호 작용이 계산되므로 시뮬레이션 성능이 저하됩니다. 그러나 일반적으로 2.0-2.4nm의 컷오프가 필요한 측면 압력 프로파일을 계산하려면 더 큰 컷오프가 필요합니다. (4) 컷오프가 1.2nm인 입자 메쉬 에드워드(PME) 방식(⁶⁷ )은 장거리 정전기 상호작용에 사용되고; (5) LINCS 알고리즘(⁶⁸ )은 수소 결합을 제한하기 위해 GROMACS에서 사용되고; (6) 일반적인 압력 조절기는 이중층에 대해 반 등방성으로 적용되는 Parrinello-Rahman barostat입니다. (7) 일반적인 온도 조절기는 Nose-Hoover 온도 조절기입니다. 시뮬레이션에 사용할 수 있는 여러 유형의 기압계와 서모스탯이 있으며 연구⁶⁹의 특성에 따라 다릅니다.

APL, 멤브레인 두께 및 스테롤 플립플롭은 시스템이 열 평형에 도달했는지 여부를 결정하는 일반적인 메트릭이며, 선택한 메트릭에 따라 순수 이중층의 경우 50ns에서 복잡한 비대칭 혼합물의 경우 4000ns까지 다양할 수 있습니다. 이중층의 기계적, 구조적, 동적 특성에 대한 분석은 평형에 도달한 후, 즉 관심 특성이 안정기에 도달하고 평균값에 대해 변동하는 후에 계산해야 합니다. 생산 단계라고도 하는 궤적의 평형 부분은 적절한 통계 분석 및 불확실성 추정을 위해 최소 100ns 길이여야 합니다. 시뮬레이션으로부터 계산될 수 있는 일반적인 막 특성은, 중수소 순서 파라미터들, 전자 밀도 프로파일들, 방사형 분포 함수들, 지질 테일들 또는 헤드그룹들의 기울기 각도들, 압축성 탄성률, 지질 회전의 이완 시간들, 굽힘 탄성률, 횡방향 프로파일들, 지질 클러스터링 패턴들, 및 막 계면(^35,70) 근방의 물 역학들을 포함하지만^, 이에 제한되는 것은 아니다^{. 71}; Moradi et al.의 리뷰는 이들 중 일부를 더 자세히 설명합니다⁷⁰. 이러한 분석은 GROMACS 및 VMD의 내장 분석 도구를 사용하거나 Python, Bash 또는 TCL 스크립팅을 사용하여 수행할 수 있습니다. 또한 MDAnalysis 72,73, MDTraj⁷⁴, Pysimm 75^, Pyemma 76 및 PyLipID ⁷⁷과 같은 많은 오픈 소스 Python 라이브러리가 있어 시뮬레이션 궤적 분석을 용이하게 합니다.

이 프로토콜은 모든 원자 접근법에 중점을 두고 있으며, 연구의 목표가 큰 막 패치와 상호 작용하는 큰 단백질의 역학을 특성화하는 것이라면 계산이 까다롭습니다. 그럼에도 불구하고 계산 능력의 증가와 GPU(그래픽 단위 프로세서)의 사용은 더 큰 시스템의 시뮬레이션을 선호했습니다. MD 시뮬레이션은 실험 값을 정확하게 재현하는 속성 평균을 계산하기 위해 시스템 구조의 충분한 샘플링이 필요합니다. 사실적인 막 모델링은 관심 세포막에 대한 정확한 기계적 및 구조적 환경을 재현하는 것을 목표로 하며, 이는 다른 생체 분자의 상호 작용에 직접적인 영향을 미치고 희귀 사건의 샘플링을 용이하게 합니다^78,79,80. 데이터를 해석할 때, 모델 시스템이 시뮬레이션의 인공물일 뿐만 아니라 비생리학적 사건을 구성하지 않는지 확인하기 위해 유사한 시스템에 대한 실험 경향 또는 실제 값을 갖는 관찰을 검증하는 데 주의를 기울여야 한다(⁷⁸). 결론적으로, MD 시뮬레이션은 통계적 열역학을 기반으로 분자 상호 작용을 조사하는 강력한 모델입니다. MD 시뮬레이션은 지질 다양성이 막 구조 및 기계적 특성에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 세포 과정 중에 생체 분자와 다양한 상호 작용을 초래합니다. 이 프로토콜은 복잡한 지질막 시스템을 설계, 구축, 실행 및 분석하기 위한 초보자 친화적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 단계는 멤브레인 전용 시스템뿐만 아니라 멤브레인 계면 근처의 단백질 또는 작은 분자를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다.

저자는 공개할 경쟁 관심사가 없습니다.

저자는 이 원고를 작성하는 동안 시뮬레이션 궤적과 토론에 대해 Jinhui Li와 Ricardo X. Ramirez에게 감사를 표합니다. OC는 University at Buffalo Presidential Fellowship과 National Institute of Health의 학생 개발 교육 보조금 극대화를 위한 이니셔티브 1T32GM144920-01의 지원을 받아 Margarita L. Dubocovich(PI)에게 수여되었습니다.