오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

이 논문은^mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

다양한 해상도 스케일에서 다수의 3차원(3D) 유기형 배양(오가노이드)의 특성 분석은 현재 표준 이미징 접근 방식에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 조작으로 최대 300개의 오가노이드/h 이미징 처리량을 지원하는 사용자 친화적인 기기에서 멀티스케일 3D 라이브 이미징을 가능하게 하는 미세 제작된 오가노이드 배양 칩을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 칩은 공기 및 침지 대물렌즈(공기, 물, 오일 및 실리콘) 및 광범위한 일반 현미경(예: 스피닝 디스크, 포인트 스캐너 공초점, 광시야 및 명시야)과 호환됩니다. 또한 단일 대물렌즈, 단일 평면 조명 현미경(SPIM) 기술(soSPIM)과 같은 라이트 시트 양식과 함께 사용할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 미세가공 배양 칩의 제조와 오가노이드의 배양 및 염색을 위한 자세한 단계를 제공합니다. 익숙해지는 데 짧은 시간 만 필요하며 소모품과 장비는 일반 바이오 실험실에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 여기서 3D 이미징 기능은 상용 표준 현미경(예: 3D 재구성을 위한 스피닝 디스크 및 일상적인 모니터링을 위한 광시야 현미경)으로만 시연됩니다.

오가노이드라고 하는 유기형 3D 세포 배양에서 줄기세포는 실제 장기와 강력한 형태학적 및 기능적 유사성을 공유하는 공간 구조로 분화하고 자가 조직화됩니다. 오가노이드는 인체 생물학과 신체 외부의 발달을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다 ^1,2,3. 간, 뇌, 신장, 폐 및 기타 여러 기관을 모방하는 모델이 점점 더 많이 개발되고 있습니다 ^2,4,5. 유기체의 분화는 가용성 성장 인자와 세포 외 기질을 정확한 시간 순서로 첨가함으로써 결정됩니다. 그러나, 기관과 현저한 대조적으로, 유기체의 발달은 상당히 이질적이다.

수많은 생물학적 과제^6,7 외에도 오가노이드 배양은 세포 배양 방법^, 전사체학의 특성화 및 이미징 측면에서 기술적 과제를 제기합니다. 생체내 기관 발달은 세포 배열의 매우 진부한 자기조직을 초래하는 생물학적 환경에서 일어난다. 모든 표현형 변화는 병든 상태를 진단하기위한 대용으로 사용될 수 있습니다. 대조적으로, 오가노이드는 세포 배양 조건과 호환되는 최소한으로 제어되는 미세 환경에서 시험관 내에서 발달하여 각 개별 오가노이드의 발달 경로 및 모양 형성에 큰 변동성을 초래합니다.

최근 연구⁸는 몇 가지 유전자 마커의 평가와 결합된 오가노이드 모양(표현형 설명자)의 정량적 이미징이 표현형 발달 환경의 정의를 허용한다는 것을 보여주었습니다. 틀림없이, 오가노이드에서 게놈 발현의 다양성을 표현형 행동과 연관시키는 능력은 유기체형 배양의 잠재력을 최대한 발휘하기 위한 주요 단계입니다. 따라서 3D ^9,10에서 세포 하, 다세포 및 전체 오가노이드 규모에서 오가노이드 특징을 특성화할 수 있는 전용 고콘텐츠 이미징 접근 방식의 개발이 필요합니다.

당사는 간소화된 오가노이드 배양(분리된 인간 배아 줄기 세포[hESC], 인간 유도 만능 줄기 세포[hIPSC] 또는 일차 세포에서 3D, 다세포, 분화된 오가노이드까지) 및 빠른 비침습적 3D 이미징을 가능하게 하는 다목적 고함량 스크리닝(HCS) 플랫폼을 개발했습니다. JeWells 칩(이하 칩 )이라고 하는 차세대 소형 3D 세포 배양 장치를 통합하고 있으며, 여기에는 단일 대물 라이트 시트 현미경으로 빠른 3D 고해상도 이미징이 가능한 45° 미러 옆에 수천 개의 잘 배열된 마이크로웰이 포함되어^{있습니다11}. 모든 표준 상용 도립 현미경과 호환되는 이 시스템은 300개의 오가노이드를 3D로 이미징할 수 있으며 <1시간 내에 세포하 분해능을 제공합니다.

세포 배양 장치의 미세 가공은 정사각형 베이스와 베이스에 대해 45°의 측벽을 가진 수백 개의 마이크로 피라미드(그림 1A)를 포함하는 기존의 미세 구조화된 몰드에서 시작됩니다. 도 1C는 이러한 구조의 전자 현미경(EM) 이미지를 나타낸다. 금형 자체는 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)로 만들어지며 표준 소프트 리소그래피 절차를 사용하여 해당 기능 (공동)이있는 1 차 금형 (여기에 표시되지 않음)의 복제 주조로 만들 수 있습니다. 기본 금형은 다른 절차로 생산할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 것은 Galland 등에보고 된 바와 같이 실리콘 습식 에칭을 사용하여 만들어졌습니다. ¹¹; 1 차 금형 제작 절차는이 프로토콜에 중요하지 않습니다. 피라미드는 X 및 Y 방향에 대해 동일한 피치를 가진 제곱 배열로 배열됩니다 (이 경우 피치는 350μm입니다).

예시로서, 개념 증명 실험(¹² )은 칩이 웰의 초기 세포 수를 정확하게 정의하면서 장기 배양(개월) 및 분화 프로토콜을 허용한다는 것을 입증하기 위해 출판되었다. 다수의 오가노이드의 개별 개발은 표준 명시야 및 3D 광시트 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 자동 모니터링할 수 있습니다. 또한, 오가노이드를 검색하여 추가 생물학적 조사(예: 전사체 분석)를 수행할 수 있습니다. 이 백서는 세포 배양 커버슬립 제작, 형광 현미경을 위한 파종 및 염색 절차, 오가노이드 검색에 대한 자세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

참고: 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 세포 배양 장치의 미세 가공에 대해 자세히 설명합니다. 피라미드 캐비티가 있는 원래의 1차 금형은 미세 가공 시설을 사용할 수 있는 경우 사내에서 생산하거나 외부 회사에 아웃소싱할 수 있습니다. 이 작업에 사용 된 기본 금형은 사내에서 생산되며 제조 공정 단계는 다른 곳에서 설명합니다^11,13. 금형의 미세 가공을 위한 기본 프로토콜은 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다. 위험: 1-6단계의 작업은 먼지가 없는 환경에서 수행해야 합니다. 가능한 경우 층류 후드 또는 클린 룸이 선호됩니다. 이 모든 단계에서 장갑, 실험실 코트 및 보안경과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.

1. PDMS 금형의 다이싱

1. PDMS 금형의 작은 부분을 최종 장치에 필요한 치수로 절단합니다(예: 1cm x 1cm[그림 1B]). 배열의 XY 방향과 평행하게 자릅니다.
   중요 : PDMS 금형을 1cm x 1cm 깍둑썰기로 절단할 때 절단을 한 단계로 실행하십시오. 단면 면도날을 사용하여 압력을 가하고 PDMS를 한 번에 절단합니다. 이는 금형 표면에 증착되어 복제 단계의 품질에 영향을 미칠 수 있는 PDMS의 작은 입자의 형성을 방지하기 위한 것입니다(단계 3).

2. 평면 PDMS 기판의 제조

1. ~15-20g의 PDMS 베이스 수지와 1.5-2g의 망상제(즉, 10:1의 비율)의 무게를 측정하고 조심스럽게 혼합한 다음 진공 용기에서 ~20분 동안 가스를 제거합니다.
2. 탈기된 PDMS를 직경 15cm의 플라스틱 페트리 접시에 천천히 붓습니다.
3. 페트리 접시를 65°C로 설정된 오븐에 2시간 동안 보관하여 PDMS를 경화합니다. 경화가 완료될 때까지 기다린 후 ~1.5mm 두께의 평평한 PDMS 필름(페트리 접시에 포함)을 사용할 준비가 됩니다(그림 2A).
4. 날카로운 칼날을 사용하여 PDMS에서 2cm x 2cm 조각을 자릅니다(그림 2B-D).
   참고: 이 PDMS 시트의 정확한 두께는 중요하지 않습니다. ~ 1-2mm가 적합한 범위입니다. 절단의 치수는 질감이 있는 금형보다 커야 하지만 훨씬 크지 않아야 하므로 재료가 낭비될 수 있습니다.

3. UV 경화형 접착제로 만든 질감 층의 생산

1. 평평한 PDMS 절단부(2단계에서 준비됨) 위에 PDMS 금형 주사위 1개(1단계에서 준비한 대로)를 뒤집어 놓습니다(그림 3A,B).
   노트: 금형의 피라미드 돌출부가 평평한 PDMS 기판을 향하고 잘린 피라미드의 상단 표면만 접촉하는지 확인하십시오. 광학 현미경으로 올바른 배치를 평가합니다(그림 3C,D).
2. 피펫을 사용하여 몰드의 한쪽면에 소량 (2 방울, 약 0.1-0.2mL)의 UV 경화 접착제를 떨어 뜨립니다 (그림 4A).
   알림: 액체가 금형의 가장자리와 접촉하면 모세관 현상이 액체를 구동하여 금형 자체와 기판으로 사용되는 PDMS의 플랫 컷 사이의 캐비티를 채 웁니다.
   1. 예를 들어, 10x 배율 대물렌즈가 있는 도립 광학 현미경을 사용하여 캐비티 내부의 액체 진행 상황을 추적합니다(그림 4B, C).
3. UV 경화형 접착제를 UV 광선에 노출시켜 경화시킵니다. 사용된 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다(예: 전력 밀도가 35mW/^cm2인 UV-LED 상자, 접착제를 완전히 경화시키기 위해 이 프로토콜에서 50% 전력으로 2분).
4. 한쪽 가장자리에 과도한 양의 접착제를 사용하여 손가락으로 부드럽게 눌러 평평한 PDMS 기판에 경화된 접착제를 고정합니다(그림 5A, B). 한편, 핀셋을 사용하여 누르고 있는 동일한 가장자리 옆에 있는 금형의 한쪽 모서리를 꼬집고 질감이 있는 필름도 들어 올려지지 않도록 하면서 천천히 떼어냅니다.
   알림: 그림 5C는 적절한 금형 제거 절차의 결과를 보여줍니다. 그림 5E-G는 잘못된 절차를 보여줍니다.
5. 면도날을 사용하여 과도한 접착제와 과도한 PDMS 기판을 트리밍하여 경화되고 질감이 있는 접착제 층을 PDMS에 평평하게 남겨두고 한쪽 가장자리에만 과도한 PDMS를 남겨 둡니다(그림 5D).

4. 커버슬립 기판 준비

알림: 최종 장치의 기판으로 직경 1.5mm의 표준 둥근 25H 커버슬립이 사용됩니다. 사용하기 전에 표면에서 먼지 및/또는 유기 잔류물을 제거하기 위해 청소해야 합니다.

1. 커버슬립 청소
   1. 초음파가 가해지는 동안 커버슬립을 비눗물에 5분 동안 담그십시오(40kHz, 110W 음파 출력).
   2. 커버슬립을 깨끗한 탈이온수(DI)로 먼저 담그고 마지막으로 수도꼭지에서 흐르는 DI 물로 세척합니다. N₂ 가스 블로우 건으로 커버 슬립을 말리십시오.
   3. 커버 슬립을 아세톤 욕조에 5 분 동안 담그십시오. 즉시 2-프로판올(IPA) 수조로 5분 더 이동합니다.
   4. 스퀴즈 병을 사용하여 깨끗한 IPA로 커버슬립을 헹굽니다. N₂ 가스 블로우 건으로 커버 슬립을 말리십시오.
      알림: 이 절차를 사용하여 청소한 커버슬립은 필요할 때까지 밀폐된 용기에 보관할 수 있습니다. 표면에 습기가 쌓이지 않도록 건조한 캐비닛에 보관하십시오.
2. 사용할 준비가 되면 짧은 O 2 플라즈마 공정으로 깨끗한 커버슬립을 처리하여 친수성을 개선합니다: O₂ 20 sccm, 3 mbar 압력, RF 발전기에서 60 W 및 60 s 지속 시간.
3. 플라즈마 활성화 직후, 표준 스핀 코터의 진공 척에 커버슬립을 놓고 커버슬립 중앙에 접착제 한 방울을 부어 UV 경화형 접착제의 얇은 층을 스핀 코팅합니다(그림 6). 스핀 코팅 공정을 실행합니다: 500rpm에서 5초 동안 살포, 3,000rpm에서 45초 동안 코팅(가속 및 감속을 100rpm/s로 설정).
   1. 스핀 코팅을 사용할 수 없는 경우 다음 대체 방법을 사용하여 커버슬립에 UV 접착제 박막을 생성합니다.
      1. 깨끗한 커버슬립에 피펫을 사용하여 ~0.1mL의 UV 경화 접착제를 떨어뜨립니다(그림 7A).
      2. 두 번째 커버슬립을 가져다가 첫 번째 커버슬립 위에 올려 액체 접착제가 두 커버슬립 사이에 고르게 퍼지도록 합니다(그림 7B-D).
      3. 퍼짐 접착제가 커버슬립의 가장자리에 도달하면 하나를 다른 위로 밀어 부드럽게 분리합니다. 분리되면 두 커버슬립은 얇은 액체 접착제 층으로 완전히 코팅됩니다(그림 7E).
         알림: 부드럽고 지속적인 움직임으로 분리가 수행되지 않는 경우에만 코팅이 균일하고 매끄럽지 않을 수 있습니다.
4. UV 경화형 접착제의 사전 경화
   1. 스핀 코팅 후 UV에 노출하여 접착제를 사전 경화합니다. 사용 된 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정하십시오 (여기서 전력 밀도가 35mW / cm² 인 UV-LED 박스를 1 % 전력에서 50 분 동안 사용).
      중요 : 여기에 사용 된 접착제는 광학 접착제입니다. 경화를위한 에너지 선량과 관련된 핵심 사항에 대한 토론을 참조하십시오.

5. 질감 필름을 최종 기판으로 이송

1. 질감이 있는 필름(3단계에서 준비) 중 하나를 가져와 접착 코팅된 커버슬립(4단계에서 준비)과 접촉시킵니다. 커버슬립의 부분적으로 경화된 접착제와 질감이 있는 필름 사이의 접촉이 가능한 한 균일한지 확인하십시오(그림 8A-C).
   중요 : 이 단계에서 커버 슬립의 접착제는 리플 로우를 방지 할 수있을만큼 충분히 견고해야하며, 이는 접촉했을 때 질감이있는 필름의 피라미드 구멍을 채울 수있을뿐만 아니라 질감이있는 필름을 부드럽게 눌러 접촉을 최적화 할 수있을만큼 충분히 플라스틱 및 접착제이어야합니다.
2. 커버슬립에 코팅된 접착제층이 완전히 경화될 때까지 커버슬립을 자외선에 노출시킵니다. 이렇게 하면 커버슬립의 질감 필름이 밀봉되고 피라미드 캐비티 사이에 누출 방지 격리가 제공됩니다.
3. 마지막으로 PDMS 플랫 기판을 벗겨냅니다(그림 8D-F). 핀셋을 사용하여 트리밍 후 여분의 재료가 남은 가장자리의 한쪽 모서리에 PDMS를 집습니다(3.5단계). 이러한 방식으로 질감이 있는 필름 층은 세포 파종을 위해 상단에 열린 접근이 있는 커버슬립에 접착제로 남게 됩니다. 중요 : 평평한 PDMS를 벗길 때 질감이있는 필름이 커버 슬립에 잘 부착되어 있어야합니다. 텍스처 필름이 아무런 노력 없이 UV에 최종 노출된 후 커버슬립에서 벗겨질 수 있는 경우 접착 실패를 쉽게 확인할 수 있습니다.

6. 세포 배양을 위한 세포 배양 커버슬립의 장기 패시베이션

참고: 패시베이션은 세포막에서 인지질의 극성 그룹과 유사한 구조를 갖는 생체모방 공중합체의 컨포멀 및 연속 코팅을 생성함으로써 달성됩니다. 이 컨포멀 코팅은 세포 배양 장치에 대한 세포 부착을 방지합니다.

1. 순수한 에탄올에 용해된 생체모방 공중합체의 0.5%(w/v)로 용액을 준비한다. 나중에 사용할 수 있도록 용액을 4 ° C에 보관하십시오.
2. 세포 배양 커버슬립을 35mm 페트리 접시에 넣고 생체모방 공중합체 용액으로 완전히 덮습니다.
3. 5분 후, 생체모방 공중합체 용액으로 용기로부터 세포 배양 커버슬립을 제거하고, 이를 생물안전 후드(>1시간)에서 최종 접시 내부의 실온에서 건조되도록 방치한다.
   참고: 코팅 용액 내의 생체모방 공중합체의 농도를 증가시킴으로써 더 두꺼운 코팅을 생성할 수 있고; 더 두꺼운 코팅의 결과는 명시야 현미경에서 볼 수 있습니다(그림 9A).

7. 세포 파종

1. 탈기 및 살균
   1. 세포 파종 직전에 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 세포 배양 접시(일반적으로 35mm 페트리 접시의 경우 1mL)에 분주합니다. ~10분 동안 초음파 장치를 사용하여 멸균된 PBS로 접시를 탈기한 다음 여러 차례의 피펫팅을 수행하여 모든 거품을 제거합니다.
      중요 : 공기가 피라미드 구멍 내부에 갇히면 세포가 피라미드 구멍으로 들어가는 것을 방지합니다. 세포 파종 전에 피라미드에 공기가 갇히지 않도록 하려면 이러한 공동에 공기가 없는지 육안으로 확인하는 것이 좋습니다(벤치탑 명시야 현미경에서 10배 또는 20배 배율).
   2. PBS를 멸균 배양 배지로 교체하고 세포 배양 후드 아래에서 30분 동안 UV 광으로 플레이트를 멸균합니다.
      알림: 이 단계부터 접시는 멸균된 것으로 간주하고 멸균 기술을 사용하여 조작해야 합니다. 세포 배양 장치에서 갇힌 공기를 제거하는 또 다른 방법은 진공 펌프가 있는 진공 용기를 사용하는 것입니다.
2. 세포 현탁액 준비
   참고: 세포는 단일 또는 작은 세포 응집체로 시딩하고 상단 조리개를 통해 샘플 웰로 들어갈 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 삽입된 세포는 샘플 웰 내부에서 응집되어 조리개 크기보다 큰 크기의 스페로이드로 성장합니다. 검증된 세포주 모델로 권장 배양액(ATCC 지침)에서 유지되는 HCT116(CCL-247 ATCC) 또는 MCF7(HTB-22 ATCC) 암세포를 사용합니다.
   1. 세포 현탁액을 준비한다 (예를 들어, ATCC 가이드라인에 따른 트립신화 공정을 사용하여). 관심 세포에 대한 트립신화/세포 현탁액 준비 권장 사항을 따르십시오.
   2. 권장 배양 배지에서 세포 농도를 0.5 × 10⁶ cells/mL로 계산하고 조정합니다.
3. 세포 분주
   1. 35mm 세포 배양 접시에서 PBS 완충액을 제거한 다음 조정된 세포 현탁액 1mL를 분주합니다. 적절한 세포 밀도 및 균질성을 갖는 세포 파종 절차의 광학 현미경 이미지는 도 11A 를 참조한다.
   2. 세포 배양 접시를 세포 배양기(37°C, 5%_CO2 및 100% 습도)에 10분 동안 다시 놓습니다. 약 80-100 개의 세포가 각 피라미드 구멍으로 들어갑니다.
      참고: 세포 농도 또는 세포 현탁액 제거 전에 소요된 시간을 증가시켜 세포 배양 접시당 세포 수를 늘릴 수 있습니다. 일반적으로 스페로이드 형성은 세포 파종 후 몇 시간(세포 유형에 따라 다름)이 걸리며 명시야 현미경(4x - 40x 대물렌즈; 그림 11). 여기에서 배양 배지, 세포외 매트릭스 및 분화 성장 인자를 변경하거나 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있는 일반적인 분화 프로토콜에 따라 스페로이드를 포함하는 세포 배양 접시에 추가할 수 있습니다.
   3. 10분 배양 후 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 회수하고 세포 현탁액을 부드럽게 흡인하여 포획되지 않은 세포를 제거합니다. 35mm 접시에 배양 배지 1mL를 넣고 세포 배양기에 다시 넣습니다.
      중요 : 이 단계에서는 스페로이드가 아직 형성되지 않았기 때문에 세포 손실을 초래할 강한 흡인이나 분배를 피하는 것이 매우 중요합니다. 이 단계에서는 벤치탑 명시야 현미경을 사용한 시각적 제어를 적극 권장합니다.

8. 면역 염색 및 이미징

1. 고정 및 염색
   참고: 고정 및 면역 염색의 다른 고전적인 절차는 세포 배양 접시와 완전히 호환됩니다. 한 가지 일반적인 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.
   1. 세포 배양 접시에 오가노이드/스페로이드를 실온에서 4% 파라포름알데히드에 20분 동안 고정합니다.
   2. 오비탈 쉐이커 상의 4°C에서 멸균 PBS 중 1% 계면활성제 용액에서 24시간 동안 오가노이드를 투과화하고, 오비탈 쉐이커 상에서 4°C의 블로킹 완충액(2% 소 혈청 알부민[BSA] 및 멸균 PBS 중 1% 계면활성제)에서 24시간 동안 배양한다.
   3. 항체 희석 완충액(멸균 PBS에서 2% BSA 및 0.2% 계면활성제)에서 1/50에서 1/200 사이(또는 제조업체의 권장 사항에 따라)로 관심 있는 1차 항체와 함께 샘플을 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션합니다.
   4. 오비탈 셰이커(멸균 PBS 중 3% NaCl 및 0.2% 계면활성제)에서 세척 완충액으로 샘플을 3배 헹구고 항체 희석 완충액(1/100에서 1/300 사이의 희석 또는 제조업체의 권장 사항에 따라), 0.5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 0.2μg/mL Alexa Fluor 647 또는 488 팔로이딘에서 4°C에서 오비탈 셰이커에서 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 5 단계 헹굼. 임의로, 37°C로 예열된 수용성 투명화제를 사용하여 샘플을 장착한다.
2. 이미징
   참고: 이 단계에서 마이크로웰 플레이트의 오가노이드는 이미징을 위해 고정 및 염색된 샘플을 포함하는 일반 배양 접시로 간주될 수 있습니다: 모든 표준 이미징 절차는 적응이나 수정 없이 사용할 수 있습니다. 그림 12 는 40x 공기 대물렌즈(개구 0.75)를 가진 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 얻은 이미지 및 3D 재구성의 대표적인 결과를 보여줍니다.
   1. 다음 설정으로 자동 이미지 획득 프로세스에 컨스트럭터 소프트웨어를 사용하십시오: 노출 시간 = 50ms, Z 전동 스테이지를 사용하여 z 스택(1μm Z 스텝, 총 높이 70μm).
   2. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 수행합니다.

9. 유기체의 방출 및 수집

참고: 세포 배양 접시의 질감이 있는 접착층은 커버슬립에서 분리되어 피라미드 캐비티 내부에 포함된 살아있는 스페로이드/오가노이드(고정 전)를 방출하여 RNA 시퀀싱, -omic 접근, 시험관 내 실험 및 생체 이식 과 같은 다른 절차로 세포를 분석할 수 있습니다.

1. 샘플을 페트리 접시와 생물 안전 후드에 넣은 상태에서 메스와 같은 칼날을 사용하여 질감이있는 접착제 층의 모서리를 자릅니다.
2. 핀셋을 사용하여 질감이 있는 접착제 층을 절단 가장자리에 집고 유리 커버슬립에서 부드럽게 떼어내되 매체에 담그십시오(일부 오가노이드는 접착층에 남아 있을 수 있음, 그림 13).
3. 배양 배지로 3x 헹구고 피펫팅으로 오가노이드를 수집합니다.

도 8F는 성공적인 제조 후의 세포 배양 커버슬립의 전형적인 양상을 나타낸다. UV 경화형 접착제 층은 평평하게 보이고 커버 슬립에 잘 부착됩니다. 커버슬립의 층이 과경화되거나 평평한 PDMS 기판의 제거가 잘못 수행된 경우 커버슬립의 접착층 전사가 실패할 수 있습니다(그림 8G,H 참조). 두 경우 모두 질감이 있는 필름이 커버슬립으로 전달되지 않기 때문에 실패가 분명합니다.

마이크로웰이 작동하려면 생성된 질감 필름(프로토콜 단계 3에 설명된 대로)이 피라미드의 상단과 하단을 모두 열어 7단계에서 파종하는 동안 세포가 공동으로 들어가 오가노이드가 형성되기 시작하면 포함된 상태로 유지될 수 있도록 해야 합니다. 도 9는 코팅 용액 중의 생체모방 공중합체의 농도 증가에 의한 코팅의 두께 증가를 나타낸다. 도 10은 피라미드 공동에 공기가 포획되지 않도록 하기 위해 세포 배양 접시를 탈기한 결과를 나타낸다. 그림 10A, B는 완전한 탈기를 보여주고 그림 10C, D는 피라미드 캐비티의 기포를 보여줍니다.

그림 11에서, 세포는 피라미드 내부에 포획되고, 상응하는 유기체는 배양 2 일 및 15 일 후에 형성된다. 마이크로 웰의 상단 개구부가 대신 닫히면 (잘못된 3 단계의 결과로) 세포 파종 후 샘플을 헹군 후 세포가 남지 않습니다. 그림 12는 40x 공기 대물렌즈(개구 0.75)가 있는 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 얻은 오가노이드 및 3D 재구성의 대표 이미지를 보여줍니다. 방출 및 수집 후, 오가노이드는 작은 바이알에 보관되고 추가 분석(예: RNA 시퀀싱)에 사용될 수 있습니다. 도 13B는 기재된 바와 같이 수집된 오가노이드의 샘플의 예를 도시한다.

그림 1: 폴리(디메틸실록산) 몰드. (A) 4" 텍스처 웨이퍼의 캐스트 복제본으로 얻은 시작 PDMS 몰드(보충 파일 1 참조). (B) 출발 PDMS 금형의 1cm x 1cm 폭 절단. (C) 금형의 표면을 채우는 정사각형 배열로 배열 된 사다리꼴 기둥의 주사 전자 현미경 이미지. 스케일 바 = 1cm(A), 100μm 및 200μm(각각 C 상단 및 하단). 약어 : PDMS = 폴리 (디 메티 실록산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 평평한 PDMS 기판. (A) ~ 1mm 두께의 PDMS 층이 표준 15cm 너비의 페트리 접시에 준비됩니다. (B) PDMS의 신선한 절단에서 벗겨냅니다. (C) 페트리 접시에 남아있는 PDMS는 추가 사용을 위해 더 많은 조각으로자를 수 있습니다. (D) 평면 PDMS 절단과 PDMS 금형을 나란히 배치합니다. 평평한 PDMS는 금형보다 큽니다. 약어 : PDMS = 폴리 (디 메티 실록산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 기판에 금형 배치 . (A) 피라미드가 아래를 향하도록 금형을 평평한 기판 위에 놓습니다. (B) 금형과 PDMS 기판 사이의 접촉 불량 (상단)과 양호한 접촉 (하단)의 다른 외관. (C) 접촉이 불량한 영역의 광학 현미경 이미지; 빨간색 원은 기판과 접촉하지 않는 기둥을 강조 표시하여 동일한 이미지에서 접촉하는 기둥보다 밝은 색상으로 나타납니다. (D) 모든 기둥이 잘 접촉하는 영역의 광학 이미지. 스케일 바 = 200 μm (C, D). 약어 : PDMS = 폴리 (디 메티 실록산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: UV 경화 접착제의 모세관 충전 . (A)이 일련의 이미지는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 한쪽 가장자리에 소량의 접착제를 붓고 금형과 기판 사이의 공동에서 액체 접착제의 진행을 보여줍니다. 노란색 화살표는 액체 흐름 방향을 가리킵니다. (b) 액체 전면이 움직이는 광학 이미지(40x 배율)의 시퀀스; 접촉이 잘되면 액체의 전면이 누출없이 피라미드 가장자리 주위로 움직입니다. 노란색 화살표는 흐름 방향을 가리키고 빨간색 화살표는 접촉 가장자리 주위를 이동하는 액체 전면의 앞쪽 가장자리를 가리킵니다. (c) 접촉이 불량할 때 이동하는 액체 전면의 광학 이미지(40x)의 시퀀스; 빨간색 화살표는 금형과 기판 사이에 침투하는 액체의 앞쪽 가장자리를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 접착제 경화 후 금형 제거. (A-C) 금형 벗겨 내기 절차 : 핀셋으로 왼쪽 가장자리의 과도한 접착제를 부드럽게 누르면서 금형을 같은 가장자리 근처에서 꼬집고 천천히 구부려 벗겨냅니다. (D) 올바른 절차의 결과; 초과분은 세 모서리에서 잘리고 PDMS의 작은 초과는 네 번째면 (노란색 화살표)에 남습니다. (예) 금형 제거를위한 잘못된 절차의 예 : 금형이 반대쪽 가장자리에서 핀셋으로 끼워져 금형과 함께 접착 필름의 평평한 기판에서 벗겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 유리 커버슬립의 코팅. (A, B) 좋은 코팅 절차의 예 : 유리 커버 슬립을 스핀 코터의 진공 척에 놓고 중앙에 충분한 접착제를 분배하여 커버 슬립을 균일하게 코팅합니다. (씨,디) 잘못된 코팅 절차의 예: 접착제가 충분하지 않아 커버슬립이 균일하지 않게 코팅됩니다. (E) 왼쪽에서 오른쪽으로, 양호한 코팅, 허용 가능한 코팅 및 불량 코팅의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 대체 코팅 공정 . (A) 작은 액체 접착제 방울이 커버 슬립 중앙에 놓입니다. (B) 두 번째 커버슬립을 첫 번째 커버슬립 위에 부드럽게 놓습니다. (씨,디) 액체는 두 개의 커버 슬립 사이에 퍼지고 고르게 분포됩니다. (E) 커버슬립의 올바른 분리(왼쪽) 또는 잘못된 분리(오른쪽) 후의 결과의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 커버슬립으로 옮깁니다. (A) 경화 및 트리밍된 접착 필름(그림 5D)을 부분적으로 경화된 접착제와 함께 커버슬립에 놓습니다. (B) 질감 필름과 커버 슬립 사이의 양호한 접촉의 예. 삽입물은 사다리꼴 구멍 사이의 영역 (어두운 균일 한 색상)의 균일 한 접촉을 보여주는 광학 이미지입니다. (C) 질감 필름과 커버 슬립 사이의 접촉 불량의 예. 밝은 영역은 접촉하지 않고 빨간색 화살표는 해당 영역을 가리 킵니다. 삽입물은 양호한 접촉(왼쪽에 2개)과 불량한 접촉(오른쪽에 2개)의 다른 모양을 보여주는 광학 이미지입니다. 스케일 바 (노란색, B, C) = 200 μm. (D, E) PDMS 플랫 기판을 제거하기위한 올바른 절차 : 핀셋을 사용하여 PDMS를 초과하여 가장자리에서 PDMS를 꼬집고 구부려 부드럽게 벗겨냅니다. (F) UV 접착제 질감 필름을 사용한 결과가 커버 슬립으로 성공적으로 옮겨졌습니다. (G,H) 잘못된 박리 절차의 예: 핀셋은 과도한 재료가 잘린 가장자리 중 하나에 평평한 PDMS를 꼬집는 데 사용됩니다. 따라서, 필름은 평면 PDMS와 함께 제거된다. 약어 : PDMS = 폴리 (디 메티 실록산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 생체모방 공중합체로 코팅. (A) 순수 에탄올 중 0.5 % (왼쪽) 또는 (B) 1 % (오른쪽) (w / v) 용액을 사용하여 생체 모방 공중 합체로 코팅 된 세포 배양 장치. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 세포 배양 장치의 탈기. (A) 완전 탈기 전의 세포 배양 장치. (b) 완전 탈기 후 세포 배양 장치; (C, D) 피라미드에 기포가 갇히는 부분 탈기 만 갖는 세포 배양 장치. 스케일 바 = 200 μm (A-D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 세포 파종 및 오가노이드 성장의 대표적인 명시야 이미지 . (A) 세포가 상단에 떠 있는 것이 보입니다. (b) 세포 현탁액을 헹군 후 피라미드 공동에 갇힌 세포. 표시된 대로 트랩된 셀만 유지됩니다. (C) 세포는 응집되어 각 공동에서 스페로이드를 형성합니다(세포 파종 후 2일째). (D) 피라미드 공동에서 성장한 오가노이드의 세포 파종 후 15일째의 이미지. 스케일 바 = 200 μm (AB), 120 μm (C) 및 150 μm (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: 오가노이드의 3D 이미징. (A) 신경 외배엽 분화 (세포 파종 후 7 일째) 오가노이드의 회전 디스크 공초점 (렌즈 40x, 공기, 개구 : 0.75)을 사용하여 획득 한 세 가지 다른 Z 계획. 주황색의 팔로이딘(Alexa Fluor 647) 및 파란색의 N-cadherin 면역염색(Alexa Fluor 561)을 사용한 액틴 염색. (B) 해당 오가노이드의 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 3D 재구성(80Z 평면, 총 높이 100μm). 흰색 화살표: 액틴 발현 수준이 높은 줄무늬 주변의 세포 클러스터. 파란색 화살표: N-카드헤린 단백질 발현에 양성인 세포 클러스터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 13: 오가노이드의 방출. (a) 텍스쳐된 접착제층을 핀셋으로 제거하는 단계; (b) 제거 후 수득된 오가노이드 현탁액의 명시야 이미지. 스케일 바 = 200 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : 피라미드 형 미세 공동이있는 Si 금형의 미세 가공을위한 단계별 프로토콜이 제시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

고밀도 오가노이드 배양 및 분화를 허용하는 마이크로웰 배양 접시의 제조 절차가 이 백서에 설명되어 있습니다. 미세 공동의 형상과 배열로 인해 수천 개의 스페로이드를 재료 손실 없이 장기간(몇 주 이상) 동안 단일 플레이트에서 배양하고 염색할 수 있습니다. 비교를 위해 세포 배양 플레이트의 4mm x 2mm 영역에는 면적이 12cm x 8cm인 단일 384웰 플레이트만큼 많은 스페로이드가 포함될 수 있습니다.

미세공동의 규칙적인 분포와 기질로 사용되는 평평한 표준 커버슬립을 통해 배양 용기와 이미징 지지체 사이에서 복잡하고 시간이 많이 소요되는 샘플 조작 없이 수천 개의 살아있는 유기체 또는 고정된 오가노이드를 3D로 모니터링할 수 있습니다. 베이스보다 상단이 작은 피라미드 모양으로 인해 배지 교환 중 피펫팅 단계, 세포외 매트릭스 분주 또는 염색 절차로 인한 오가노이드 손실이 없습니다. 이러한 모든 단계는 기존의 오가노이드 생성 기술(예: 매달린 액적, 낮은 부착 플레이트, Aggrewell)과 달리 추가 예방 조치 없이 2D 세포 단층의 경우와 같이 직접 수행할 수 있습니다.

또한 이러한 기존 기술과 비교하여 마이크로 웰은 모든 유형의 액침 렌즈 (공기, 물, 오일 및 실리콘)와 호환되는 고해상도 3D 이미징을 위해 설계되었습니다. 평평한 유리 커버슬립에 닫힌 오가노이드를 장기간 유지 관리하면 세포 배양 커버슬립이 고해상도 광학 현미경과 호환되며, 이는 복잡한 취급과 까다로운 오가노이드 전달 없이는 기존 방법으로는 불가능합니다. 또한, 최적화된 패시베이션 절차는 장기 배양을 위한 세포/오가노이드의 부착을 방지하여 3D 배양의 분화를 제어합니다. 마지막으로, 질감이 있는 접착층은 제거 가능하기 때문에 살아있는 오가노이드를 검색하여 -오믹스 분석 또는 생체 내 이식과 같은 다른 유형의 실험을 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜에 사용되는 미세 공동의 피라미드 모양과 배열 배열은 실리콘 습식 에칭을 통해 표면에 거울과 같은 마감 처리와 단일 대물 라이트 시트 현미경 (soSPIM¹¹)을 허용하는 45 ° 경사를 제공하기 위해 제작 된 기본 금형에서 파생됩니다. 이러한 요구 사항에 대한 논의와 이러한 금형을 생산하는 방법에 대한 전체 설명은^다른 곳에서 찾을 수 있지만 간단한 프로토콜은 보충 파일 1에도 제공됩니다. 이 프로토콜의 칩 제조와 완벽하게 호환되는 기본 금형을 생산하는 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 유리의 레이저 에칭 및 고해상도 3D 프린팅은 오가노이드의 봉쇄에 적합한 공동을 가진 1차 금형을 생산하는 데 사용할 수 있지만 soSPIM 이미징에는 적합하지 않습니다.

여기에 공개된 제조 프로토콜은 전용 고급 미세 가공 도구가 필요하지 않기 때문에 모든 표준 생물학 실험실에서 사용하도록 조정할 수 있습니다. 마이크로 웰 제조의 몇 가지 중요한 단계는 질감이있는 접착 필름의 모세관 충전을 통한 생산 및 유리 기판으로의 전달입니다. 그러나 우리의 경험상 단기간에 높은 재현성으로 마스터 할 수 있습니다. 피라미드 사이의 거리는 유기체의 성장을 위한 공동의 밀도를 증가시키기 위해 가능한 한 작아야 하지만, 또한 공동이 누출이나 밀봉 부족 없이 기판에 밀봉될 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 우리는 50μm의 거리가 이 경우에 좋은 절충안이라는 것을 발견했습니다.

세포 파종 중에 중요한 측면은 세포 진입을 보장하기 위해 캐비티 내부에 갇힌 기포를 제거하는 것입니다. 여기서는 고전적인 실험실 장비 (예 : 초음파 균질화 기 또는 진공 용기) 만 사용하는 검증 된 솔루션을 설명합니다. 세포 배양 접시당 세포 수의 균질화를 더 잘 허용하려면 덮개 슬립 바로 위가 아닌 접시 측면에서 세포 현탁액을 분배하는 것이 좋습니다. 부드러운 수동 교반은 또한 세포 용액을 균질화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

세포 파종 후, 유기체가 있는 세포 배양 접시는 다른 고전 배양 지지체와 마찬가지로 취급될 수 있습니다. 특별한 조작이나 중요한 단계가 필요하지 않습니다. 마이크로웰 장치와 함께 사용된 모든 프로토콜은 U-바닥 플레이트와 같은 부착이 적은 접시에 사용되는 프로토콜과 실질적으로 동일합니다. 따라서 이러한 마이크로웰에서의 오가노이드 배양은 다른 표준물질과 비교하여 배양 조건의 변화를 필요로 하지 않습니다.

또 다른 중요한 요소는 여기에 사용 된 접착제가 광학 접착제라는 것입니다. 제안된 최상의 사용법(공급업체의 애플리케이션 노트 참조)에서는 접착할 두 개의 광학 요소가 정렬되고 UV 경화 접착제가 인터페이스에 적용됩니다. 완전 중합을 유발하기에 불충분 한 에너지의 UV에 대한 첫 번째 노출은 접착 특성을 유지하면서 접착제를 응고시키는 데 사용됩니다. 광학 구성 요소를 이동하여 최적의 정렬을 달성 한 다음 접착제를 UV에 두 번째 노출하여 최종 상태로 완전히 경화시켜 영구적 인 접착력을 제공합니다. 제 1 및 제 2 노출 에너지 투여량(즉, 공지되고 일정한 에너지 밀도의 소스가 사용되는 경우 노출 시간)은 사용된 UV 소스의 에너지 밀도, 접착제 층의 두께, 광학 요소를 통한 UV의 투과, 및 접착될 표면의 표면 텍스처링(또는 그것의 부족)에 따라 최적화되어야 한다.

텍스처 필름과 접착제 코팅된 커버슬립 사이의 접착력은 누출 방지 밀봉을 제공할 수 있을 만큼 충분히 강해야 하지만, 유전형 프로파일링과 같은 추가 분석이 필요한 경우 이미징 후 오가노이드를 회수하기 위해 텍스처 필름을 제거할 수도 있어야 합니다. 누출 방지 밀봉과 질감 필름을 벗겨내는 기능 사이의 올바른 절충안은 여기에 설명된 프로토콜을 통해 달성되었지만 UV 노출 시스템 및 사용된 필름 두께에 따라 달라지기 때문에 커버슬립의 접착제 박막에 대한 사전 경화 및 최종 경화 시간의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

현재 마이크로웰 버전의 한 가지 제한 사항은 파종 절차에 있습니다. 셀은 피라미드 근처로 들어갈 수 있도록 ECM 구성 요소 앞에 시드되어야 합니다. 첫 번째 단계로 마이크로웰을 세포외 기질 성분으로 코팅하기 위한 개선이 진행 중입니다. 우리는 아직 충치 내의 고정 된 유기체에 대해 전자 현미경 (EM)을 수행하지 않았습니다. EM을 사용한 마이크로웰에서 오가노이드의 이미징이 실행 가능한 옵션이 되기 전에 이러한 제조 및 세포 배양 프로토콜에 대한 일부 수정이 필요합니다.

이 방법의 자연스러운 미래 확장은 단일 워크플로우(멀티웰 플레이트)에서 다중 조건 테스트를 수행할 수 있도록 고함량 스크리닝 용량을 제공하는 것입니다. 이 세포 배양 장치는 기존 오가노이드 기술에 대한 고유한 대안을 제공하여 탁월한 배양 및 이미징 처리량을 제공하고 생물의학 응용 및 약물 발견을 위한 오가노이드 연구 분야에서 새로운 관점을 열어줍니다.

국제 특허 출원이 공개 번호 WO 2021/167535 A1로 공개되었다.

이 연구는 싱가포르 총리실의 국립 연구 재단이 지원하는 CALIPSO 프로젝트의 지원을 받아 연구 우수성 및 기술 기업을 위한 캠퍼스(CREATE) 프로그램에 따라 지원됩니다. V.V.는 NRF 조사자 NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI 시드 펀딩 및 ANR ADGastrulo의 지원을 인정합니다. AB와 G.G.는 MBI 핵심 자금의 지원을 인정합니다. A.B.는 BC43 현미경의 대여에 대해 Andor Technologies를 인정합니다.