Modellazione realistica delle membrane utilizzando miscele lipidiche complesse negli studi di simulazione

La diversità dei lipidi di membrana nella struttura e nella composizione è un importante contributo ai processi cellulari e può essere un marcatore di malattia. Le simulazioni di dinamica molecolare ci permettono di studiare le membrane e le loro interazioni con le biomolecole a risoluzione atomistica. Qui forniamo un protocollo per costruire, eseguire e analizzare sistemi a membrana complessi.

I lipidi sono elementi costitutivi strutturali delle membrane cellulari; Le specie lipidiche variano tra gli organelli cellulari e tra gli organismi. Questa varietà si traduce in diverse proprietà meccaniche e strutturali nella membrana che hanno un impatto diretto sulle molecole e sui processi che si verificano in questa interfaccia. La composizione lipidica è dinamica e può servire a modulare i processi di segnalazione cellulare. Gli approcci computazionali sono sempre più utilizzati per prevedere le interazioni tra biomolecole e fornire informazioni molecolari agli osservabili sperimentali. La dinamica molecolare (MD) è una tecnica basata sulla meccanica statistica che prevede il movimento degli atomi in base alle forze che agiscono su di essi. Le simulazioni MD possono essere utilizzate per caratterizzare l'interazione delle biomolecole. Qui, introduciamo brevemente la tecnica, delineiamo i passaggi pratici per i principianti che sono interessati a simulare i doppi strati lipidici, dimostriamo il protocollo con un software adatto ai principianti e discutiamo le alternative, le sfide e le considerazioni importanti del processo. In particolare, sottolineiamo l'importanza dell'utilizzo di miscele lipidiche complesse per modellare una membrana cellulare di interesse per catturare gli ambienti idrofobici e meccanici appropriati nella simulazione. Discutiamo anche alcuni esempi in cui la composizione e le proprietà della membrana modulano le interazioni dei doppi strati con altre biomolecole.

I lipidi sono i principali costituenti delle membrane, che forniscono confini per le cellule e consentono la compartimentazione intracellulare ^1,2,3. I lipidi sono anfifilici, con un gruppo di teste polari e due code di acidi grassi idrofobici; Questi si auto-assemblano in un doppio strato per ridurre al minimo il contatto delle catene idrofobiche con l'acqua ^3,4. Varie combinazioni di gruppi di teste idrofile e code idrofobiche danno luogo a diverse classi di lipidi nelle membrane biologiche, come glicerofosfosfolipidi, sfingolipidi e steroli (Figura 1)^1,5,6. I glicerofosfolipidi sono elementi costitutivi primari delle membrane cellulari eucariotiche composte da glicerofosfato, acidi grassi a catena lunga e gruppi di testa a basso peso molecolare⁷. La nomenclatura dei lipidi si basa sulle differenze nei gruppi di teste; esempi includono fosfatidil-colina (PC), fosfatidil-etanolammina (PE), fosfatidil-serina (PS), fosfatidil-glicerolo (PG), fosfatidil-inositolo (PI) o acido fosfatidico non modificato (PA)^5,6. Per quanto riguarda le code idrofobiche, la lunghezza e il grado di saturazione variano, insieme alla struttura della spina dorsale. Le combinazioni possibili sono numerose, dando vita a migliaia di specie lipidiche nelle cellule dei mammiferi⁶. I cambiamenti nella composizione lipidica della membrana portano a diverse proprietà meccaniche e strutturali della membrana che influiscono sull'attività sia delle proteine integrali di membrana che delle proteine periferiche ^2,6.

Figura 1. Strutture lipidiche rappresentative. Le code degli acidi grassi sono mostrate in riquadri blu, i gruppi di teste lipidiche comuni in arancione e le spine dorsali dei campioni in viola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I lipidi sono attori attivi nei processi cellulari, nell'attivazione delle proteine nelle cascate di segnalazione e nell'omeostasi delle cellule sane ^8,9. Le dinamiche lipidiche alterate sono il risultato di un'infezione o possono essere marcatori di patogenesi della malattia 10,11,12,13,14,15. Come barriere per la cellula, lo studio dei lipidi di membrana e del loro ruolo nella permeazione di piccole molecole è di rilevanza per i sistemi di somministrazione dei farmaci e i meccanismi di rottura della membrana^16,17. La diversità chimica e i diversi rapporti delle specie lipidiche tra organelli, tessuti e organismi danno origine a complesse dinamiche di membrana². È quindi importante mantenere queste caratteristiche negli studi di modellizzazione dei doppi strati lipidici, soprattutto quando l'obiettivo di uno studio è quello di esaminare le interazioni di altre biomolecole con la membrana. Le specie lipidiche da considerare in un modello dipendono dall'organismo e dal compartimento cellulare di interesse. Ad esempio, i lipidi PG sono importanti per il trasferimento di elettroni nella bateria fotosintetica¹⁸, mentre i lipidi fosforilati dell'inositolo (PIP) sono i principali attori nella dinamica della membrana plasmatica (PM) e nelle cascate di segnalazione nelle cellule di mammifero ^19,20. All'interno della cellula, il PM, il reticolo endoplasmatico (ER), il Golgi e le membrane mitocondriali contengono abbondanze lipidiche uniche che influenzano la loro funzione. Ad esempio, l'ER è il fulcro della biogenesi lipidica e trasporta il colesterolo verso il PM e il Golgi; contiene un'elevata diversità lipidica con abbondanza di PC e PE, ma un basso contenuto di steroli, che favorisce la fluidità della membrana^21,22,23,24. Al contrario, il PM incorpora centinaia e persino migliaia di specie lipidiche a seconda dell'organismo²⁵, contiene alti livelli di sfingolipidi e colesterolo che gli conferiscono una rigidità caratteristica rispetto ad altre membrane della cellula²⁴. L'asimmetria dei lembi deve essere presa in considerazione per membrane come il PM, che ha un foglietto esterno ricco di sfingomielina, PC e colesterolo e un foglietto interno ricco di PE, PI e PS che sono importanti per le cascate di segnalazione²⁴. Infine, la diversità lipidica induce anche la formazione di micro-domini che differiscono per impacchettamento e ordine interno, noti come zattere lipidiche^24,26; Questi mostrano un'asimmetria laterale, si ipotizza che svolgano un ruolo importante nella segnalazione cellulare²⁶ e sono difficili da studiare a causa della loro natura transitoria.

Tecniche sperimentali come la fluoroscopia, la spettroscopia e sistemi di membrane modello come le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono state utilizzate per studiare le interazioni delle biomolecole con le membrane. Tuttavia, la natura complessa e dinamica dei componenti coinvolti è difficile da catturare con i soli metodi sperimentali. Ad esempio, ci sono limitazioni sull'imaging dei domini transmembrana delle proteine, sulla complessità delle membrane utilizzate in tali studi e sull'identificazione di stati intermedi o transitori durante il processo di interesse^27,28,29. Dall'avvento della simulazione molecolare di monostrati e doppi strati lipidici negli anni '80²⁹, i sistemi lipidico-proteici e le loro interazioni possono ora essere quantificati a livello molecolare. La simulazione della dinamica molecolare (MD) è una tecnica computazionale comune che prevede il movimento delle particelle in base alle loro forze intermolecolari. Un potenziale di interazione additiva descrive le interazioni legate e non legate tra le particelle del sistema³⁰. L'insieme di parametri utilizzati per modellare queste interazioni è chiamato campo di forza di simulazione (FF). Questi parametri sono ottenuti da calcoli ab initio, calcoli semi-empirici e meccanici quantistici e ottimizzati per riprodurre dati provenienti da esperimenti di diffrazione di raggi X ed elettroni, NMR, infrarossi, Raman e spettroscopia neutronica, tra gli altri metodi³¹.

Le simulazioni MD possono essere utilizzate per studiare sistemi a vari livelli di risoluzione^32,33,34. I sistemi che mirano a caratterizzare specifiche interazioni biomolecolari, legami idrogeno e altri dettagli ad alta risoluzione vengono studiati con simulazioni all-atom (AA). Al contrario, le simulazioni a grana grossa (CG) raggruppano gli atomi in gruppi funzionali più grandi per ridurre i costi computazionali ed esaminare le dinamiche su scala più ampia³³. Tra questi due ci sono le simulazioni di atomi uniti (UA), in cui gli atomi di idrogeno sono combinati con i rispettivi atomi pesanti per accelerare il calcolo^33,35. Le simulazioni MD sono un potente strumento per l'esplorazione della dinamica delle membrane lipidiche e delle loro interazioni con altre molecole e possono servire a fornire meccanismi a livello molecolare per i processi di interesse all'interfaccia di membrana. Inoltre, le simulazioni MD possono servire a restringere gli obiettivi sperimentali e prevedere le proprietà macromolecolari di un dato sistema sulla base di interazioni microscopiche.

In breve, dato un insieme di coordinate iniziali, velocità e un insieme di condizioni come temperatura e pressione costanti, le posizioni e le velocità di ciascuna particella vengono calcolate attraverso l'integrazione numerica del potenziale di interazione e della legge del moto di Newton. Questa operazione viene ripetuta in modo iterativo, generando così una traiettoria di simulazione³⁰. Questi calcoli vengono eseguiti con un motore MD; tra i vari pacchetti open-source, GROMACS³⁶ è uno dei motori più comunemente usati e quello che descriviamo qui. Include anche strumenti per l'analisi e la costruzione delle coordinate iniziali dei sistemi da simulare³⁷. Altri motori MD includono NAMD³⁸; CHARMM³⁹ e AMBER⁴⁰, che l'utente può selezionare a propria discrezione in base alle prestazioni computazionali di un determinato sistema. È fondamentale visualizzare le traiettorie durante la simulazione, nonché per l'analisi e l'interpretazione dei risultati. Sono disponibili una varietà di strumenti; qui discutiamo la dinamica molecolare visiva (VMD) che offre un'ampia gamma di funzionalità, tra cui la visualizzazione tridimensionale (3-D) con metodi di disegno e colorazione espansivi, la visualizzazione dei dati volumetrici, la costruzione, la preparazione e l'analisi delle traiettorie dei sistemi di simulazione MD e la creazione di filmati di traiettorie senza limiti sulle dimensioni del sistema, se la memoria è disponibile^41,42,43.

L'accuratezza della dinamica prevista tra i componenti del sistema è direttamente influenzata dal FF scelto per la propagazione della traiettoria. Gli sforzi di parametrizzazione empirica di FF sono perseguiti da pochi gruppi di ricerca. I FF più consolidati e comuni per MD includono CHARMM³⁹, AMBER 40, Martini⁴⁴, OPLS 45 e SIRAH ⁴⁶. Il campo di forza⁴⁷ dell'additivo CHARMM36 di tutti gli atomi (C36) è ampiamente utilizzato per l'AA MD dei sistemi a membrana, in quanto riproduce accuratamente i dati strutturali sperimentali. È stato originariamente sviluppato dalla comunità CHARMM ed è compatibile con più motori MD come GROMACS e NAMD. Nonostante i miglioramenti tra i FF comuni, c'è uno sforzo continuo per migliorare i set di parametri per consentire previsioni che riproducano fedelmente le osservabili sperimentali, guidato dall'interesse per particolari sistemi di studio^48,49.

Una sfida quando si simulano le membrane lipidiche è determinare la lunghezza della traiettoria di simulazione. Ciò dipende in gran parte dalle metriche da analizzare e dal processo che si intende caratterizzare. Tipicamente, le miscele lipidiche complesse richiedono più tempo per raggiungere l'equilibrio, poiché più specie devono avere abbastanza tempo per diffondersi sul piano della membrana e raggiungere un'organizzazione laterale stabile. Si dice che una simulazione è in equilibrio quando la proprietà di interesse ha raggiunto un plateau e fluttua intorno a un valore costante. E' pratica comune ottenere almeno 100-200 ns di traiettoria equilibrata per effettuare opportune analisi statistiche sulle proprietà e interazioni di interesse. È comune eseguire simulazioni di sola membrana tra 200-500 ns, a seconda della complessità della miscela lipidica e della domanda di ricerca. Le interazioni proteina-lipidi richiedono in genere tempi di simulazione più lunghi, tra 500 e 2000 ns. Alcuni approcci per accelerare il campionamento e le dinamiche osservabili con i sistemi a membrana sono: (i) il modello mimetico di membrana altamente mobile (HMMM), che sostituisce i carboni finali dei lipidi nella membrana con solvente organico per accelerare il campionamento⁵⁰; e (ii) il ripartizionamento della massa dell'idrogeno (HMR), che combina una frazione delle masse degli atomi pesanti all'interno di un sistema con quelle degli atomi di idrogeno per consentire l'uso di una simulazione più ampia del timestep⁵¹.

Il seguente protocollo illustra un approccio adatto ai principianti per costruire, eseguire e analizzare modelli di membrana realistici utilizzando AA MD. Data la natura delle simulazioni MD, è necessario eseguire più traiettorie per tenere conto della riproducibilità e di una corretta analisi statistica dei risultati. La prassi corrente prevede l'esecuzione di almeno tre repliche per ogni sistema di interesse. Una volta che le specie lipidiche sono state selezionate per l'organismo e il processo di interesse, i passaggi di base per costruire, eseguire e analizzare una traiettoria di simulazione di un sistema di sola membrana sono delineati e riassunti nella Figura 2.

Figura 2. Schema per l'esecuzione di simulazioni MD. Le caselle arancioni corrispondono alle tre fasi principali descritte nel protocollo. Di seguito è riportato il flusso di lavoro del processo di simulazione. Durante la configurazione del sistema, il sistema contenente le coordinate iniziali di un sistema a membrana solvatato viene costruito con un generatore di input di sistema come CHARMM-GUI Membrane Builder. Dopo aver trasferito i file di input in un cluster di calcolo ad alte prestazioni, la traiettoria di simulazione viene propagata utilizzando un motore MD, ad esempio GROMACS. L'analisi della traiettoria può essere eseguita sul cluster di computer o su una stazione di lavoro locale insieme alla visualizzazione. L'analisi viene quindi eseguita, utilizzando pacchetti con codice di analisi incorporato come GROMACS e VMD, oppure utilizzando script Bash o varie librerie Python. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Costruire le coordinate del sistema

1. Passare a CHARMM-GUI.org (C-GUI) utilizzando un browser Web. Nel menu in alto, vai a Generatore di input, quindi seleziona Generatore di membrane dalle opzioni verticali sul lato sinistro dello schermo.
2. Per creare un bilayer, selezionare Bilayer Builder.
   NOTA: gli utenti per la prima volta devono attivare il proprio account gratuito prima di creare il primo set di coordinate.
3. Selezionare Sistema solo membrana. Salvare l'ID JOB generato per recuperare il sistema e continuare dal punto in cui si era interrotto durante il processo, se necessario.
   1. È possibile visualizzare i sistemi durante ogni fase del processo di costruzione facendo clic su Visualizza struttura nella casella situata nella parte superiore della pagina o scaricando il file PDB risultante. Fai attenzione ai componenti mancanti, agli errori nelle specie lipidiche di input selezionate o nelle dimensioni del cerotto.
4. Selezionare i componenti del sistema.
   1. Scegliere l'opzione Lipidi eterogenei , anche se si costruisce un doppio strato monocomponente; quindi selezionare un tipo di Riquadro rettangolare .
   2. Seleziona 45 molecole d'acqua per lipide per l'opzione di idratazione; Questo è sufficiente per garantire un doppio strato completamente idratato.
   3. Impostare la lunghezza di XY in base al numero di componenti lipidici. Quindi, selezionare il numero di lipidi da includere per ciascuna specie lipidica determinata prima del modello. Per il caso di studio discusso nella sezione successiva, è stato costruito un modello di membrana con 600 lipidi distribuiti simmetricamente in due foglietti. Per modellare l'ER delle cellule eucariotiche è stata utilizzata una miscela di 336 lipidi DOPC, 132 DPPE, 60 CHOL, 72 POPI per il modello PI; e 330 lipidi DOPC, 126 DPPE, 54 CHOL, 66 POPI e 24 DOPS per il modello PI-PS.
      NOTA: C-GUI fornisce una libreria di strutture lipidiche tra cui scegliere; Clicca sulle immagini accanto al nome della specie per la sua struttura chimica.
   4. Digitare il numero desiderato di molecole nel foglietto superiore e inferiore nelle due caselle accanto al nome del lipide. Per il caso di studio, è auspicabile una composizione simmetrica della membrana: assicurarsi che non vi siano errori sul numero ineguagliato di lipidi nel foglietto superiore e nel foglio inferiore. Se si desidera un'asimmetria, assicurarsi che il numero totale di lipidi in ogni foglietto sia corretto. Per i dettagli sulla costruzione di doppi strati asimmetrici, fare riferimento al lavoro di Park et ^al.52,53.
   5. Vai all'inizio dell'elenco delle specie lipidiche e fai clic sul pulsante Mostra le informazioni di sistema. Assemblare i componenti e completare il sistema.
   6. Selezionare l'opzione per includere gli ioni neutralizzanti utilizzando l'algoritmo basato sulla distanza per una convergenza più rapida⁵⁴.
   7. Lasciare la concentrazione predefinita della soluzione di KCl a 0,15 mM. Si tratta di una tipica concentrazione salina per rendere neutra la scatola di simulazione per i doppi strati di membrana.
      NOTA: Se è necessario utilizzare una concentrazione diversa, assicurarsi di fare clic sul pulsante Calcola composizione solvente dopo averlo modificato.
5. Selezionare le condizioni e le impostazioni di simulazione.
   1. Selezionare CHARMM36m come opzione FF; È comunemente usato per simulazioni di lipidi e proteine, ma l'utente può selezionare altre opzioni discusse nell'introduzione.
   2. Selezionare GROMACS come motore MD per ottenere file di input di esempio nel formato corrispondente.
      NOTA: GROMACS è consigliato per i nuovi utenti perché dispone di più risorse online, tutorial e forum per il supporto. L'utente può scegliere tra più motori MD per esplorare le opzioni in termini di simulazione, prestazioni e sintassi del codice.
   3. Selezionare l'insieme NPT (Constant Particle-Pressure-Temperature), di gran lunga l'insieme dinamico più utilizzato nella simulazione dei doppi strati lipidici.
   4. Impostare la temperatura e la pressione in Kelvin e bar rispettivamente a 303 K e 1 bar. È tipico impostare la temperatura tra 298 K e 310 K per lo studio dei processi biologici per garantire un doppio strato nello stato di disordine liquido.
      NOTA: La temperatura dipende dalle condizioni del processo da simulare e può essere modificata secondo necessità. A seconda delle specie lipidiche nel modello, impostare la temperatura in modo che sia al di sopra della temperatura di transizione dei componenti lipidici puri prima di eseguire la simulazione.
6. Scaricare i file risultanti e trasferirli nel cluster di computer.
   1. Visualizza il sistema finale su un software a tua scelta, come VMD o PyMol, e ispeziona la corretta configurazione.
      NOTA: È bene controllare, ad esempio, che ci sia abbastanza acqua intorno alla membrana in modo che i lipidi non interagiscano con gli atomi dell'immagine durante la simulazione, e una corretta impostazione del foglietto (un doppio strato senza spazio o acqua in mezzo).

2. Esecuzione di simulazioni MD

1. Caricare e decomprimere i file da C-GUI sul cluster di elaborazione. Passare alla directory Gromacs . Creare uno script di invio di rilassamento.
2. Seguire le linee guida del cluster per il formato di uno script di invio.
   1. Copiare i comandi elencati fino a poco sopra il commento # Production nel file README nello script di invio.
      NOTA: Questa impostazione predefinita di C-GUI è un loop che esegue un rilassamento del sistema in 6 fasi. Se si desidera un protocollo diverso e consolidato, modificarlo per leggere le coordinate appena compilate e scaricate dalla C-GUI.
3. Inviare lo script di rilassamento e verificare che tutti i file di output siano stati scaricati per tutti i passaggi prima di passare all'esecuzione di produzione. Al termine, verificare la presenza dei seguenti file di output da GROMACS, generati durante l'esecuzione in 6 passaggi: *.log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc
4. Creare uno script di esecuzione dell'ambiente di produzione.
   1. Usare come modello uno degli esempi di comandi gmx grompp e gmx mdrun di uno qualsiasi dei passaggi di rilassamento.
   2. Prima di utilizzare lo script, assicurarsi di creare un file *.mdp che contenga opzioni di simulazione simili a quelle del file step7_production.mdp fornito.
      NOTA: Le opzioni predefinite fornite sono standard per le simulazioni a membrana; Le variazioni sono elencate in nm e il tempo è espresso in picosecondi o numero di passi (picosecondi / passo temporale di integrazione). Aggiornare gli nsteps in modo che vengano eseguiti fino alla lunghezza di simulazione desiderata (che è uguale a dt * nsteps) e nst[x,v,f]out per aggiornare la frequenza di salvataggio dei dati in numero di passaggi di integrazione. Per il case study, impostare nsteps su 250.000.000 per una lunghezza di simulazione di 500 ns (tempo di simulazione/passo di integrazione = 500.000 ps / 0,002ps) e nst[x,v,f]out su 50.000 per salvare i dati ogni 100 ps
5. Prima di eseguire la simulazione vera e propria, eseguire studi di benchmark per determinare l'uso ottimale delle risorse.
   1. Eseguire il sistema per 1-2 ns utilizzando un numero diverso di nodi di calcolo.
      NOTA: Il caso di studio ER è stato presentato sul cluster di calcolo ad alte prestazioni⁵⁵ del centro UB per la ricerca computazionale (CCR) per 2 ns, dove le prestazioni sono state testate per 1-10 nodi.
   2. Confrontare le prestazioni in ns/giorno per ogni impostazione per determinare le risorse ottimali per l'esecuzione. È pratica comune selezionare il numero di nodi che determinano il 75%-80% delle prestazioni massime.
6. Eseguire il ciclo di produzione.
   1. Eseguire ogni sistema in triplice copia per garantire la riproducibilità e condurre analisi statistiche sui dati.
   2. Estendere la traiettoria in base ai benchmark se il tempo di coda consentito per l'invio nel cluster di elaborazione si esaurisce. Usate i comandi gmx convert-tpr, quindi gmx mdrun per continuare la raccolta delle traiettorie.
      NOTA: Le opzioni sono descritte nella documentazione GROMACS online (https://manual.gromacs.org/).
   3. Per un sistema di sola membrana, esaminare se il sistema ha raggiunto l'equilibrio calcolando l'area per lipide nel tempo. In caso contrario, estendere la traiettoria di simulazione.

3. Analisi della traiettoria

1. Visualizzare il sistema prima di eseguire l'analisi per determinare le molecole di interesse e la parte della traiettoria destinata alla caratterizzazione.
2. Comprimere i file di traiettoria grezzi (*.trr) modificando il formato del file in *.xtc e/o saltando i fotogrammi per ridurre le dimensioni del file e facilitare un trasferimento più efficiente alla stazione locale per la visualizzazione e l'analisi.
   NOTA: Per i sistemi a membrana di grandi dimensioni, si può scegliere di rimuovere l'acqua dalla traiettoria per ridurre ulteriormente le dimensioni del file. Questo può essere fatto con file di indice su GROMACS, script TCL su VMD o librerie Python come MDAnalysis e MDTraj.
3. Eseguire le analisi scelte durante la parte equilibrata della traiettoria, come determinato dalla serie temporale area per lipide.
   NOTA: Fare riferimento alla discussione per maggiori dettagli sulle tipiche analisi a membrana e su come eseguirle.

Per illustrare l'uso del protocollo e i risultati che si possono ottenere, viene discusso uno studio comparativo per modelli di membrana per il reticolo endoplasmatico (ER). I due modelli in questo studio erano (i) il modello PI, che contiene le prime quattro specie lipidiche trovate nel reticolo endoplasmatico, e (ii) il modello PI-PS, che ha aggiunto le specie lipidiche anioniche fosfatidilserina (PS). Questi modelli sono stati successivamente utilizzati in uno studio su una proteina virale e su come interagisce con la membrana, l'interesse per PS è stato citato come importante per l'attività di permeabilizzazione della proteina^{virale 23}. Per incorporare la varietà nelle strutture lipidiche della coda, le composizioni di membrana sono state impostate come DOPC:DPPE:CHOL:POPI (56:22:10:12 mol%) e DOPC:DPPE:CHOL:POPI:DOPS (55:21:11:9:4 mol%).

Le membrane sono state generate con CHARMM-GUI Membrane Builder. Per accogliere le 4 diverse specie lipidiche e successivamente la proteina, le membrane simmetriche sono state impostate per contenere 600 lipidi/foglietto. Sono state utilizzate le impostazioni consigliate nel protocollo, con una temperatura di 303 K. Per garantire repliche indipendenti, il processo di costruzione è stato ripetuto tre volte per ogni modello di membrana, ottenendo ogni volta una diversa miscela casuale di lipidi. Dopo aver creato i sistemi, i file di input sono stati spostati nel cluster di calcolo ad alte prestazioni⁵⁵ del centro UB per la ricerca computazionale (CCR) per eseguire simulazioni MD utilizzando GROMACS versione 2020.5. Dopo che il protocollo di rilassamento in 6 fasi è stato completato, il benchmarking è stato eseguito su un solo sistema per modello (Figura 3) poiché il numero di atomi è simile in tutte le repliche. Il 75% delle prestazioni massime è stato di ~78 ns/giorno, quindi sono stati richiesti al massimo 6 nodi nel cluster per le esecuzioni di produzione. Ogni replica è stata eseguita per un massimo di 500 ns impostando nstep = 25 x 10⁷ nel file *.mdp e inviando le estensioni al cluster in base alle esigenze in base ai benchmark.

Figura 3. Esempi di esecuzioni di benchmark. Utilizzato per determinare le prestazioni del modello PI (315.000 atomi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'area per lipide (APL) per ciascuna replica è mostrata nella Figura 4. Questo è stato calcolato dalle dimensioni XY della scatola di simulazione memorizzate nel file di output della simulazione *edr da GROMACS utilizzando il programma integrato energy. Quindi, l'area superficiale totale è stata divisa per il numero di lipidi totali per foglietto per fornire una stima dell'APL in ciascun modello. Per tutti i sistemi, l'equilibrio è stato determinato come il punto in cui l'APL raggiunge un plateau e fluttua intorno a un valore costante. In tutti questi sistemi, l'equilibrio viene raggiunto entro i primi 100 ns di traiettoria (vedi Figura 4). Sulla base di questa metrica, le traiettorie di 500 ns sono state ritenute sufficienti per questi sistemi. Tutte le altre analisi su questi doppi strati sono state effettuate negli ultimi 400 ns di traiettoria, nota come fase di equilibrio o di produzione. Per determinare l'incertezza in ogni valore calcolato, si consiglia di calcolare la media dei blocchi ogni 10-20 ns. Dall'analisi APL, il modello a membrana PI-PS ha, in media, una superficie maggiore di 0,7 Ų rispetto al modello PI.

Figura 4. Esempi di area per lipide. (A) Modelli PI e (B) PI-PS. Replica 1, Replica 2 e Replica 3 per ogni modello sono visualizzate in rosso, blu e verde. L'equilibrazione per tutti i sistemi avviene entro i primi 100 ns. L'incertezza è riportata come errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Inoltre, vengono presentate due semplici analisi sulla struttura della membrana. La Figura 5 mostra lo spessore della membrana, stimato dalla distanza tra il centro di massa (COM) degli atomi di fosfato dei fosfolipidi nei foglietti superiore e inferiore. Questo è stato calcolato utilizzando il programma a distanza in GROMACS, che richiede un file indice che elenca due gruppi di atomi, uno per i gruppi fosfato nel foglietto superiore e un altro gruppo per quelli nel foglietto inferiore. I risultati mostrano una differenza statistica tra gli spessori dei due modelli di membrana, illustrando una relazione inversa tra APL e spessore della membrana. Infine, la Figura 6 mostra i parametri dell'ordine del deuterio di ciascuna specie lipidica, una misura che quantifica l'ordine delle code lipidiche all'interno del nucleo idrofobico a doppio strato⁵⁶. Le code degli acidi grassi sono classificate come sn1, quella attaccata all'ossigeno terminale della spina dorsale del glicerolo, e sn2, attaccata all'ossigeno centrale del gruppo glicerolo. I risultati mostrano che c'è poca o nessuna differenza tra l'ordine delle code lipidiche tra i modelli, ad eccezione del DPPE che mostra un leggero aumento nell'ordine per la coda sn1 nel modello PI.

Figura 5. Esempi di spessore della membrana. (A) Modelli PI e (B) PI-PS. Replica 1, Replica 2 e Replica 3 per ogni modello sono visualizzate in rosso, blu e verde. L'incertezza è riportata come errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Esempi di parametri di ordine del deuterio. (A) DOPC, (B) DPPE, (C) POPI e (D) specie lipidiche DOPS. Linee continue per sn1, linee tratteggiate per sn2, modello PI in rosso e modello PI-PS in blu. L'incertezza è riportata come errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Modelli complessi di membrana possono essere utilizzati per studiare la rilevanza di specifiche specie lipidiche e il modo in cui queste modulano le interazioni delle biomolecole con la membrana. Gli studi di laboratorio mostrano: (1) la composizione della membrana modula le interazioni delle proteine¹⁹ e (2) la saturazione della coda lipidica e la permeazione dell'impatto della carica superficiale della membrana e l'organizzazione laterale delle piccole molecole^17,57. Utilizzando il protocollo sopra descritto e un'analisi simile a quella presentata nei paragrafi precedenti, il lavoro di Li et al. fornisce approfondimenti da esperimenti e simulazioni sull'interazione tra D112, un potenziale agente di terapia fotodinamica, e diverse miscele lipidiche¹⁷. Un doppio strato con lipidi PC e PS è stato esaminato in un esperimento per caratterizzare la partizione di D112 nel doppio strato. Abbiamo effettuato simulazioni di diverse razioni di lipidi PC e PS, con diverse lunghezze e saturazione della coda degli acidi grassi, cioè numero di doppi legami, per determinare l'effetto della carica superficiale e dell'ambiente idrofobico sull'interazione D112-membrana. Mentre le interazioni elettrostatiche guidano il legame iniziale di D112 ai lipidi PS anionici, le interazioni idrofobiche attirano la molecola nel nucleo della membrana attraverso due possibili meccanismi (vedi Figura 7A-B). All'interno della membrana, D112 si localizza preferenzialmente in domini ricchi di PC, sia come monomero che come dimero.

Figura 7. Sistema di campionamento aggiuntivo secondo il protocollo presentato. Simulazioni di D112 con membrane modello che identificano due meccanismi di inserzione (A) arpione e (B) flip; (C) orientamento dei dimeri D112; e (D) distribuzione laterale delle molecole di D112 (mappe di contorno blu) su un modello di membrana rispetto ai lipidi carichi (cluster arancioni). Lo studio completo può essere trovato in ¹⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le tecniche sperimentali possono visualizzare le biomolecole ad alta risoluzione utilizzando la microscopia crioelettronica (cryo-EM)⁵⁸, le tecniche di fluorescenza e la microscopia a forza atomica (AFM)⁵⁹. Tuttavia, è difficile catturare l'interazione e la dinamica delle interazioni molecolari che sono alla base dei percorsi biologici, della patogenesi della malattia e della somministrazione terapeutica a livello atomico o amminoacidico. In questo articolo, sono state discusse le capacità delle simulazioni MD per studiare le membrane lipidiche e i passaggi principali per progettare, costruire, eseguire e analizzare questi sistemi. Il vantaggio di questo metodo computazionale è il dettaglio atomistico e le equazioni sottostanti che modellano le interazioni molecolari per proporre e caratterizzare i meccanismi molecolari all'interfaccia di membrana.

Un passo fondamentale quando si simulano le membrane cellulari è una solida comprensione del sistema biologico da studiare. Le specie lipidiche da includere dipendono dall'organismo, dal compartimento cellulare e, soprattutto, dal processo da studiare. Le simulazioni con membrane simmetriche sono un buon punto di partenza per gli utenti MD principianti. L'asimmetria, sebbene sia una caratteristica nota di membrane come il PM, aggiunge potenziali difficoltà perché richiede tempi di simulazione più lunghi per campionare correttamente la diffusione laterale e lo scambio di steroli tra i foglietti. L'asimmetria introduce anche una discrepanza nell'APL di ogni foglietto che deve essere trattata con attenzione nella simulazione^52,53. Un altro passo importante è quello di determinare la dimensione del patch di membrana da simulare, che dipende dalla complessità della miscela lipidica e dalle risorse computazionali disponibili; I cerotti a membrana più grandi richiedono tempi di calcolo più lunghi, il che potrebbe non essere sempre fattibile. Si raccomanda una dimensione di almeno 150 lipidi/foglietto per sistemi omogenei o binari e fino a 600 lipidi/foglietto per composizioni più complesse. Se il modello di membrana viene utilizzato per gli studi proteina-membrana, una buona regola empirica è quella di realizzare un cerotto di membrana che possa ospitare tra 2-3 volte la dimensione più lunga della proteina. Quando si esaminano piccole molecole, la copertura delle dimensioni del cerotto dovrebbe rimanere al di sotto del 30%-40% per evitare effetti di dimensioni finite. A seconda della metrica per determinare l'equilibrio, le miscele lipidiche complesse possono facilmente richiedere tempi di simulazione almeno 3 volte più lunghi rispetto alle miscele lipidiche pure o binarie.

Sono disponibili diverse opzioni per impostare le coordinate iniziali per le simulazioni biomolecolari. I pacchetti software più comuni includono GROMACS³⁶, VMD 42, PACKMOL⁶⁰, Moltemplate 61 e CHARMM-GUI ⁶². C-GUI è una piattaforma web-based progettata per facilitare la costruzione di questi sistemi, con un'ampia varietà di molecole nella sua libreria lipidica. Fornisce file di input per diversi motori MD e parametri del campo di forza, rendendolo un ottimo punto di partenza per i principianti. Durante le fasi di costruzione, C-GUI fornisce stime dell'area per lipide per le singole specie lipidiche. È utile aumentare questa stima del 10%-15% quando si costruiscono miscele lipidiche complesse (5+ specie), soprattutto se si utilizzano steroli nel modello. Se un lipide di interesse non viene trovato nella libreria C-GUI, si può usare una struttura lipidica vicina come segnaposto e quindi modificare la struttura usando script VMD o Python dopo la costruzione e il rilassamento iniziale del sistema. Poiché C36m è un campo di forza additivo⁶³, di solito non è necessaria alcuna riparametrizzazione per la struttura lipidica aggiornata, a condizione che tutti i tipi di atomi nella nuova molecola siano presenti nel campo di forza. Va notato che non tutte le opzioni disponibili su C-GUI sono state trattate in questo protocollo, ma sono state mostrate quelle rilevanti per i principianti e quelle in linea con le pratiche comuni nel settore; Le opzioni avanzate sono state affrontate e pubblicate dagli sviluppatori^54,62,64.

Le condizioni di simulazione, come l'insieme termodinamico, la temperatura e la pressione, dipenderanno dalla natura dello studio. Per questo protocollo, le condizioni sono state mantenute come predefinite in C-GUI, che sono tipiche delle simulazioni a membrana nella fase fluida. La fase gel non è desiderabile per modellare le membrane biologiche, si verifica al di sotto della temperatura di transizione dei lipidi ed è facile da riconoscere dall'allineamento parallelo delle code lipidiche ad angolo. Questo può cambiare per diversi obiettivi di studio o in base agli esperimenti dei collaboratori, se presenti. Durante le esecuzioni MD, le impostazioni tipiche per i doppi strati di membrana includono: (1) passo temporale di 1-4 fs per AA MD per catturare i movimenti vibrazionali più veloci dei legami idrogeno-ossigeno⁶⁵; in genere vengono utilizzati 2 fs per la produzione, ma 1 fs viene utilizzato durante le fasi di rilassamento e minimizzazione e 4 fs possono essere utilizzati se viene impiegato HMR⁵¹ ; (2) le frequenze di salvataggio dei dati comprese tra 0,05-0,2 ns sono una pratica comune; (3) Schema di taglio^{Verlet 66}, con un taglio morbido e duro di 1,0 e 1,2 nm per le interazioni di van der Waal. L'impostazione di un raggio di taglio maggiore riduce le prestazioni di simulazione poiché vengono calcolate più interazioni tra le coppie di atomi; Tuttavia, è necessario un cutoff più grande per calcolare i profili di pressione laterale, che in genere richiedono cutoff di 2,0-2,4 nm; (4) lo schema⁶⁷ della maglia di particelle Edward (PME) con un cutoff di 1,2 nm è utilizzato per interazioni elettrostatiche a lungo raggio; (5) l'algoritmo LINCS⁶⁸ è utilizzato in GROMACS per vincolare i legami idrogeno; (6) un regolatore di pressione comune è il barostato di Parrinello-Rahman applicato semi-isotropicamente per i doppi strati; (7) un regolatore di temperatura comune è il termostato Nose-Hoover. Si noti che esistono diversi tipi di barostati e termostati che possono essere utilizzati nella simulazione e dipendono dalla natura dello studio⁶⁹.

L'APL, lo spessore della membrana e il flip-flop dello sterolo sono metriche comuni per determinare se un sistema ha raggiunto l'equilibrio termico, che può variare da 50 ns per i doppi strati puri a 4000 ns per miscele asimmetriche complesse a seconda della metrica scelta. L'analisi delle proprietà meccaniche, strutturali e dinamiche del doppio strato dovrebbe essere calcolata dopo che l'equilibrio è stato raggiunto, cioè una volta che la proprietà di interesse raggiunge un plateau e fluttua rispetto a un valore medio. La porzione equilibrata della traiettoria, nota anche come fase di produzione, dovrebbe essere lunga almeno 100 ns per una corretta analisi statistica e stime dell'incertezza. Le proprietà comuni della membrana che possono essere calcolate dalla simulazione includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, i parametri dell'ordine del deuterio, i profili di densità elettronica, le funzioni di distribuzione radiale, gli angoli di inclinazione delle code o dei gruppi testuali lipidici, il modulo di comprimibilità, i tempi di rilassamento della rotazione lipidica, il modulo di flessione, i profili di pressione laterale, i modelli di raggruppamento lipidico e la dinamica dell'acqua vicino all'interfaccia della membrana^{35,70, 71}; una review di Moradi et al. descrive alcuni di questi in modo più dettagliato⁷⁰. Queste analisi possono essere eseguite con strumenti analitici integrati di GROMACS e VMD o utilizzando script Python, Bash o TCL. Esistono anche molte librerie Python open source come MDAnalysis 72,73, MDTraj 74, Pysimm 75^, Pyemma 76 e PyLipID ⁷⁷ che facilitano l'analisi delle traiettorie di simulazione.

Questo protocollo è focalizzato su un approccio all-atom, che è computazionalmente impegnativo se l'obiettivo di uno studio è quello di caratterizzare le dinamiche di grandi proteine che interagiscono con grandi patch di membrana. Ciononostante, l'aumento della potenza computazionale e l'uso di processori di unità grafiche (GPU) ha favorito le simulazioni di sistemi più grandi. Le simulazioni MD richiedono un campionamento sufficiente delle conformazioni del sistema per calcolare le medie delle proprietà che riproducono accuratamente i valori sperimentali. La modellazione realistica della membrana mira a riprodurre un ambiente meccanico e strutturale accurato per la membrana cellulare di interesse, che ha un impatto diretto sull'interazione di altre biomolecole e facilita il campionamento di eventi rari^78,79,80. Quando si interpretano i dati, si deve fare attenzione a convalidare le osservazioni con tendenze sperimentali o valori effettivi per sistemi simili per verificare che i sistemi modello non siano solo un artefatto della simulazione o costituiscano eventi non fisiologici⁷⁸. In conclusione, le simulazioni MD sono un potente modello per esaminare le interazioni molecolari basate sulla termodinamica statistica. Le simulazioni MD possono essere utilizzate per esaminare gli effetti della diversità lipidica sulle proprietà strutturali e meccaniche della membrana, che a loro volta si traducono in diverse interazioni con le biomolecole durante i processi cellulari. Il protocollo fornisce un approccio adatto ai principianti per progettare, costruire, eseguire e analizzare complessi sistemi di membrane lipidiche. Questi passaggi servono a simulare sistemi di sola membrana, proteine o piccole molecole vicino all'interfaccia di membrana.

Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.

Gli autori ringraziano Jinhui Li e Ricardo X. Ramirez per le loro traiettorie di simulazione e le discussioni durante la stesura di questo manoscritto. O.C. è stato sostenuto dalla University at Buffalo Presidential Fellowship e dal National Institute of Health's Initiative for Maximizing Student Development Training Grant 1T32GM144920-01 assegnato a Margarita L. Dubocovich (PI).