Modelado realista de membranas utilizando mezclas lipídicas complejas en estudios de simulación

La diversidad lipídica de la membrana en estructura y composición es un importante contribuyente a los procesos celulares y puede ser un marcador de enfermedad. Las simulaciones de dinámica molecular nos permiten estudiar las membranas y sus interacciones con biomoléculas a resolución atomística. Aquí, proporcionamos un protocolo para construir, ejecutar y analizar sistemas de membranas complejos.

Los lípidos son componentes estructurales de las membranas celulares; Las especies de lípidos varían entre los orgánulos celulares y entre los organismos. Esta variedad da como resultado diferentes propiedades mecánicas y estructurales en la membrana que impactan directamente en las moléculas y procesos que ocurren en esta interfaz. La composición lipídica es dinámica y puede servir para modular los procesos de señalización celular. Los enfoques computacionales se utilizan cada vez más para predecir las interacciones entre biomoléculas y proporcionar información molecular a los observables experimentales. La dinámica molecular (MD) es una técnica basada en la mecánica estadística que predice el movimiento de los átomos en función de las fuerzas que actúan sobre ellos. Las simulaciones de MD se pueden utilizar para caracterizar la interacción de biomoléculas. Aquí, presentamos brevemente la técnica, describimos los pasos prácticos para principiantes que estén interesados en simular bicapas lipídicas, demostramos el protocolo con un software amigable para principiantes y discutimos alternativas, desafíos y consideraciones importantes del proceso. En particular, enfatizamos la relevancia del uso de mezclas lipídicas complejas para modelar una membrana celular de interés para capturar los entornos hidrofóbicos y mecánicos apropiados en la simulación. También discutimos algunos ejemplos en los que la composición y las propiedades de la membrana modulan las interacciones de las bicapas con otras biomoléculas.

Los lípidos son los principales constituyentes de las membranas, que proporcionan límites para las células y permiten la compartimentación intracelular ^1,2,3. Los lípidos son anfifílicos, con un grupo de cabeza polar y dos colas de ácidos grasos hidrofóbicos; Estos se autoensamblan en una bicapa para minimizar el contacto de las cadenas hidrofóbicas con el agua ^3,4. Varias combinaciones de grupos de cabezas hidrofílicas y colas hidrofóbicas dan como resultado diferentes clases de lípidos en las membranas biológicas, como glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles (Figura 1)^1,5,6. Los glicerofosfolípidos son componentes primarios de las membranas celulares eucariotas compuestas de glicerofosfato, ácidos grasos de cadena larga y grupos principales de bajo peso molecular⁷. La nomenclatura lipídica se basa en las diferencias en los grupos de cabeza; algunos ejemplos son la fosfatidilcolina (PC), la fosfatidil-etanolamina (PE), la fosfatidil-serina (PS), el fosfatidilglicerol (PG), el fosfatidil-inositol (PI) o el ácido fosfatídico (PA) no ^{modificado5,6}. En cuanto a las colas hidrofóbicas, la longitud y el grado de saturación varían, junto con la estructura de la columna vertebral. Las combinaciones posibles son numerosas, resultando en miles de especies lipídicas en células de mamíferos⁶. Los cambios en la composición lipídica de la membrana conducen a diferentes propiedades mecánicas y estructurales de la membrana que afectan la actividad tanto de las proteínas integrales de membrana como de las proteínas periféricas ^2,6.

Figura 1. Estructuras lipídicas representativas. Las colas de ácidos grasos se muestran en cuadros azules, los grupos de cabezas de lípidos comunes en naranja y las columnas vertebrales de las muestras en púrpura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los lípidos son actores activos en los procesos celulares, en la activación de proteínas en las cascadas de señalización y en la homeostasis de las células sanas ^8,9. La alteración de la dinámica lipídica es el resultado de la infección o puede ser marcador de patogenia de la enfermedad 10,11,12,13,14,15. Como barreras para la célula, el estudio de los lípidos de membrana y su papel en la permeación de moléculas pequeñas es relevante para los sistemas de liberación de fármacos y los mecanismos de disrupción de la membrana^16,17. La diversidad química y las diferentes proporciones de especies lipídicas en orgánulos, tejidos y organismos dan lugar a una dinámica compleja de membranas². Por lo tanto, es importante mantener estas características en los estudios de modelización de bicapas lipídicas, especialmente cuando el objetivo de un estudio es examinar las interacciones de otras biomoléculas con la membrana. Las especies lipídicas a considerar en un modelo dependen del organismo y del compartimento celular de interés. Por ejemplo, los lípidos PG son importantes para la transferencia de electrones en la batería fotosintética¹⁸, mientras que los lípidos fosforilados de inositol (PIP) son actores importantes en la dinámica de la membrana plasmática (PM) y en las cascadas de señalización en las células de mamíferos^19,20. Dentro de la célula, el PM, el retículo endoplásmico (RE), Golgi y las membranas mitocondriales contienen abundancias lipídicas únicas que influyen en su función. Por ejemplo, el RE es el centro de la biogénesis lipídica y transporta el colesterol hacia el PM y el Golgi; contiene una alta diversidad lipídica con abundancia de PC y PE, pero bajo contenido de esteroles, lo que promueve la fluidez de la membrana^21,22,23,24. Por el contrario, el PM incorpora cientos e incluso miles de especies lipídicas dependiendo del organismo²⁵, contiene altos niveles de esfingolípidos y colesterol que le confieren una rigidez característica en comparación con otras membranas de la célula²⁴. Se debe considerar la asimetría de las valvas para membranas como la PM, que tiene una valva externa rica en esfingomielina, PC y colesterol, y una valva interna rica en PE, PI y PS que son importantes para las cascadas de señalización²⁴. Finalmente, la diversidad lipídica también propicia la formación de microdominios que difieren en el empaquetamiento y el orden interno, conocidos como balsas lipídicas^24,26; Estos exhiben asimetría lateral, se supone que juegan un papel importante en la señalización celular²⁶ y son difíciles de estudiar debido a su naturaleza transitoria.

Se han utilizado técnicas experimentales como la fluoroscopia, la espectroscopia y sistemas de membranas modelo como las vesículas unilamelares gigantes (GUV) para investigar las interacciones de las biomoléculas con las membranas. Sin embargo, la naturaleza compleja y dinámica de los componentes involucrados es difícil de capturar solo con métodos experimentales. Por ejemplo, existen limitaciones en la obtención de imágenes de los dominios transmembrana de las proteínas, la complejidad de las membranas utilizadas en dichos estudios y la identificación de estados intermedios o transitorios durante el proceso de interés^27,28,29. Desde el advenimiento de la simulación molecular de monocapas y bicapas lipídicas en la década de 1980²⁹, los sistemas lípido-proteína y sus interacciones pueden cuantificarse a nivel molecular. La simulación de dinámica molecular (MD) es una técnica computacional común que predice el movimiento de las partículas en función de sus fuerzas intermoleculares. Un potencial de interacción aditiva describe las interacciones enlazadas y no enlazadas entre las partículas del sistema³⁰. El conjunto de parámetros utilizados para modelar estas interacciones se denomina campo de fuerza de simulación (FF). Estos parámetros se obtienen a partir de cálculos ab initio, semiempíricos y de mecánica cuántica, y se optimizan para reproducir datos de experimentos de rayos X y difracción de electrones, RMN, espectroscopía infrarroja, Raman y de neutrones, entre otros métodos³¹.

Las simulaciones de MD se pueden utilizar para estudiar sistemas en varios niveles de resolución^32,33,34. Los sistemas que tienen como objetivo caracterizar interacciones biomoleculares específicas, enlaces de hidrógeno y otros detalles de alta resolución se estudian con simulaciones de todos los átomos (AA). Por el contrario, las simulaciones de grano grueso (CG) agrupan los átomos en grupos funcionales más grandes para reducir el costo computacional y examinar^{la dinámica a} mayor escala. Entre estos dos se encuentran las simulaciones de átomos unidos (UA), donde los átomos de hidrógeno se combinan con sus respectivos átomos pesados para acelerar el cálculo^33,35. Las simulaciones MD son una poderosa herramienta para la exploración de la dinámica de las membranas lipídicas y sus interacciones con otras moléculas y pueden servir para proporcionar mecanismos a nivel molecular para procesos de interés en la interfaz de la membrana. Además, las simulaciones de MD pueden servir para acotar objetivos experimentales y predecir las propiedades macromoleculares de un sistema determinado en función de las interacciones microscópicas.

En resumen, dado un conjunto de coordenadas iniciales, velocidades y un conjunto de condiciones como temperatura y presión constantes, las posiciones y velocidades de cada partícula se calculan a través de la integración numérica del potencial de interacción y la Ley del movimiento de Newton. Esto se repite de forma iterativa, generando así una trayectoria de simulación³⁰. Estos cálculos se realizan con un motor MD; entre varios paquetes de código abierto, GROMACS³⁶ es uno de los motores más utilizados y el que describimos aquí. También incluye herramientas para el análisis y la construcción de las coordenadas iniciales de los sistemas a simular³⁷. Otros motores MD incluyen NAMD³⁸; CHARMM³⁹ y AMBER⁴⁰, que el usuario puede seleccionar a su propia discreción en función del rendimiento computacional de un sistema determinado. Es fundamental visualizar las trayectorias durante la simulación, así como para el análisis e interpretación de los resultados. Hay una variedad de herramientas disponibles; aquí discutimos la dinámica molecular visual (VMD) que ofrece una amplia gama de características, incluida la visualización tridimensional (3-D) con métodos expansivos de dibujo y coloreado, la visualización de datos volumétricos, la construcción, preparación y análisis de trayectorias de sistemas de simulación MD y la creación de películas de trayectoria sin límites en el tamaño del sistema, si la memoria está disponible^41,42,43.

La precisión de la dinámica predicha entre los componentes del sistema está directamente influenciada por el FF elegido para la propagación de la trayectoria. Los esfuerzos empíricos de parametrización de FF son llevados a cabo por pocos grupos de investigación. Los FF más establecidos y comunes para la distrofia muscular incluyen CHARMM³⁹, AMBER 40, Martini⁴⁴, OPLS⁴⁵ y SIRAH⁴⁶. El campo de fuerza⁴⁷ del CHARMM36 aditivo de todos los átomos (C36) se usa ampliamente para AA MD de sistemas de membrana, ya que reproduce con precisión los datos estructurales experimentales. Fue desarrollado originalmente por la comunidad CHARMM y es compatible con múltiples motores MD como GROMACS y NAMD. A pesar de las mejoras en los FF comunes, existe un esfuerzo continuo para mejorar los conjuntos de parámetros para permitir predicciones que reproduzcan fielmente los observables experimentales, impulsados por el interés en sistemas particulares de estudio^48,49.

Un reto a la hora de simular membranas lipídicas es determinar la longitud de la trayectoria de simulación. Esto depende en gran medida de las métricas a analizar y del proceso que se pretenda caracterizar. Típicamente, las mezclas lipídicas complejas requieren más tiempo para alcanzar el equilibrio, ya que más especies deben tener tiempo suficiente para difundirse en el plano de la membrana y alcanzar una organización lateral estable. Se dice que una simulación está en equilibrio cuando la propiedad de interés ha alcanzado una meseta y fluctúa alrededor de un valor constante. Es una práctica común obtener al menos 100-200 ns de trayectoria equilibrada para llevar a cabo un análisis estadístico adecuado sobre las propiedades e interacciones de interés. Es común ejecutar simulaciones solo de membrana entre 200 y 500 ns, dependiendo de la complejidad de la mezcla de lípidos y la pregunta de investigación. Las interacciones proteína-lípidos suelen requerir tiempos de simulación más largos, entre 500 y 2000 ns. Algunos enfoques para acelerar el muestreo y la dinámica observable con sistemas de membranas son: (i) el modelo mimético de membrana altamente móvil (HMMM), que reemplaza los carbonos finales de los lípidos en la membrana con solvente orgánico para acelerar el muestreo⁵⁰; y ii) la repartición de la masa de hidrógeno (HMR), que combina una fracción de las masas de los átomos pesados dentro de un sistema con las de los átomos de hidrógeno para permitir el uso de un paso de tiempo de simulación más grande⁵¹.

En el siguiente protocolo se describe un enfoque fácil de usar para principiantes para crear, ejecutar y analizar modelos de membrana realistas mediante AA MD. Dada la naturaleza de las simulaciones de MD, se deben ejecutar múltiples trayectorias para tener en cuenta la reproducibilidad y el análisis estadístico adecuado de los resultados. Es una práctica actual ejecutar un mínimo de tres réplicas por sistema de interés. Una vez que se han seleccionado las especies lipídicas para el organismo y el proceso de interés, se describen y resumen en la Figura 2 los pasos básicos para construir, ejecutar y analizar una trayectoria de simulación de un sistema solo de membrana.

Figura 2. Esquema para ejecutar simulaciones de MD. Las casillas naranjas corresponden a los tres pasos principales descritos en el protocolo. Debajo está el flujo de trabajo del proceso de simulación. Durante la configuración del sistema, el sistema que contiene las coordenadas iniciales de un sistema de membrana solvatada se construye con un generador de entrada del sistema como CHARMM-GUI Membrane Builder. Después de transferir los archivos de entrada a un clúster informático de alto rendimiento, la trayectoria de simulación se propaga mediante un motor MD, como GROMACS. El análisis de la trayectoria se puede realizar en el clúster informático o en una estación de trabajo local junto con la visualización. A continuación, se lleva a cabo el análisis, ya sea utilizando paquetes con código de análisis incorporado, como GROMACS y VMD, o mediante scripts de Bash o varias bibliotecas de Python. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Construcción de las coordenadas del sistema

1. Navegue hasta CHARMM-GUI.org (C-GUI) usando un navegador web. En el menú superior, vaya a Generador de entrada, luego seleccione Generador de membranas en las opciones verticales en el lado izquierdo de la pantalla.
2. Para crear una bicapa, seleccione Bilayer Builder.
   NOTA: Los usuarios nuevos deben activar su cuenta gratuita antes de crear su primer conjunto de coordenadas.
3. Seleccione Sistema de solo membrana. Guarde el ID de trabajo generado para recuperar el sistema y continuar desde donde lo dejó durante el proceso si es necesario.
   1. Visualice los sistemas durante cada paso del proceso de creación haciendo clic en Ver estructura en el cuadro situado en la parte superior de la página, o descargando el archivo PDB resultante. Esté atento a los componentes faltantes, errores en la especie lipídica de entrada seleccionada o en el tamaño del parche.
4. Seleccione los componentes del sistema.
   1. Elija la opción Lípidos heterogéneos , incluso si construye una bicapa de un solo componente; y, a continuación, seleccione un tipo de caja rectangular .
   2. Seleccione 45 moléculas de agua por lípido para la opción de hidratación; Esto es suficiente para garantizar una bicapa completamente hidratada.
   3. Establezca la longitud de XY para que se base en el número de componentes lipídicos. A continuación, seleccione el número de lípidos que se incluirán para cada especie lipídica determinada antes del modelo. Para el caso de estudio que se discute en la siguiente sección, se construyó un modelo de membrana con 600 lípidos distribuidos simétricamente en dos valvas. Para modelar el RE de las células eucariotas se utilizó una mezcla de 336 lípidos DOPC, 132 DPPE, 60 CHOL, 72 POPI para el modelo PI; y 330 lípidos DOPC, 126 DPPE, 54 CHOL, 66 POPI y 24 DOPS para el modelo PI-PS.
      NOTA: C-GUI proporciona una biblioteca de estructuras lipídicas para elegir; Haga clic en las imágenes junto al nombre de la especie por su estructura química.
   4. Escriba el número deseado de moléculas en el folíolo superior e inferior en las dos casillas junto al nombre del lípido. Para el estudio de caso, se desea una composición de membrana simétrica: asegúrese de que no haya errores sobre el número inigualable de lípidos en el folíolo superior y el folíolo inferior. Si se desea asimetría, asegúrese de que el número total de lípidos en cada valva sea correcto. Para más detalles sobre la construcción de bicapas asimétricas, véase el trabajo de Park et ^al.52,53.
   5. Vaya a la parte superior de la lista de especies de lípidos y haga clic en el botón Mostrar información del sistema. Ensamble los componentes y complete el sistema.
   6. Seleccione la opción para incluir iones neutralizantes utilizando el algoritmo basado en la distancia para una convergencia más rápida⁵⁴.
   7. Deje la concentración de solución predeterminada de KCl en 0,15 mM. Esta es una concentración de sal típica para hacer que la caja de simulación sea neutra para bicapas de membrana.
      NOTA: Si se va a utilizar una concentración diferente, asegúrese de hacer clic en el botón Calcular composición de disolvente después de editarla.
5. Seleccione las condiciones y la configuración de la simulación.
   1. Seleccione CHARMM36m como la opción FF; Se usa comúnmente para simulaciones de lípidos y proteínas, pero el usuario puede seleccionar otras opciones discutidas en la introducción.
   2. Seleccione GROMACS como motor MD para obtener archivos de entrada de muestra en el formato correspondiente.
      NOTA: GROMACS se recomienda para nuevos usuarios porque tiene múltiples recursos en línea, tutoriales y foros de soporte. El usuario puede seleccionar entre varios motores MD para explorar opciones en términos de rendimiento de simulación y sintaxis de código.
   3. Seleccione el conjunto Partícula-Presión-Temperatura Constante (NPT), con diferencia el conjunto dinámico más utilizado en la simulación de bicapas lipídicas.
   4. Establezca la temperatura y la presión en Kelvin y bares como 303 K y 1 bar, respectivamente. Es típico establecer la temperatura entre 298 K y 310 K para el estudio de procesos biológicos para asegurar una bicapa en estado de desorden líquido.
      NOTA: La temperatura depende de las condiciones del proceso a simular y puede modificarse según sea necesario. En función de las especies lipídicas del modelo, establezca la temperatura para que esté por encima de la temperatura de transición de los componentes lipídicos puros antes de ejecutar la simulación.
6. Descargue los archivos resultantes y transfiéralos al clúster de equipos.
   1. Visualice el sistema final en un software de su elección, como VMD o PyMol, e inspeccione la configuración adecuada.
      NOTA: Es bueno verificar, por ejemplo, que haya suficiente agua alrededor de la membrana para que los lípidos no interactúen con los átomos de la imagen durante la simulación, y la configuración adecuada de la valva (una bicapa sin espacio ni agua en el medio).

2. Ejecución de simulaciones de MD

1. Cargue y descomprima los archivos de C-GUI en su clúster informático. Vaya al directorio Gromacs . Cree un script de envío de relajación.
2. Siga las directrices del clúster para el formato de un script de envío.
   1. Copie los comandos enumerados hasta justo encima del comentario # Production en el archivo README en el script de envío.
      NOTA: Este valor predeterminado de C-GUI es un bucle que ejecuta una relajación de 6 pasos del sistema. Si se desea un protocolo diferente y bien establecido, edítelo para leer las coordenadas que acaba de construir y descargar de C-GUI.
3. Envíe el script de relajación y confirme que se han descargado todos los archivos de salida para todos los pasos antes de pasar a la ejecución de producción. Al finalizar, compruebe los siguientes archivos de salida de GROMACS, generados durante la ejecución de 6 pasos: *..log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc
4. Cree un script de ejecución de producción.
   1. Utilice uno de los ejemplos de comandos gmx grompp y gmx mdrun de cualquiera de los pasos de relajación como plantilla.
   2. Antes de usar el script, asegúrese de crear un archivo *.mdp que contenga opciones de simulación similares a las del archivo step7_production.mdp proporcionado.
      NOTA: Las opciones predeterminadas proporcionadas son estándar para las simulaciones de membrana; Las indicaciones se enumeran en NM y el tiempo se da en picosegundos o número de pasos (picosegundos / paso de tiempo de integración). Actualice los nsteps para que se ejecuten hasta la longitud de simulación deseada (que es igual a dt * nsteps) y nst[x,v,f]out para actualizar la frecuencia de guardado de datos en el número de pasos de integración. Para el caso práctico, establezca los nsteps en 250 000 000 para una longitud de simulación de 500 ns (tiempo de simulación/paso de integración = 500 000 ps / 0,002 ps) y nst[x,v,f]out en 50 000 para guardar datos cada 100 ps
5. Antes de ejecutar la simulación real, ejecute estudios de referencia para determinar el mejor uso de los recursos.
   1. Ejecute el sistema durante 1-2 ns utilizando un número diferente de nodos informáticos.
      NOTA: El estudio de caso de ER se presentó en el clúster de computación de alto rendimiento⁵⁵ del Centro de Investigación Computacional (CCR) de la UB para 2 ns, donde se probó el rendimiento de 1 a 10 nodos.
   2. Compare el rendimiento en ns/día para cada configuración para determinar los recursos óptimos para la ejecución. Es una práctica común seleccionar el número de nodos que dan como resultado un 75%-80% del rendimiento máximo.
6. Ejecute la ejecución de producción.
   1. Ejecute cada sistema por triplicado para garantizar la reproducibilidad y realice análisis estadísticos de los datos.
   2. Amplíe la trayectoria en función de los puntos de referencia si se agota el tiempo de cola permitido para el envío en el clúster informático. Utilice los comandos gmx convert-tpr y, a continuación, gmx mdrun para continuar con la recopilación de trayectorias.
      NOTA: Las opciones se describen en la documentación de GROMACS en línea (https://manual.gromacs.org/).
   3. Para un sistema de membrana solamente, examine si el sistema ha alcanzado el equilibrio calculando el área por lípido a lo largo del tiempo. Si no es así, amplíe la trayectoria de simulación.

3. Analizar la trayectoria

1. Visualice el sistema antes de ejecutar el análisis para determinar las moléculas de interés y la parte de la trayectoria que se pretende caracterizar.
2. Comprima los archivos de trayectoria sin procesar (*.trr) cambiando el formato de archivo a *.xtc y/o omitiendo fotogramas para reducir el tamaño del archivo y facilitar una transferencia más eficiente a la estación local para su visualización y análisis.
   NOTA: Para sistemas de membranas grandes, se puede optar por eliminar el agua de la trayectoria para reducir aún más el tamaño de la lima. Esto se puede hacer con archivos de índice en GROMACS, scripts TCL en VMD o bibliotecas de Python como MDAnalysis y MDTraj.
3. Realice los análisis elegidos durante la parte equilibrada de la trayectoria, según lo determinado a partir de la serie temporal de área por lípido.
   NOTA: Consulte la discusión para obtener más detalles sobre los análisis típicos de membranas y cómo ejecutarlos.

Para ilustrar el uso del protocolo y los resultados que se pueden obtener, se discute un estudio comparativo de modelos de membrana para el retículo endoplásmico (RE). Los dos modelos de este estudio fueron: (i) el modelo PI, que contiene las cuatro principales especies lipídicas encontradas en el RE, y (ii) el modelo PI-PS, que añadió las especies lipídicas aniónicas de fosfatidilserina (PS). Estos modelos fueron utilizados posteriormente en un estudio de una proteína viral y cómo interactúa con la membrana, el interés por la PS ha sido citado como importante para la actividad de permeabilización de la proteína viral²³. Para incorporar variedad en las estructuras lipídicas de la cola, las composiciones de las membranas se establecieron como DOPC:DPPE:CHOL:POPI (56:22:10:12 mol%) y DOPC:DPPE:CHOL:POPI:DOPS (55:21:11:9:4 mol%).

Las membranas se generaron con CHARMM-GUI Membrane Builder. Para acomodar las 4 especies diferentes de lípidos y más tarde la proteína, las membranas simétricas se configuraron para contener 600 lípidos/valva. Se utilizaron los ajustes recomendados en el protocolo, con una temperatura de 303 K. Para garantizar réplicas independientes, el proceso de construcción se repitió tres veces para cada modelo de membrana, lo que resultó en una mezcla aleatoria diferente de lípidos cada vez. Después de construir los sistemas, los archivos de entrada se trasladaron al clúster⁵⁵ de computación de alto rendimiento del Centro de Investigación Computacional (CCR) de la UB para ejecutar simulaciones de MD utilizando la versión 2020.5 de GROMACS. Después de completar el protocolo de relajación de 6 pasos, se realizó una evaluación comparativa en un solo sistema por modelo (Figura 3), ya que el número de átomos es similar en todas las réplicas. El 75% del rendimiento máximo fue de ~78 ns/día, por lo tanto, se solicitaron como máximo 6 nodos en el clúster para las ejecuciones de producción. Cada réplica se ejecutó durante un máximo de 500 ns estableciendo nstep = 25 x 10⁷ en el archivo *.mdp y enviando extensiones al clúster según fuera necesario en función de las pruebas comparativas.

Figura 3. Ejecuciones de pruebas comparativas de ejemplo. Se utiliza para determinar el rendimiento del modelo PI (315.000 átomos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El área por lípido (APL) para cada réplica se muestra en la Figura 4. Esto se calculó a partir de las dimensiones XY de la caja de simulación almacenada en el archivo de salida de simulación *edr de GROMACS utilizando el programa integrado de energía. A continuación, se dividió la superficie total por el número de lípidos totales por valva para obtener una estimación del APL en cada modelo. Para todos los sistemas, el equilibrio se determinó como el punto en el que el APL alcanza una meseta y fluctúa alrededor de un valor constante. En todos estos sistemas, el equilibrio se alcanza dentro de los primeros 100 ns de trayectoria (véase la Figura 4). Sobre la base de esta métrica, se consideraron suficientes trayectorias de 500 ns para estos sistemas. Todos los demás análisis de estas bicapas se llevaron a cabo durante los últimos 400 ns de trayectoria, lo que se conoce como fase de equilibrio o de producción. Para determinar la incertidumbre en cada valor calculado, se recomienda promediar el bloque cada 10-20 ns. A partir del análisis APL, el modelo de membrana PI-PS tiene, en promedio, un área de superficie 0,7 Ų mayor que el modelo PI.

Figura 4. Ejemplos de área por lípido. (A) PI y (B) modelos PI-PS. Replicar 1, replicar 2 y replicar 3 para cada modelo se muestran en rojo, azul y verde. El equilibrio de todos los sistemas se produce dentro de los primeros 100 ns. La incertidumbre se reporta como el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, se presentan dos análisis sencillos sobre la estructura de la membrana. La Figura 5 muestra el espesor de la membrana, estimado por la distancia entre el centro de masa (COM) de los átomos de fosfato de los fosfolípidos en las valvas superior e inferior. Esto se calculó utilizando el programa de distancia en GROMACS, que requiere un archivo de índice que enumera dos grupos de átomos, uno para los grupos fosfato en el folíolo superior y otro grupo para los del folíolo inferior. Los resultados muestran una diferencia estadística entre los espesores de los dos modelos de membrana, ilustrando una relación inversa entre APL y el espesor de la membrana. Finalmente, en la Figura 6 se muestran los parámetros del orden de deuterio de cada especie lipídica, medida que cuantifica el orden de las colas lipídicas dentro del núcleo hidrofóbico bicapa⁵⁶. Las colas de ácidos grasos se clasifican como sn1, el que está unido al oxígeno terminal de la columna vertebral de glicerol, y sn2, unido al oxígeno central del grupo glicerol. Los resultados muestran que hay poca o ninguna diferencia entre el orden de las colas lipídicas entre los modelos, excepto para DPPE que muestra un ligero aumento en el orden de la cola sn1 en el modelo PI.

Figura 5. Ejemplos de espesor de membrana. (A) PI y (B) modelos PI-PS. Replicar 1, replicar 2 y replicar 3 para cada modelo se muestran en rojo, azul y verde. La incertidumbre se reporta como el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Ejemplos de parámetros de orden de deuterio. (A) DOPC, (B) DPPE, (C) POPI y (D) especies lipídicas DOPS. Líneas continuas para sn1, líneas discontinuas para sn2, modelo PI en rojo y modelo PI-PS en azul. La incertidumbre se reporta como el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los modelos complejos de membranas se pueden utilizar para estudiar la relevancia de especies lipídicas específicas y cómo estas modulan las interacciones de las biomoléculas con la membrana. Los estudios de muestras del laboratorio muestran: (1) la composición de la membrana modula las interacciones de las proteínas¹⁹, y (2) la saturación de la cola lipídica y la carga superficial de la membrana afectan la permeabilidad y la organización lateral de las moléculas pequeñas^17,57. Utilizando el protocolo descrito anteriormente y un análisis similar al presentado en los párrafos anteriores, el trabajo de Li et al. proporciona información a partir de experimentos y simulaciones sobre la interacción entre D112, un potencial agente de terapia fotodinámica, y diferentes mezclas de lípidos¹⁷. Se examinó una bicapa con lípidos de PC y PS en un experimento para caracterizar la partición de D112 en la bicapa. Se realizaron simulaciones de diferentes raciones de lípidos de PC y PS, con diferentes longitudes de cola y saturación de ácidos grasos, es decir, número de dobles enlaces, para determinar el efecto de la carga superficial y el ambiente hidrofóbico en la interacción D112-membrana. Mientras que las interacciones electrostáticas impulsan la unión inicial de D112 a los lípidos aniónicos de PS, las interacciones hidrofóbicas arrastran la molécula hacia el núcleo de la membrana a través de dos mecanismos posibles (ver Figura 7A-B). Dentro de la membrana, D112 se localiza preferentemente en dominios ricos en PC, ya sea como monómero o dímero.

Figura 7. Sistema de muestreo adicional siguiendo el protocolo presentado. Simulaciones de D112 con membranas modelo identificando dos mecanismos de inserción (A) arpón y (B) volteo; (C) orientación de los dímeros D112; y (D) distribución lateral de moléculas D112 (mapas de contorno azul) en un modelo de membrana con respecto a lípidos cargados (grupos naranjas). El estudio completo se puede encontrar en ¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las técnicas experimentales permiten visualizar biomoléculas de alta resolución utilizando criomicroscopía electrónica (crio-EM)⁵⁸, técnicas de fluorescencia y microscopía de fuerza atómica (AFM)⁵⁹. Sin embargo, es difícil captar la interacción y la dinámica de las interacciones moleculares que subyacen a las vías biológicas, la patogénesis de la enfermedad y la administración terapéutica a nivel atómico o de aminoácidos. Aquí, se discutieron las capacidades de las simulaciones de MD para estudiar membranas lipídicas y los principales pasos para diseñar, construir, ejecutar y analizar estos sistemas. La ventaja de este método computacional es el detalle atomístico y las ecuaciones subyacentes que modelan las interacciones moleculares para proponer y caracterizar los mecanismos moleculares en la interfaz de membrana.

Un paso crítico a la hora de simular membranas celulares es una sólida comprensión del sistema biológico que se va a estudiar. Las especies lipídicas a incluir dependen del organismo, del compartimento celular y, lo que es más importante, del proceso a estudiar. Las simulaciones con membranas simétricas son un buen punto de partida para los usuarios principiantes de MD. La asimetría, aunque es una característica conocida de membranas como la PM, añade dificultades potenciales porque requiere tiempos de simulación más largos para muestrear adecuadamente la difusión lateral y el intercambio de esteroles entre las valvas. La asimetría también introduce un desajuste en el APL de cada valva que debe ser tratado cuidadosamente en la simulación^52,53. Otro paso importante es determinar el tamaño del parche de membrana que se va a simular, que depende de la complejidad de la mezcla lipídica y de los recursos computacionales disponibles; Los parches de membrana más grandes requieren más tiempo de cálculo, lo que no siempre es factible. Se recomienda un tamaño de al menos 150 lípidos/valva para sistemas homogéneos o binarios, y hasta 600 lípidos/valva para composiciones más complejas. Si el modelo de membrana se utiliza para estudios proteína-membrana, una buena regla general es hacer un parche de membrana que pueda acomodar entre 2 y 3 veces la dimensión más larga de la proteína. Al examinar moléculas pequeñas, la cobertura del tamaño del parche debe permanecer por debajo del 30%-40% para evitar efectos de tamaño finito. Dependiendo de la métrica para determinar el equilibrio, las mezclas lipídicas complejas pueden requerir fácilmente tiempos de simulación al menos 3 veces más largos en comparación con las mezclas lipídicas puras o binarias.

Existen múltiples opciones para configurar las coordenadas iniciales de las simulaciones biomoleculares. Los paquetes de software más comunes incluyen GROMACS³⁶, VMD 42, PACKMOL⁶⁰, Moltemplate⁶¹ y CHARMM-GUI⁶². C-GUI es una plataforma basada en la web diseñada para facilitar la construcción de estos sistemas, con una amplia variedad de moléculas en su biblioteca de lípidos. Proporciona archivos de entrada para diferentes motores MD y parámetros de campo de fuerza, lo que lo convierte en un excelente punto de partida para principiantes. Durante los pasos de construcción, C-GUI proporciona estimaciones del área por lípido para especies de lípidos individuales. Es útil aumentar esta estimación en un 10%-15% cuando se construyen mezclas lipídicas complejas (5+ especies), especialmente si se utilizan esteroles en el modelo. Si no se encuentra un lípido de interés en la biblioteca C-GUI, se puede utilizar una estructura lipídica cercana como marcador de posición y luego modificar la estructura utilizando scripts VMD o Python después de la construcción y relajación inicial del sistema. Dado que C36m es un campo de fuerza aditivo⁶³, generalmente no es necesaria una reparametrización para la estructura lipídica actualizada, siempre que todos los tipos de átomos en la nueva molécula estén presentes en el campo de fuerza. Cabe señalar que no todas las opciones disponibles en C-GUI se han cubierto en este protocolo, pero se han mostrado las relevantes para los principiantes y las que están en línea con las prácticas comunes en el campo; Las opciones avanzadas han sido abordadas y publicadas por los desarrolladores^54,62,64.

Las condiciones de simulación, como el conjunto termodinámico, la temperatura y la presión, dependerán de la naturaleza del estudio. Para este protocolo, las condiciones se mantuvieron como las predeterminadas en C-GUI, que son típicas de las simulaciones de membrana en la fase fluida. La fase de gel no es deseable para modelar membranas biológicas, ocurre por debajo de la temperatura de transición de los lípidos y es fácil de reconocer por la alineación paralela de las colas de los lípidos en ángulo. Esto puede cambiar para diferentes objetivos de estudio o de acuerdo con los experimentos de los colaboradores, si los hubiera. Durante las ejecuciones de MD, los ajustes típicos para las bicapas de membrana incluyen: (1) paso de tiempo de 1-4 fs para que AA MD capture los movimientos vibratorios más rápidos de los enlaces hidrógeno-oxígeno⁶⁵; normalmente se utilizan 2 fs para la producción, pero se utiliza 1 fs durante los pasos de relajación y minimización, y se pueden utilizar 4 fs si se emplea HMR⁵¹ ; (2) las frecuencias de ahorro de datos entre 0,05 y 0,2 ns son una práctica común; (3) Esquema de corte de Verlet⁶⁶, con un punto de corte suave y duro de 1,0 y 1,2 nm para las interacciones de van der Waal. Establecer un radio de corte más grande reduce el rendimiento de la simulación a medida que se calculan más interacciones entre pares de átomos; Sin embargo, se necesita un punto de corte mayor para calcular los perfiles de presión lateral, que normalmente requieren cortes de 2,0-2,4 nm; (4) el esquema⁶⁷ de malla de partículas Edward (PME) con un punto de corte de 1,2 nm se utiliza para interacciones electrostáticas de largo alcance; (5) el algoritmo LINCS⁶⁸ se utiliza en GROMACS para restringir los enlaces de hidrógeno; (6) un controlador de presión común es el barostato Parrinello-Rahman aplicado semi-isotrópicamente para bicapas; (7) un controlador de temperatura común es el termostato Nose-Hoover. Obsérvese que existen múltiples tipos de barostatos y termostatos que pueden utilizarse en la simulación y dependen de la naturaleza del estudio⁶⁹.

El APL, el espesor de la membrana y el flip-flop de esteroles son métricas comunes para determinar si un sistema ha alcanzado el equilibrio térmico, que puede oscilar entre 50 ns para bicapas puras y 4000 ns para mezclas asimétricas complejas, según la métrica elegida. El análisis de las propiedades mecánicas, estructurales y dinámicas de la bicapa debe calcularse después de que se alcanza el equilibrio, es decir, una vez que la propiedad de interés alcanza una meseta y fluctúa con respecto a un valor promedio. La parte equilibrada de la trayectoria, también conocida como fase de producción, debe tener una longitud mínima de 100 ns para un análisis estadístico adecuado y estimaciones de incertidumbre. Las propiedades comunes de la membrana que se pueden calcular a partir de la simulación incluyen, entre otros, parámetros de orden de deuterio, perfiles de densidad electrónica, funciones de distribución radial, ángulos de inclinación de las colas o grupos de cabeza de los lípidos, módulo de compresibilidad, tiempos de relajación de la rotación de los lípidos, módulo de flexión, perfiles de presión lateral, patrones de agrupamiento de lípidos y dinámica del agua cerca de la interfaz de la membrana^{35,70, 71}; una revisión de Moradi et al. describe algunos de ellos con más detalle⁷⁰. Estos análisis se pueden llevar a cabo con herramientas analíticas integradas de GROMACS y VMD, o utilizando secuencias de comandos de Python, Bash o TCL. También hay muchas bibliotecas de Python de código abierto como MDAnalysis 72,73, MDTraj 74, Pysimm 75^, Pyemma 76 y PyLipID ⁷⁷ que facilitan el análisis de trayectorias de simulación.

Este protocolo se centra en un enfoque de todos los átomos, que es computacionalmente exigente si el objetivo de un estudio es caracterizar la dinámica de proteínas grandes que interactúan con grandes parches de membrana. Sin embargo, el aumento de la potencia computacional y el uso de procesadores de unidades gráficas (GPU) ha favorecido las simulaciones de sistemas más grandes. Las simulaciones de MD requieren suficiente muestreo de las conformaciones del sistema para calcular promedios de propiedades que reproduzcan con precisión los valores experimentales. El modelado realista de membranas tiene como objetivo reproducir un entorno mecánico y estructural preciso para la membrana celular de interés, que impacta directamente en la interacción de otras biomoléculas y facilita el muestreo de eventos raros^78,79,80. Al interpretar los datos, se debe tener cuidado de validar las observaciones con tendencias experimentales o valores reales para sistemas similares para verificar que los sistemas modelo no son solo un artefacto de la simulación o constituyen eventos no fisiológicos⁷⁸. En conclusión, las simulaciones MD son un modelo poderoso para examinar las interacciones moleculares basadas en la termodinámica estadística. Las simulaciones de MD se pueden utilizar para examinar los efectos de la diversidad lipídica en las propiedades estructurales y mecánicas de la membrana, lo que a su vez da lugar a diferentes interacciones con las biomoléculas durante los procesos celulares. El protocolo proporciona un enfoque amigable para principiantes para diseñar, construir, ejecutar y analizar sistemas complejos de membranas lipídicas. Estos pasos sirven para simular sistemas de membrana solamente, así como proteínas o moléculas pequeñas cerca de la interfaz de membrana.

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Los autores agradecen a Jinhui Li y Ricardo X. Ramírez por sus trayectorias de simulación y discusiones durante la redacción de este manuscrito. O.C. contó con el apoyo de la Beca Presidencial de la Universidad de Buffalo y la Iniciativa para Maximizar la Capacitación en Desarrollo Estudiantil del Instituto Nacional de Salud 1T32GM144920-01 otorgada a Margarita L. Dubocovich (PI).