Method Article
מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.
אפיון מספר רב של תרביות אורגנוטיפיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בסקאלות רזולוציה שונות מוגבל כיום על ידי גישות הדמיה סטנדרטיות. פרוטוקול זה מתאר דרך להכין שבבי תרבית אורגנואידים מיקרו-מפוברקים, המאפשרים הדמיה חיה תלת-ממדית בקנה מידה רב-ממדי במכשיר ידידותי למשתמש הדורש מניפולציות מינימליות ומסוגל לתפוקת הדמיה של עד 300 אורגנואידים/שעה. שבבי תרבית אלה תואמים הן למטרות אוויר והן למטרות טבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון) ולמגוון רחב של מיקרוסקופים נפוצים (למשל, דיסק מסתובב, סורק נקודתי קונפוקלי, שדה רחב ושדה בהיר). יתר על כן, ניתן להשתמש בהם עם שיטות גיליון אור כגון טכנולוגיית מיקרוסקופ הארה חד-אובייקטיבי וחד-מישורי (SPIM) (soSPIM).
הפרוטוקול המתואר כאן נותן צעדים מפורטים להכנת שבבי התרבית המיקרו-מפוברקים ולתרבית והצביעה של אורגנואידים. רק פרק זמן קצר נדרש כדי להכיר, וניתן למצוא בקלות חומרים מתכלים וציוד במעבדות ביולוגיות רגילות. כאן, יכולות ההדמיה התלת-ממדית יודגמו רק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים מסחריים (למשל, דיסק מסתובב לשחזור תלת-ממדי ומיקרוסקופ שדה רחב לניטור שגרתי).
בתרביות תאים תלת-ממדיות אורגנוטיפיות, המכונות להלן אורגנואידים, תאי גזע מתמיינים ומתארגנים בעצמם למבנים מרחביים החולקים דמיון מורפולוגי ותפקודי חזק עם איברים אמיתיים. אורגנואידים מציעים מודלים יקרי ערך לחקר הביולוגיה האנושית והתפתחות מחוץ לגוף 1,2,3. מספר גדל והולך של מודלים מפותחים המחקים את הכבד, המוח, הכליות, הריאות ואיברים רבים אחרים 2,4,5. התמיינות באורגנואידים מכוונת על ידי תוספת של גורמי גדילה מסיסים ומטריצת חוץ תאיים ברצף זמן מדויק. עם זאת, בניגוד בולט לאיברים, התפתחות אורגנואידים היא הטרוגנית למדי.
מעבר לאתגרים ביולוגיים רבים6,7, תרביות אורגנואידים מציבות אתגרים טכנולוגיים גם מבחינת שיטות תרביות תאים, אפיון שעתוק והדמיה. התפתחות איברים In vivo מתרחשת בסביבה ביולוגית הגורמת לארגון עצמי סטריאוטיפי ביותר של סידורי תאים. כל שינוי פנוטיפי יכול לשמש כפרוקסי לאבחון מצב חולה. לעומת זאת, אורגנואידים מתפתחים במבחנה במיקרו-סביבות מבוקרות מינימליות התואמות לתנאי תרבית תאים, וכתוצאה מכך נוצרת שונות גדולה בנתיב ההתפתחות ובהיווצרות הצורה עבור כל אורגנואיד בודד.
מחקר8 שנערך לאחרונה הראה כי הדמיה כמותית של צורת אורגנואידים (מתארי פנוטיפ) בשילוב עם הערכה של כמה סמנים גנטיים מאפשרים הגדרה של נופי התפתחות פנוטיפיים. ניתן לטעון כי היכולת לקשר בין מגוון הביטוי הגנומי באורגנואידים לבין התנהגותם הפנוטיפית היא צעד חשוב לקראת שחרור מלוא הפוטנציאל של תרבויות אורגנוטיפיות. לפיכך, היא מבקשת לפתח גישות הדמיה ייעודיות בעלות תוכן גבוה המאפשרות אפיון תכונות אורגנואידים בקנה מידה תת-תאי, רב-תאי ואורגנואיד שלם בתלת-ממד 9,10.
פיתחנו פלטפורמה רב-תכליתית לסינון תוכן גבוה (HCS) המאפשרת תרבית אורגנואידים יעילה (החל מתאי גזע עובריים אנושיים מבודדים [hESCs], תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם [hIPSCs], או תאים ראשוניים ועד אורגנואידים תלת-ממדיים, רב-תאיים ומובחנים) והדמיה תלת-ממדית מהירה ולא פולשנית. הוא משלב מכשיר תרבית תאים תלת-ממדי ממוזער מהדור הבא, הנקרא שבב JeWells ( השבב להלן), המכיל אלפי מיקרו-בארות ערוכות היטב ומשני צדיהן מראות 45° המאפשרות הדמיה מהירה, תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור11 חד-אובייקטיבי. מערכת זו, התואמת לכל מיקרוסקופ הפוך מסחרי סטנדרטי, מאפשרת הדמיה של 300 אורגנואידים בתלת-ממד ברזולוציה תת-תאית תוך <1 שעות.
המיקרו-ייצור של התקן תרבית התאים מתחיל מתבנית מיקרו-מובנית קיימת, שמכילה מאות מיקרו-פירמידות (איור 1A) עם בסיס מרובע ודפנות צדדיות ב-45° ביחס לבסיס. איור 1C מראה תמונות של מבנים כאלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). התבנית עצמה עשויה פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) וניתן ליצור אותה כהעתק של תבנית ראשונית (לא מוצגת כאן) עם תכונות מתאימות (כחללים) באמצעות הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. התבנית העיקרית יכולה להיות מיוצרת על ידי הליכים שונים. זה ששימש לפרוטוקול זה נעשה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כפי שדווח Galland et al. 11; הליך ייצור התבנית הראשונית אינו קריטי לפרוטוקול זה. הפירמידות מסודרות במערך בריבוע, עם אותו גובה עבור כיווני X ו- Y (במקרה זה המגרש הוא 350 מיקרומטר).
לשם המחשה, פורסמו ניסויי הוכחת היתכנות12 כדי להדגים כי השבב מאפשר תרבית ארוכת טווח (חודשים) ופרוטוקולי התמיינות תוך הגדרה מדויקת של מספר התאים הראשוניים בבארות. פיתוח אישי של מספר רב של אורגנואידים יכול להיות מנוטר באופן אוטומטי בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי של שדה בהיר וגיליון אור תלת-ממדי. יתר על כן, ניתן לאחזר אורגנואידים כדי לבצע חקירות ביולוגיות נוספות (למשל, אנליזה תעתיקית). מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לייצור כיסויי תרבית תאים, הליך הזריעה והצביעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם שליפת האורגנואידים.
הערה: החלק הראשון של פרוטוקול זה מפרט את המיקרו-פבריקציה של התקן תרבית התא. עובש ראשוני מקורי עם חללים פירמידליים יכול להיות מיוצר בבית - אם מתקני מיקרו ייצור זמינים - או במיקור חוץ לחברות חיצוניות. התבנית העיקרית המשמשת בעבודה זו מיוצרת בתוך הבית, עם שלבי תהליך הייצור המתוארים במקום אחר11,13. פרוטוקול בסיסי למיקרו-פבריקציה של התבנית זמין בקובץ משלים 1. קריטי: הפעולות בשלבים 1 עד 6 צריכות להתבצע בסביבה נטולת אבק. עדיף מכסה מנוע זרימה למינרי או חדר נקי, אם יש. לאורך כל השלבים הללו, יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE), כגון כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות.
1. חיתוך תבנית PDMS
2. הכנת מצעי PDMS שטוחים
3. ייצור שכבת מרקם העשויה מדבק הניתן לריפוי UV
4. הכנת מצע כיסוי
הערה: כמצע למכשיר הסופי, נעשה שימוש בכיסויי 1.5H מעוגלים סטנדרטיים בקוטר 25 מ"מ. לפני שניתן להשתמש בהם, יש לנקות אותם כדי להסיר אבק ו / או שאריות אורגניות מפני השטח שלהם.
5. העברת סרט המרקם למצע הסופי
6. פסיבציה ארוכת טווח של כיסוי תרבית התא לתרבית תאים
הערה: פסיבציה מושגת על ידי יצירת ציפוי קונפורמי ורציף של קופולימר ביומימטי בעל מבנה דומה לקבוצת הפוספוליפידים הקוטבית בקרום התא. ציפוי קונפורמי זה מונע היצמדות תאים למכשיר תרבית התא
7. זריעת תאים
8. אימונוסטיין והדמיה
9. שחרור ואיסוף של אורגנואידים
הערה: ניתן לנתק את שכבת ההדבקה בעלת המרקם של צלחת תרבית התא מתלוש הכיסוי כדי לשחרר את הספרואידים/אורגנואידים החיים (לפני הקיבוע) הכלולים בתוך החללים הפירמידליים לצורך ניתוח התאים עם הליכים אחרים כגון ריצוף RNA, גישות אומיות, ניסויים במבחנה והשתלת in vivo .
איור 8F מראה את ההיבט הטיפוסי של כיסוי תרבית תאים לאחר ייצור מוצלח. שכבת הדבק הניתנת לריפוי UV נראית שטוחה ונדבקת היטב לכיסוי. העברת שכבת הדבק על תלוש הכיסוי עלולה להיכשל אם השכבה שעל הכיסוי מרומרת יתר על המידה, או אם הסרת מצע ה-PDMS השטוח נעשית באופן שגוי (כפי שמוצג באיור 8G,H). בשני המקרים, הכשל ניכר מכיוון שלא מועבר סרט בעל מרקם לתלוש הכיסוי.
כדי שהמיקרו-בארות יפעלו, הסרט בעל המרקם המיוצר (כמתואר בפרוטוקול שלב 3) צריך להיות פתוח גם בצד העליון וגם בצד התחתון של הפירמידות כדי להבטיח שתאים במהלך הזריעה בשלב 7 יוכלו להיכנס לחללים ולהישאר מוכלים ברגע שהאורגנואידים יתחילו להיווצר. איור 9 מראה את הגידול בעובי הציפוי על-ידי הגדלת הריכוז של הקופולימר הביומימטי בתמיסת הציפוי. איור 10 מראה את התוצאות של פירוק גזים של צלחות תרבית תאים כדי להבטיח שלא יילכד אוויר בחללים הפירמידליים. איור 10A,B מראה פירוק גזים מלא, ואילו איור 10C,D מראה בועות אוויר בחללים הפירמידליים.
באיור 11, תאים לכודים בתוך הפירמידות, והאורגנואידים המתאימים נוצרים לאחר ימים 2 ו-15 של תרבית. אם הפתח העליון של המיקרו-בארות סגור במקום זאת (כתוצאה משלב 3 שגוי), לא יישארו תאים לאחר שטיפת הדגימה לאחר זריעת תאים. איור 12 מראה תמונות מייצגות של האורגנואידים ושחזור תלת-ממדי שהתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב עם מטרת אוויר פי 40 (צמצם מספרי 0.75). לאחר שחרור ואיסוף, ניתן לאחסן את האורגנואידים בבקבוקון קטן ולהשתמש בהם לניתוח נוסף (למשל, ריצוף RNA). איור 13B מציג דוגמה של דגימה של אורגנואידים שנאספו כמתואר.
איור 1: תבנית Poly(dimethylsiloxane). (A) תבנית PDMS התחלתית המתקבלת כהעתק יצוק של רקיק במרקם 4 אינץ' (ראה קובץ משלים 1). (B) חתך ברוחב 1 ס"מ על 1 ס"מ של תבנית PDMS ההתחלתית. (C) סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של עמודי הטרפז המסודרים במערך ריבועי, המאכלסים את פני השטח של התבנית. מוטות קנה מידה = 1 ס"מ (A), 100 מיקרומטר ו- 200 מיקרומטר (C עליון ותחתון, בהתאמה). קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מצע PDMS שטוח. (A) שכבה של PDMS, בעובי ~1 מ"מ, מוכנה בכלי פטרי סטנדרטי ברוחב 15 ס"מ. (B) קילוף מתוך חתך טרי של PDMS. (C) את ה-PDMS הנותרים על צלחת הפטרי ניתן לחתוך לחתיכות נוספות לשימוש נוסף. (D) חיתוך PDMS שטוח ותבנית PDMS זה לצד זה; PDMS שטוח גדול יותר מאשר תבנית. קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנחת התבנית על המצע. (A) התבנית מונחת על המצע השטוח כשהפירמידות פונות כלפי מטה. (B) מראה שונה של מגע גרוע (למעלה) ומגע טוב (למטה) בין העובש למצע PDMS. (C) תמונת מיקרוסקופ אופטי של אזור עם מגע לקוי; העיגולים האדומים מדגישים את העמודים שאינם באים במגע עם המצע - הם נראים בצבע בהיר יותר מאלה שבמגע באותה תמונה. (D) תמונה אופטית של אזור שכל העמודים נמצאים במגע טוב. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (C,D). קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מילוי נימי של דבק הניתן לריפוי UV . (A) רצף תמונות זה מראה (משמאל לימין) את יציקת כמות קטנה של דבק על קצה אחד ואת התקדמות הדבק הנוזלי בחלל שבין התבנית למצע. החיצים הצהובים מצביעים על כיוון זרימת הנוזל. (B) רצף של תמונות אופטיות (הגדלה של פי 40) של חזית הנוזל הנעה; כאשר במגע טוב, החלק הקדמי של הנוזל נע סביב קצוות הפירמידות ללא דליפות. החצים הצהובים מצביעים על כיוון הזרימה והחצים האדומים מצביעים על הקצה המוביל של חזית הנוזל הנע סביב קצוות המגע. (C) רצף של תמונות אופטיות (40x) של חזית הנוזל הנעה כאשר המגע גרוע; החיצים האדומים מצביעים על הקצה המוביל של הנוזל החודר בין התבנית למצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הסרת התבנית לאחר ריפוי דבק. (A-C) הליך נכון לקילוף התבנית: תוך כדי לחיצה עדינה על עודפי הדבק בקצוות השמאליים בפינצטה, צובטים את התבנית קרוב לאותו קצה ומכופפים אותה לאט לאט כדי להתקלף. (D) התוצאה של ההליך הנכון; העודף נחתך בשלושה קצוות, בעוד עודף קטן של PDMS נשאר בצד הרביעי (חץ צהוב). (ה-ג) דוגמה להליך שגוי להסרת התבנית: התבנית נצבטת בפינצטה מהקצה הנגדי, וכתוצאה מכך מתקלפים מהמצע השטוח של סרט ההדבקה יחד עם התבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ציפוי של חיפוי הזכוכית. (A,B) דוגמה להליך ציפוי טוב: מכסה הזכוכית מונח על צ'אק הוואקום של ציפוי-ספין, ומספיק דבק מופץ במרכז, מה שנותן ציפוי הומוגני של הכיסוי. (ג,ד) דוגמה להליך ציפוי גרוע: לא מוותרים מספיק דבק, וכתוצאה מכך ציפוי לא אחיד של הכיסוי. (ה) משמאל לימין, דוגמאות לציפוי טוב, מקובל ורע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תהליך ציפוי חלופי . (A) טיפה קטנה של דבק נוזלי מונחת במרכז הכיסוי. (B) מכסה שני מונח בעדינות על גבי הראשון. (ג,ד) הנוזל מתפשט בין שתי הכיסויים ומפוזר באופן שווה. (ה) דוגמאות לתוצאות לאחר הפרדה נכונה של הכיסויים (משמאל) או הפרדה שגויה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: העברה לתלוש הכיסוי. (A) סרט ההדבקה המעובד והגזוז (איור 5D) מונח על תלוש הכיסוי עם דבק שנרפא חלקית. (B) דוגמה למגע טוב בין סרט הצילום בעל המרקם לבין הכיסוי. הכניסה היא תמונה אופטית המראה מגע אחיד של האזורים בין חללי הטרפז (צבע אחיד כהה). (C) דוגמה למגע לקוי בין סרט הצילום בעל המרקם לבין הכיסוי. האזורים הבהירים יותר אינם במגע, החצים האדומים מצביעים על אזורים אלה. הכניסה היא תמונה אופטית המציגה את המראה השונה של מגע טוב (שניים משמאל) ומגע גרוע (שניים מימין). פסי קנה מידה (צהוב, B,C) = 200 מיקרומטר. (D,E) הליך נכון להסרת המצע השטוח PDMS: פינצטה משמשת לצבוט את PDMS בקצה עם עודף PDMS ולהתכופף כדי לקלף בעדינות. (F) התוצאה עם סרט במרקם דבק UV הועברה בהצלחה לכיסוי. (ז,ח) דוגמה להליך קילוף שגוי: פינצטה משמשת לצביטה של PDMS שטוח על אחד הקצוות שבהם החומר העודף נחתך; לפיכך, הסרט מוסר יחד עם PDMS שטוח. קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ציפוי בקופולימר ביומימטי. (A) התקן תרבית תאים המצופה בקופולימר ביומימטי באמצעות תמיסה של 0.5% (משמאל) או (B) 1% (מימין) (w/v) באתנול טהור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: פירוק גזים של מכשיר תרבית תאים. (A) מכשיר תרבית תאים לפני פירוק מלא של גזים. (ב) מכשיר לתרבית תאים לאחר פירוק מלא של גזים; (C,D) מתקן תרבית תאים עם פירוק גז חלקי בלבד שבו בועות אוויר לכודות בפירמידות. מוטות קנה מידה = 200 מיקרומטר (A-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: תמונות מייצגות של שדה בהיר של זריעת תאים וגדילה של אורגנואידים . (A) תאים נראים צפים למעלה. (B) תאים שנלכדו בחללים הפירמידליים לאחר שטיפת תרחיף התא. רק תאים לכודים יישמרו כפי שמוצג. (C) תאים מצטברים ליצירת ספרואידים בכל חלל (יום 2 לאחר זריעת התא). (D) תמונה ביום ה-15 לאחר זריעת תאים של אורגנואיד שגדל בחלל פירמידלי. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A B), 120 מיקרומטר (C) ו- 150 מיקרומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: הדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים. (A) שלוש תוכניות Z שונות שנרכשו באמצעות קונפוקל דיסק מסתובב (עדשה 40x, אוויר, צמצם מספרי: 0.75) של אורגנואיד תחת התמיינות נוירואקטודרם (יום 7 לאחר זריעת תאים). צביעת אקטין באמצעות פלואידין (Alexa Fluor 647) בכתום ו-N-cadherin immunostaining (Alexa Fluor 561) בכחול. (B) שחזור תלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של האורגנואידים המתאימים (תוכניות 80 Z, גובה כולל של 100 מיקרומטר). חיצים לבנים: אשכולות של תאים סביב פס עם רמה גבוהה של ביטוי אקטין . חיצים כחולים: אשכולות תאים חיוביים לביטוי חלבון N-cadherin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 13: שחרור אורגנואידים. (A) הסרת שכבת הדבק בעלת המרקם בפינצטה; (B) תמונת שדה בהיר של תרחיף אורגנואיד שהתקבל לאחר ההסרה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב למיקרו-ייצור של תבנית Si עם מיקרו-חללים פירמידליים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
ההליך לייצור צלחת תרבית המיקרווול, המאפשרת תרבית אורגנואידים בצפיפות גבוהה והתמיינות, תואר במאמר זה. בשל הגיאומטריה והסידור של המיקרו-חללים, אלפי ספרואידים ניתנים לתרבית ולהכתמה בצלחת אחת לפרקי זמן ארוכים (מספר שבועות או יותר) כמעט ללא אובדן חומר. לשם השוואה, שטח של 4 מ"מ x 2 מ"מ על צלחת תרבית התא יכול להכיל ספרואידים רבים כמו צלחת אחת של 384 בארות עם שטח של 12 ס"מ x 8 ס"מ.
הפיזור הסדיר של המיקרו-חללים והכיסוי הסטנדרטי השטוח המשמש כמצע מאפשרים ניטור של אלפי אורגנואידים חיים או קבועים בתלת ממד, ללא צורך במניפולציה דגמית מורכבת וגוזלת זמן בין כלי הרבייה ותומכי ההדמיה. בשל צורת הפירמידה עם חלק עליון קטן יותר מהבסיס, אין אובדן של אורגנואידים עקב צעדי צנרת במהלך חילופי המדיום, ניפוק מטריצות חוץ-תאיות או הליכי צביעה. כל השלבים הללו יכולים להתבצע ישירות, כמו עבור חד-שכבה דו-ממדית של תאים ללא אמצעי זהירות נוספים, בניגוד לטכניקות ייצור אורגנואידים קלאסיות (למשל, טיפות תלויות, לוחות חיבור נמוכים, אגרוול).
יתר על כן, בהשוואה לטכניקות קיימות אלה, המיקרו-בארות תוכננו עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה התואמת לכל סוגי עדשות הטבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון). תחזוקה ארוכת טווח של אורגנואידים סגורים לכיסוי זכוכית שטוח הופכת את כיסוי תרבית התא לתואם למיקרוסקופ אור ברזולוציה גבוהה, דבר שאינו אפשרי בשיטות הקיימות ללא טיפול מורכב והעברת אורגנואידים מהירה. יתר על כן, הליך פסיבציה אופטימלי מונע כל הידבקות של תאים/אורגנואידים לתרבית ארוכת טווח, ובכך שולט בהתמיינות של התרבית התלת-ממדית לבסוף, מכיוון ששכבת הדבק בעלת המרקם ניתנת להסרה, ניתן לשלוף אורגנואידים חיים כדי לבצע סוגים אחרים של ניסויים כגון בדיקות -omics או השתלת in vivo .
יש לציין כי הצורה הפירמידלית וסידור המערך של המיקרו-חללים המשמשים לפרוטוקול זה נגזרים מהתבנית הראשונית, אשר יוצרה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כדי לספק למשטחים גימור דמוי מראה ונטייה של 45° כדי לאפשר מיקרוסקופ יריעות אור חד-תכליתי (soSPIM11). בעוד דיון בדרישות אלה ותיאור מלא כיצד לייצר תבניות כאלה ניתן למצוא במקומות אחרים12,13, פרוטוקול פשוט ניתן גם בקובץ משלים 1. קיימות דרכים שונות לייצור תבנית ראשונית, התואמות באופן מלא את ייצור השבבים בפרוטוקול זה. תחריט לייזר של זכוכית והדפסה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה, למשל, יכולים לשמש לייצור תבנית ראשונית עם חללים מתאימים להכלת האורגנואידים, אך אינם מתאימים להדמיית soSPIM.
פרוטוקול הייצור שנחשף כאן יכול להיות מותאם לשימוש בכל מעבדה ביולוגית סטנדרטית, מכיוון שאין צורך בכלי מיקרו-פבריקציה ייעודיים ומתקדמים. כמה שלבים קריטיים בייצור המיקרו-בארות הם הייצור באמצעות מילוי נימי של סרט הדבק בעל המרקם והעברתו למצע הזכוכית. עם זאת, מניסיוננו, הם יכולים להיות שולטים עם שחזור גבוה בתקופה קצרה של זמן. המרחק בין הפירמידות צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להגדיל את צפיפות החללים לצמיחת אורגנואידים, אך הוא גם צריך להיות גדול מספיק כדי שניתן יהיה לאטום את החללים על המצע ללא כל דליפה או חוסר איטום ביניהם. מצאנו כי מרחק של 50 מיקרומטר הוא פשרה טובה עבור מקרה זה.
במהלך זריעת תאים, היבט קריטי הוא הסרת כל בועות האוויר הכלואות בתוך החללים כדי להבטיח כניסה לתאים. אנו מתארים כאן פתרון מאומת, המשתמש רק בציוד מעבדה קלאסי (למשל, הומוגנייזר קולי או צנצנת ואקום). כדי לאפשר הומוגניזציה טובה יותר של מספר התאים בכל צלחת תרבית תאים, מומלץ להוציא את תרחיף התא מהצד של הצלחת ולא ישירות מעל הכיסוי. תסיסה ידנית עדינה יכולה גם לסייע להומוגניזציה של התמיסה התאית.
לאחר זריעת תאים, צלחת תרבית התא עם אורגנואידים ניתן לטפל כמו כל תמיכה תרבית קלאסית אחרת; אין צורך במניפולציה ספציפית או בצעדים קריטיים. כל הפרוטוקולים שנעשה בהם שימוש עם מכשירי המיקרווול זהים כמעט לאלה המשמשים בצלחות בעלות חיבור נמוך כגון צלחות U-bottom. לפיכך, תרבית אורגנואידים במיקרו-בארות אלה אינה דורשת כל שינוי בתנאי התרבית בהשוואה לתקנים אחרים.
גורם קריטי נוסף הוא שהדבק המשמש כאן הוא דבק אופטי. בשימוש הטוב ביותר המוצע (עיין גם בהערות יישום מהספק), שני אלמנטים אופטיים שיש להדביק מיושרים ודבק הניתן לריפוי UV מוחל בממשק. חשיפה ראשונה לקרינת UV של אנרגיה שאינה מספיקה כדי לגרום לפילמור מלא משמשת למיצוק הדבק תוך שמירה על תכונות הדבק. ניתן להזיז את הרכיבים האופטיים כדי להשיג יישור אופטימלי, ואז הדבק נרפא במלואו למצבו הסופי עם חשיפה שנייה ל- UV כדי לספק הדבקה קבועה. מנות אנרגיית החשיפה הראשונה והשנייה (כלומר, זמני חשיפה אם נעשה שימוש במקור של צפיפות אנרגיה ידועה וקבועה) חייבות להיות אופטימליות בהתאם לצפיפות האנרגיה של מקור ה- UV בו נעשה שימוש, עובי שכבת הדבק, העברת UV דרך האלמנטים האופטיים, ומרקם פני השטח (או היעדרו) של המשטח שיש להדביק.
בעוד שההדבקה בין סרט המרקם לבין הכיסוי המצופה בדבק נדרשת להיות חזקה מספיק כדי לספק איטום חסין נזילות, יש גם לאפשר להסיר את סרט הצילום בעל המרקם כדי לאחזר את האורגנואידים לאחר ההדמיה, אם נדרש ניתוח נוסף, כגון פרופיל גנוטיפי. פשרה נכונה בין איטום חסין נזילות לבין היכולת לקלף את היריעה בעלת המרקם הושגה באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, אך ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת של זמני הריפוי המקדימים והסופיים של שכבת הדבק הדקה על הכיסוי מכיוון שהיא תלויה במערכת החשיפה לקרינת UV ובעובי הסרט בו נעשה שימוש.
מגבלה אחת בגרסת המיקרו-בארות הנוכחית היא בהליך הזריעה; יש לזרוע תאים לפני רכיבי ECM כדי לאפשר להם להיכנס לקרבת הפירמידה. שיפורים נמשכים כדי לצפות את המיקרו-בארות ברכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כצעד ראשון. עדיין לא ביצענו מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על האורגנואידים הקבועים בתוך החללים. יידרש שינוי מסוים בפרוטוקולי הייצור ותרביות התאים הללו לפני שהדמיית אורגנואידים במיקרו-בארות עם EM תהפוך לאפשרות מעשית.
הרחבה עתידית טבעית של שיטה זו היא לספק יכולות סינון תוכן גבוהות כדי לאפשר בדיקה מרובת תנאים בזרימת עבודה אחת (צלחת multiwell). מכשיר תרבית תאים זה מספק חלופה ייחודית לטכניקות אורגנואידים קיימות, מציע תפוקת תרבית והדמיה ללא תחרות ופותח נקודות מבט חדשות בתחום מחקר האורגנואידים ליישום ביו-רפואי וגילוי תרופות.
בקשת פטנט בינלאומית פורסמה עם מספר הפרסום WO 2021/167535 A1.
המחקר נתמך על ידי פרויקט CALIPSO הנתמך על ידי קרן המחקר הלאומית, משרד ראש הממשלה, סינגפור, במסגרת תוכנית קמפוס למצוינות במחקר ויזמות טכנולוגית (CREATE). V.V. מודה על תמיכתם של חוקר NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, מימון סיד MBI ו- ANR ADGastrulo. א.ב. וג.ג. מודים על התמיכה ממימון הליבה של MBI. א.ב. מודה לאנדור טכנולוגיות על השאלת המיקרוסקופ BC43.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
DI Milliq water | Millipore | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved