살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

제브라피쉬는 놀라운 평생 성장과 재생 능력을 발휘합니다. 예를 들어, 배아 발생 중에 확립 된 특수 줄기 세포 틈새 시장은 눈과 뇌 모두에서 전체 시각 시스템의 지속적인 성장을 지원합니다. 망막과 광학 텍텀 사이의 조정 된 성장은 눈과 뇌에 새로운 뉴런이 추가됨에 따라 정확한 망막 토픽 매핑을 보장합니다. 망막 축삭이 생존, 증식 및/또는 분화와 같은 지각 줄기 및 전구 세포 행동을 조절하는 데 중요한 정보를 제공하는지 여부를 해결하기 위해서는 동일한 동물 내의 신경질과 탈핵된 지체 엽을 비교할 수 있어야 합니다.

살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면이 목표를 달성합니다. 첨부 된 비디오는 애벌레를 마취하고, 전해로 텅스텐 바늘을 날카롭게하고, 한쪽 눈을 제거하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 고정 된 제브라 피쉬 애벌레에서 뇌를 해부하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 비디오는 면역 조직 화학을위한 프로토콜에 대한 개요와 현미경 검사를 위해 저융점 아가로스에 염색 된 배아를 장착하는 방법에 대한 데모를 제공합니다.

이 방법의 목표는 망막 입력이 제브라 피쉬 뇌의 시각 처리 센터 인 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 한쪽 눈을 제거한 다음 광학 텍텀의 양면을 비교함으로써 동일한 시편 내의 텍탈 변화를 관찰하고 표준화하여 여러 표본에서 비교할 수 있습니다. 이 기술과 결합 된 현대 분자 접근법은 시각적 시스템 성장 및 개발뿐만 아니라 축삭 변성 및 재생의 기초가되는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 것입니다.

시각, 청각 및 신체 감각 - 감각 시스템은 외부 기관으로부터 정보를 수집하고 그 정보를 중추 신경계로 전달하여 중뇌 ^1,2에 걸쳐 외부 세계의 "지도"를 생성합니다. 시력은 많은 물고기를 포함한 거의 모든 척추 동물에게 지배적 인 감각 양식입니다. 눈의 신경 조직인 망막은 주로 광수용체, 양극성 세포, 망막의 돌출부 뉴런인 망막 신경절 세포(RGCs)로 구성된 뉴런 회로로 정보를 수집합니다. RGC는 망막의 내부 표면을 가로 질러 시신경 머리로가는 길을 찾는 긴 축삭을 가지고 있으며, 뇌를 통해 매혹되고 함께 여행하며 궁극적으로 등쪽 중뇌의 시각 처리 센터에서 끝납니다. 이 구조는 물고기 및 다른 비 포유류 척추 동물에서 광학 텍텀이라고하며 포유류³에서 우수한 콜리큘러스와 상동성입니다.

광학 텍텀은 등쪽 중뇌의 양측 대칭 다층 구조입니다. 제브라피쉬와 대부분의 다른 물고기에서, 시신경의 각 엽은 대측 눈으로부터 시각 입력만을 수신하여 좌측 시신경이 우측 지골로브에서 종결되고 우측 시신경이 좌측 지골엽(⁴)에서 종결된다(그림 1). 포유류와 마찬가지로 우수한 콜리큘러스인 광학 텍텀은 오디션과 소마토센세이션을 포함한 다른 감각 입력과 시각 정보를 통합하여 사케이드 ^1,5,6과 같은 시각적 관심과 안구 움직임의 변화를 제어합니다. 그러나, 포유류의 우수한 콜리큘러스와는 달리, 광학 텍텀은 텍탈 증식 구역⁷이라고 불리는 텍탈 로브의 내측 및 꼬리 가장자리 근처의 특수 줄기 세포 틈새 시장에서 지속적으로 새로운 뉴런과 글리아교를 생성합니다. 시신경 텍텀 및 중추 신경계의 다른 영역에서 증식성 전구 인자의 유지는 부분적으로 제브라피쉬⁸에 문서화 된 놀라운 재생 능력에 기여합니다.

맹인 또는 한쪽 눈의 물고기의 두뇌를 조사한 이전 연구에 따르면 광학 텍텀 크기는^9,10,11을받는 망막 신경의 양에 직접적으로 비례한다는 것이 ^{밝혀졌습니다.} 초기 배아 발생시 눈이 퇴화하는 성인 동굴 물고기에서 광학 텍텀은 밀접하게 관련된, 관찰 된 표면 물고기의 그것보다 눈에 띄게 작습니다⁹. 동굴 물고기 눈 변성은 배아 발생 동안 내인성 렌즈를 표면 물고기의 렌즈로 대체함으로써 차단 될 수 있습니다. 이 한쪽 눈의 동굴 물고기가 성인기까지 자랄 때, 신경 과민 지체 엽은 비 신경 수축 엽⁹보다 약 10 % 더 많은 세포를 포함합니다. 마찬가지로, 동일한 개체 내에서 다른 크기의 눈을 생성하기 위해 화학 처리와 함께 배양 된 애벌레 킬리 피쉬에서, 더 많은 신경을 가진 텍텀의 측면은 더 크고 더 많은 뉴런⁽¹⁰)을 포함했다. 성인 금붕어에서 시신경 분쇄 실험의 증거는 신경이 증식을 촉진한다는 것을 나타내며, 신경이 파괴되었을 때 지각 세포 증식이 감소합니다¹¹.

이러한 고전적 연구를 확인하고 확장하면서, 최근의 몇몇 보고서는 신경과민에 대한 반응의 증식이 BDNF-TrkB 경로^12,13에 의해 적어도 부분적으로 조절된다는 것을 암시하는 데이터를 제공한다. 발달하는 감각 시스템이 손상과 축삭 변성에 어떻게 대처하는지, 세포 및 분자 신호가 망막 입력을 가능하게 하여 광학 텍텀 성장을 조절할 수 있는지, 이러한 메커니즘이 활성화될 때, 신경 연결된 증식 및 분화가 망막과 표적 조직이 성장 속도를 조정하고 정확한 망막 토픽 매핑을 보장할 수 있는지 여부 등 광학 텍텀의 성장과 발달에 관한 많은 열린 질문이 남아 있습니다. 또한, 아래에 설명 된 것과 같은 외과 적 접근법으로 제브라 피쉬 시각 시스템을 심문함으로써 해결할 수있는 활동 의존적 발달에 관한 훨씬 더 큰 질문이 있습니다.

신경 활동, 특히 시각적 입력으로부터 세포 생존 및 증식을 변화시키는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명 된 접근법은 개별 제브라 피쉬 유충 내의 신경 및 탈질 된 텍탈 엽 (그림 1)을 직접 비교합니다. 이 방법은 광학 구조체에서 RGC 축삭 변성에 대한 문서화와 유사분열 세포의 수가 신경과민과 상관관계가 있음을 확인할 수 있게 한다.

그림 1 : 일방적 인 눈 제거 전후의 제브라 피쉬 유충의 스케치. (A) 해부 현미경으로 볼 때 5 dpf 유충의 그림. 각 유충은 저융점 아가로스에 내장되어 있으며 날카로운 후크 팁이있는 텅스텐 바늘 앞에 옆으로 향하게되어 눈을 위로 향하게합니다 (이 예에서는 왼쪽 눈). (B) A에 묘사 된 수술로 인한 9 dpf 유충의 등쪽 뷰의 그림. 오른쪽 눈에서 고도로 개략화 된 RGC 축삭 돌기는 왼쪽 지체 엽의 뉴런과 수축하고 연결하는 것으로 나타났습니다. 약어 : dpf = 수정 후 일; dps = 수술 후 일수; RGC = 망막 신경절 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 논문의 방법은 Reed College 및 University College London의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 승인에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 제브라피쉬 균주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 재료 및 도구 준비

1. 솔루션을 만드세요.
   1. 60x 스톡(300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl2-이수화물, 및 20 mM_MgCl2-육수화물)을 탈이온수에 희석하여 배아_배지(E3¹⁴)를 만들고, 오토클레이브하고, 실온에서 저장하였다. 160 mL의 60x E3를 10 L의 탈이온수에 첨가한다. 실온에서 보관하십시오.
   2. E3에서 1 % 낮은 융점 (LMP) 아가로스를 만드십시오. LMP 아가로스 1 g을 E3 100 mL에 녹여 전자레인지에서 1-2분 동안 고출력으로 끓인다. 분취량 용융 아가로오스를 1.7 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 첨가하고, 4°C에서 저장한다. 수조에서 끓여서 매립에 사용할 준비가 되었을 때 40°C의 열 블록을 유지하십시오.
   3. 10x 스톡을 희석하여 마크 개질된 링거 (MMR¹⁵) 등장성 용액을 만든다 (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM _CaCl2-이수화물, 50 mM HEPES, pH를 10 M NaOH로 7.5로 조정한 다음, 오토클레이브하고, 실온에서 저장). 10x MMR 10mL를 탈이온수 90mL에 첨가한다.
2. 제조업체의 지침에 따라 Sylgard 플레이트를 부어 며칠 동안 설정하고 건조시킬 수 있습니다¹⁶.
3. 전해로 텅스텐 바늘을 날카롭게합니다 (프로토콜은 ¹⁷에서 수정됨).
   1. 먼저, 스크류 탑 뚜껑이 있는 넓은 입의 유리 병에 탈이온수 200 mL를 첨가하여 10%(w/v) KOH 용액을 준비합니다. 20g의 KOH 펠렛을 천천히 저어줍니다.
      참고 :이 부식성 솔루션은 매우 발열성이 있습니다. 장갑과 눈 보호 장치를 착용하고 후드에 용액을 저어줍니다.
   2. 2-3cm 길이의 텅스텐 와이어를 자르고 바늘 홀더에 삽입하십시오.
   3. 음극 및 양극 전선을 전원 공급 장치에 연결합니다. 음극선 끝의 악어 클립을 부분적으로 곧게 펴진 종이 클립에 부착하고 종이 클립을 KOH 용액에 삽입하여 항아리의 측면에 부착하십시오.
   4. 다음으로, 애노드 와이어의 악어 클립을 바늘 홀더의 목에 부착하십시오. 전원을 켜고 (~ 20V까지) 텅스텐 와이어를 KOH 용액에 담그고 와이어를 용액에서 비스듬히 당겨 와이어를 미세 팁으로 전해로 날카롭게합니다.
      참고: 반응이 진행됨에 따라 종이 클립에서 거품이 나옵니다.
   5. 해부 현미경으로 바늘 끝을 확인하여 충분히 날카로운지 확인하십시오.
   6. 바늘을 탈이온수로 헹구어 모든 KOH 잔류물을 제거한다. 미리 여러 바늘을 만들고 애벌레 수술과 해부까지 보관하십시오.
4. 직립 공초점 현미경으로 제브라피쉬 표본을 이미징하기 위한 챔버형 슬라이드를 만듭니다.
   1. 유리 현미경 슬라이드와 두 부분으로 구성된 에폭시 수지를 얻습니다 ( 재료 표 참조). 패키지의 지침에 따라 에폭시를 혼합하고 유리 슬라이드에 두꺼운 고리 또는 사각형을 칠하십시오. 슬라이드를 사용하기 전에 후드에서 적어도 24시간 동안 경화시키고 말리십시오.

2. 배아 수집 및 양육

1. 늦은 오후 / 이른 저녁에 번식 상자에 원하는 유전자형의 성인 남성과 여성 물고기를 쌍으로 묶으십시오. 다음날 아침, 그들이 산란 한 후, 메쉬 스트레이너로 새로 수정 된 알을 모아서 100mm 페트리 접시에서 E3로 옮깁니다.
2. 수술 당일까지 ~ 27.5 °C에서 14 h 빛 / 10 h 암주기로 배아를 배양하십시오. E3를 매일 또는 필요에 따라 변경하십시오.
3. 수정 후 5 일 (dpf) 또는 수술 후 하루 후에 시작하여 하루에 한 번 수확 된 로티퍼로 가득 찬 점적기를 사용하여 애벌레에게 먹이를줍니다. 유충이 몇 시간 동안 먹은 후 E3를 변경하여 남아있는 로티퍼와 폐기물을 제거하십시오.
   참고 : 수술 당일에 애벌레에게 먹이를주지 마십시오.

3. 수술을 위해 애벌레를 준비하십시오.

1. 수술 당일에는 넓은 보어의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 10-15 마리의 유충을 신선한 E3로 채워진 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
2. 0.4 % w / v 트리카인 용액 (210 mM 트리스, pH 9에 용해 된 0.4 g 트리카인, 필요한 경우 pH 7.4로 조정 된 최종 용액¹⁸)의 3-5 방울을 ~ 0.0015 % w / v 트리카인의 최종 농도를 위해 접시에 첨가하여 유충을 마취하십시오. 유충이 적절하게 마취되었는지 확인하기 위해 접촉에 대한 반응이 부족한지 확인하십시오. ~ 3 분 후에도 여전히 터치에 반응하는 경우 Tricaine 용액과 함께 0.4 % 2-3 방울을 더 추가하고 다시 평가하십시오.
   참고 :이 발달 단계에서는 해부 현미경으로 운동성 외에도 혈류와 심박수를 모니터링 할 수 있습니다.
3. 마취된 제브라피쉬 유충을 E3에 용해된 1% LMP 아가로오스에 매립하여 고정시킨다.
   1. 먼저 35mm 페트리 접시의 뚜껑을 해부 현미경 아래 위로 향하게하십시오. 다음으로, 한 마리의 유충을 소량의 E3만으로 좁은 구멍의 유리 파스퇴르 피펫으로 가져 가십시오.
   2. 이어서, 흡인물∼200 μL를 용융시키고, 가온(∼40°C) 1% LMP 아가로오스를 유충과 함께 피펫에 넣는다. 마지막으로, 유충과 아가로스를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 쏟아 붓습니다.
   3. 둔한 텅스텐 바늘을 사용하여 유충을 빠르고 부드럽게 조종하여 한쪽 눈을 위로 향하게하여 측면이되도록하십시오. 아가로스가 설정 될 때까지 기다리십시오 (~ 5 분).
      참고 : 유충이 측면이 아닌 동안 아가로스가 굳어지면 (5 단계에서 설명한대로) 아가로스에서 풀어 E3와 트리카인으로 접시에 돌려 보내십시오.

4. 눈 제거

1. 일단 아가로스가 설정되고 유충이 옆으로 위치하면, 매우 미세하고 전해적으로 날카로운 텅스텐 바늘의 끝을 사용하여 눈 궤도의 가장자리를 따라 눈 주위의 피부를 관통하십시오.
2. 다음으로, 바늘의 가장자리 (팁이 아님)를 눈의 측두엽 - 복부 쪽에서 눈 밑으로 밀어 넣습니다. 제어된 압력을 사용하여 소켓에서 눈을 떼어냅니다.
3. 매우 미세한 수술 포셉을 사용하여 시신경을 꼬집고 눈을 내측에서 옆으로 밀어 눈을 제거하십시오. 또는 바늘 옆으로 눈을 등쪽과 앞쪽으로 계속 누르기 만하면 결국 시신경을 통해 슬라이스되어 눈을 풀어줍니다.
   참고 : 수술 중에 눈 이외의 조직이 실수로 찔린 경우, 빠른 감금으로 유충을 신속하고 인도적으로 죽입니다.

5. 실험 종점까지 수술 후 관리

1. 눈 제거에 성공한 후, MMR 용액으로 아가로스를 덮으십시오.
2. 텅스텐 바늘을 머리 주위로 부드럽게 닦은 다음 몸 주위를 부드럽게 닦고 포셉으로 페트리 접시 뚜껑을 안정화시켜 아가로스에서 각 유충을 해방시킵니다.
3. 한쪽 눈의 유충을 페니실린 / 스트렙토 마이신 칵테일을 1:100 희석하여 보충 된 MMR이 들어있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 배아를 ~27.5°C에서 14시간 광/10시간 암주기로 인큐베이션한다.
   참고 : 항생제로 보충 된이 MMR의 등장성 솔루션은 처음에는 애벌레의 치유와 생존을 돕습니다. 각 접시는 최대 15 마리의 회복 된 애벌레를 수용 할 수 있습니다.
4. 다음날 애벌레를 E3로 돌려 보내십시오. 수술 후 오후부터 하루에 한 번 수확 된 로티퍼로 가득 찬 점적기를 사용하여 유충 (~ 6dpf 이상)에게 먹이를줍니다. 유충이 몇 시간 동안 먹은 후 E3를 변경하여 남아있는 로티퍼와 폐기물을 제거하십시오.

6. 애벌레 고정

1. 유충이 분석을위한 원하는 발달 단계에 도달하면 심장이 멈출 때까지 치명적인 양의 트리카인 (~ 0.4 % 최종 농도)으로 마취하십시오.
2. 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브 당 최대 30 마리의 유충을 피펫. 과량의 E3을 제거한 다음 0.5-1 mL의 고정 용액 (인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라포름 알데히드 (PFA) 및 4 % 수크로오스)을 첨가하여 조직을 고정시켰다. 유충을 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
3. 다음날 PBS로 유충을 세척하고 고정제를 제거하고 유충을 PBS로 3-4회 헹구었다. 해부 전에 최대 7 일 동안 4 °C에서 유충을 보관하십시오.

7. 뇌를 드러내기 위해 애벌레를 해부한다 ( ¹⁵에서 적응)

1. 해부 현미경으로 실가드 플레이트의 PBS 물방울에 고정 된 유충을 일시 중지하십시오. 노토초드를 통해 두 개의 텅스텐 핀 (일반적으로 2cm 미만의 오래된 텅스텐 바늘)을 배치하여 측면으로 고정하고, 한 핀은 대동맥 - 고나드 - 메소네프로 스 (AGM) 영역을 덮고있는 색소 부위의 바로 후방에, 다른 핀은 노른자 연장의 끝과 일치하여 고정시킵니다.
   참고 : 텅스텐 핀을 가능한 한 적은 시도로 배치하십시오.왜냐하면 조직이 펑크 할 때마다 더 부서지기 쉽기 때문입니다.
2. 매우 날카로운 텅스텐 바늘과 바늘 날카로운 포셉을 사용하여이 순서대로 눈, 귀, 턱, 소화관 및 등쪽 두개골 피부를 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
   1. 먼저, 단계 4에서 수술적 안구제거와 유사한 기술을 이용하여 눈을 제거한다. 그런 다음 유충의 고정을 해제하고 반대쪽으로 뒤집어 다른 쪽 눈이 접근 할 수 있도록하고 반복하십시오. 또는 바늘을 턱을 통해 다른쪽으로 찌르고 고정을 풀지 않고 눈을 제거하십시오.
      참고: 이 조직의 분석이 필요한 경우 이 시점에서 눈을 채취할 수 있습니다( ¹⁹와 유사).
   2. 다음으로, 텅스텐 바늘을 사용하여 귀의 측두엽에서 복부 쪽으로 긁으십시오. 같은 동작 / 동작으로 바늘 후방을 턱으로 가져 와서 귀와 턱이 제거 될 때까지 부드럽게 앞쪽으로 당깁니다.
   3. 포셉을 사용하여 복부 장기와 남아있는 노른자를 꺼내십시오.
   4. 마지막으로, 뒷뇌와 척수 사이의 교차점 근처의 등쪽 두개골 피부에 얕은 절개를하십시오. 포셉으로 피부를 들어 올리고 전방과 텔렌스팔론 주위를 당깁니다. 이것이 너무 어렵다는 것이 입증되면 뒷뇌의 초기 절개에서 시작하여 먼저 피부를 옆으로 당긴 다음 심실 및 전방으로 당겨 텍텀의 측면 가장자리를 긁지 않도록주의하십시오.
      참고 : 중뇌가 연구 대상이기 때문에 뒷뇌를 절단 할 수 있습니다. 그러나 깊은 절개로 인해 감금이 발생할 수 있습니다.
   5. 포셉으로 남아있는 조직을 제거하십시오. 유충을 핀을 풀고 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 PBS로 옮긴다.
      참고: 전체 마운트 프로토콜을 수행할 때 더 나은 가시성을 위해 꼬리를 뇌에 부착한 상태로 두십시오.

8. 뇌 탈수 및 저장

1. 뇌에서 PBS를 제거하고 0.1% TritonX-100 (PBST)을 함유하는 PBS 1 mL를 첨가한다. 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션한다.
2. PBST를 제거하고 50:50 메탄올:PBST 용액으로 교체합니다. 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션한다.
3. 실온에서 각각 5분 동안 100% 메탄올(MeOH)로 뇌를 두 번 세척한다.
4. 면역조직화학 또는 다른 전체탑재 절차를 수행하기 전에 뇌를 -20°C에서 100% MeOH에 적어도 16시간 동안 보관하십시오.
   참고: 뇌는 -20°C에서 최대 2년 동안 MeOH에 저장할 수 있습니다.

9. 면역조직화학

참고: 제브라피쉬의 많은 유용한 전체 마운트 기술에 대한 확립된 프로토콜은 ZFIN²⁰에서 찾을 수 있습니다. 이 원고는 Tg[atoh7: RFP] 라인의 시신경 축삭돌기에서 발현되는 적색 형광 단백질(RFP)(그림 2) 또는 유사분열 세포를 강조하는 인산화된 히스톤 H3(PH3)를 인식하는 항체로 면역염색된 일안구 및 2눈의 유충을 비교한 예를 제공합니다(그림 3). 전체 마운트 배아 및 유충에 대한 표준 면역 조직 화학 프로토콜이 아래에 요약되어 있습니다.

1. 먼저, 유충 뇌를 등급화된 일련의 MeOH:PBST로 재수화시켜 5분 동안 50:50 MeOH:PBST에서 시편을 배양한 다음, 30:70 MeOH:PBST에서 5분 동안 배양한 다음, PBST를 3회 세척하여 마무리한다.
2. 뇌를 투과시키기 위해, 프로테이나제 K(PK)가 보충된 PBST에서 37°C에서 30분 동안 20μg/ml PK의 최종 농도로 배양한다. 10 mg/mL PK의 분취량을 -20°C에서 보관하고 사용 전에 해동하십시오.
3. PK 용액을 제거하고 PBST로 뇌를 15분에 걸쳐 3회 헹구어 남은 효소를 씻어낸다.
4. 투과화된 뇌를 25°C(또는 실온)에서 20분 동안 4% PFA에서 인큐베이션하여 재고정시킨다. 그런 다음 PFA를 제거하고 PBST로 15 분에 걸쳐 뇌를 3 번 헹구어 남아있는 고정제를 씻어 내십시오.
5. 최종 PBST 헹굼을 갓 만든 면역차단 (IB) 완충액 (PBST에서 10% 정상 염소 혈청 및 1% DMSO로 교체)으로 교체하고 실온에서 적어도 1 시간 동안 인큐베이션한다.
6. 일차 항체를 적절한 농도로 IB 완충액 내로 희석한다 (예를 들어, RFP의 경우 1:500, PH3 항체의 경우 1:300).
7. 뇌에서 IB 버퍼를 제거하고 일차 항체 희석액으로 교체하십시오. 부드러운 흔들림으로 오비탈 쉐이커 상에서 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 튜브가 옆구리에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
8. 다음날 아침, 마이크로피펫으로 일차 항체 용액을 제거하고, PBST에서 두 번 헹구고, 실온에서 4 x 30분 동안 PBST로 뇌를 세척한다.
   참고: 일차 항체 희석액은 4°C에서 보관하는 경우 ~7일 이내에 한 번 재사용할 수 있습니다.
9. 이차 항체를 적절한 농도로 IB 완충액으로 희석하면서 IB 완충액에서 뇌를 헹구십시오 (예를 들어, Alexa-fluor 568 anti-rabbit의 경우 1:500).
10. IB 완충액을 제거하고 이차 항체 희석액으로 교체하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션하고, 튜브를 양쪽에 부드럽게 흔들어 놓는다.
11. 다음날 아침, 이차 항체 용액을 제거하고, PBST로 헹구고, 실온에서 4 x 30분 동안 PBST로 뇌를 세척한다.
12. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 ToPro3(하룻밤 사이에 4°C에서 PBST에서 1:5,000)로 염색을 역염색하였다.
13. 다음날 아침, 애벌레 뇌를 PBS로 옮기고 아래에 나열된 장착 및 이미징 단계로 진행하십시오.

10. 설치 및 이미징

1. 챔버 슬라이드를 진공 그리스로 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 고정시킵니다.
2. 면역 염색되고 처리 된 유충을 우물 플레이트 또는 우울증 슬라이드로 옮겨 해부 현미경으로 관찰하십시오.
3. 유충을 1% LMP 아가로스의 컬럼에 챔버 슬라이드에 장착한다.
   1. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버 슬라이드에 유충 한 마리를 넣고 가능한 한 적은 PBS를 증착하십시오. 동일한 피펫으로 유충을 용융 된 1 % LMP 아가로스 (~ 40 °C)로 덮으십시오.
   2. 무딘 텅스텐 바늘이나 포셉으로 아가로스를 기둥에 그린 다음 등쪽 표면을 볼 수있는 가능한 한 대칭으로 유충을 배치하십시오.
   3. 나머지 애벌레에 대해이 절차를 반복하십시오.
   4. 아가로스가 겔화되면 PBS 몇 방울로 덮은 다음 공초점 현미경 무대에 놓습니다.
4. 대물 렌즈를 샘플과 정렬하고, 투과 된 빛을 사용하여 현미경에 초점을 맞추고, 적절한 레이저로 샘플을 비추십시오.
   참고: 이 예에서는 DAPI 및 RFP를 각각 여기시키기 위해 405nm 및 568nm 파장을 사용했습니다.
5. 슬라이더 막대를 신호 및 사용된 검출기에 대해 적절한 수준으로 이동하여 게인, 오프셋 및 레이저 파워를 조정합니다. 각 채널의 히스토그램을 확인하고 이미지 위의 채도 상태 표시기 버튼을 클릭하여 노출 수준을 측정하여 픽셀이 포화되지 않고 신호 대 잡음비가 높은지 확인합니다. 제브라피쉬 내의 세포 및 아세포 분해능에 대한 최적의 공초점 이미징 파라미터의 예는 ²¹을 참조한다.
6. 마우스의 스크롤휠을 사용하여 샘플의 위쪽과 아래쪽을 찾아 z-평면 스택의 상한과 하한을 설정합니다. 이미지 수집을 위해 위쪽 및 아래쪽 제한을 클릭한 다음 지금 실행 단추를 클릭하여 z-스택 캡처를 트리거합니다.
   참고 : 뇌가 얼마나 대칭적으로 장착되는지에 따라 9dpf 애벌레 제브라 피쉬 뇌의 총 Z 깊이는 ~ 150-200 μm가됩니다.
7. 색맹 접근성을 염두에두고 이미지를 처리하고 채색하십시오 (예 : 두 가지 색상 이미지의 경우 파란색과 주황색 또는 자홍색 및 녹색을 사용하십시오). Adobe에서 Photoshop과 같은 이미지 또는 이미지 처리 소프트웨어를 캡처하는 데 사용되는 소프트웨어에서 조회 테이블을 설정합니다.
8. Photoshop에서 컬러 원시 사진 현미경 사진은 (i) 이미지 모드를 RGB로 변환하고 (ii) 이미지 | 아래의 곡선 옵션에 액세스하여 8 비트 태그 이미지 파일 형식 (TIFF)으로 저장됩니다. 메뉴를 조정 한 다음 (iii) 적절한 컬러 광 출력을 0 또는 255 레벨로 밀어 원하는 색상을 얻습니다. 예를 들어, 녹색 신호를 얻으려면 빨간색 채널을 선택하고 출력을 0으로 밉니다. 그런 다음 파란색 채널을 선택하고 출력도 0으로 밉 니다. 마찬가지로 마젠타 신호를 얻으려면 녹색 채널을 선택하고 출력을 0으로 밀어 넣습니다. 빨간색과 파란색 채널을 그대로 둡니다.
   참고 : 무료 Gnu 이미지 조작 프로그램 (김프)에서 비슷한 단계를 수행 할 수 있습니다.
9. 플러그인 메뉴의 분석에서 사용할 수 있는 ImageJ²²의 셀 카운터 플러그인을 사용하여 특정 마커를 표시하는 셀 수를 수동으로 정량화합니다. 셀 카운팅에 ImageJ를 사용하는 방법의 예는 ²³을 포함한 많은 자습서에서 찾을 수 있습니다.
10. RStudio와 같은 통계 소프트웨어에서 데이터의 그래픽 표현을 생성합니다 (에 대한 보충 데이터 참조). Rmd 파일).

눈 제거가 완료되었는지 여부를 확인하고 시신경 텍텀이 어떻게 변하는지를 평가하기 위해, 모든 RGC를 막 표적 RFP로 라벨링하는 Tg[atoh7:RFP] 균주에서 수술을 수행했으며, 따라서 망막으로부터 투사되어 시신경을 형성하는 모든 축삭기⁽²⁴)를 형성한다. 이 균주를 사용하는 것이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 시신경 텍텀 뉴로필에서 시신경 테르미니를 직접 관찰하고 시각화 할 수 있습니다. 친유성 DiI 또는 DiO 염료^25,26을 사용한 축삭 추적 또는 brainbow ²⁷을 사용한 다중 스펙트럼 표지와 같은 시신경을 표지하기 위한 다른 접근법도 또한 가능할 것이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 시신경텍텀 뉴로필에서 망막 축색돌기의 진행성 변성은 눈 제거 후 관찰되었다. 수술 후 이틀 후, RFP 라벨이 붙은 축삭은 블빙 및 단편화와 같은 빠른 Wallerian 변성²⁸의 특징을 나타내었다 (그림 2A, B). 최근의 연구에 따르면 미세아교세포는 뉴런이 침묵할 때 더 많은 미엘린 물질을 삼킨다²⁹. 퇴행성 RGC 축색돌기의 미세아교세포 삼킴 비트와 일관되게 변성의 근원으로부터 멀어지면서, 텍탈 뉴로필 내외의 밝은 RFP 표지된 누점이 주목되었다(도 1B, 화살표). 수술 후 나흘 후, 파편화된 축삭돌기와 RFP 라벨이 붙은 축삭 파편은 어느 지측 엽에서도 상당히 감소되며, 이는 죽어가는 축삭돌기의 비교적 빠른 클리어런스를 나타낸다(그림 2C,D).

전체 마운트 면역 조직 화학을 수행하고 애벌레 제브라 피쉬의 광학 구조를 시각화하기 위해 피부와 결합 조직의 눈, 턱, 귀 및 두개골 캡을 해부하여 뇌를 노출시켰다. 이상적으로, 뇌는 이 절차 동안 온전하게 남아있다(예를 들어, 도 2C, D). 그러나 전뇌의 일부, 특히 후각 전구는 피부 또는 턱의 두개골 캡이 제거되면 손상되거나 완전히 제거 될 수 있습니다 (그림 2A, 화살촉). 더욱이, 때때로 텍텀의 측면 가장자리는 피부를 뚫거나 꼬집어 뇌에서 떼어낼 때 슬라이스될 수 있다(예를 들어, 도 2A; 우측 지골엽의 찢어짐).

면역조직화학은 또한 전체 뇌를 PH3 항체로 염색함으로써 광신경의 신경질화된 및 비신경화된 엽에서 유사분열 세포의 수를 평가하는데 사용되었다. 이 데이터는 한쪽 눈 애벌레 물고기의 탈질 된 쪽에서 현저히 적은 유사 분열 세포를 보여줍니다 (p = 0.00033, Welch의 t- 테스트; 그림 3).

그림 2: 5dpf에서의 눈 제거는 시신경 축삭의 퇴행을 유발합니다. (A-D) 7 dpf (A) 또는 9 dpf (C)로 고정 된 손상되지 않은 유충에서 야생형 뇌의 등쪽 전망을 보여주는 대표적인 최대 강도 투영 또는 5 dpf, 고정 2 dps (B) 또는 4 dps (D)에서 눈 멸종 수술로 인한 한쪽 눈의 유충. 모든 핵은 DAPI (녹색)로 염색되고, 시신경 텍텀의 뉴로필에서 종결되는 시신경 축삭은 atoh7:RFP 전이유전자(마젠타)에 의해 표지된다. 별표는 오른쪽 눈만 손상되지 않은 유충의 신경질적인 tectal neuropil을 나타냅니다. 화살표는 탈핵된 광학 텍텀으로부터 방출되는 퇴화된 RGC 축삭의 단편의 예를 나타낸다. 화살촉은 전뇌의 누락 된 부분을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : dpf = 수정 후 일; dps = 수술 후 일수; RGC = 망막 신경절 세포; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 광신경구조에서 유사분열 세포의 수는 신경과형성에 따라 증가한다. (A-B) 유사분열 마커 PH3(마젠타)에 대한 항체로 면역염색된 무손상 (A) 또는 원아이드(B) 9 dpf 유충으로부터의 야생형 뇌의 등쪽 뷰를 보여주는 대표적인 최대 강도 돌출부 및 DAPI(녹색)로 역염색된 핵. 별표는 손상되지 않은 오른쪽 눈에서 신경질적인 텍탈 뉴로필을 나타냅니다. (C) 모든 개별 데이터 포인트가 겹쳐진 상자 플롯은 한쪽 눈 (n = 12) 및 두 눈 (n = 8) 9dpf 유충에 대한 차이 비율 (왼쪽 - 오른쪽 / 전체)으로 신경 (왼쪽) 대 탈질 된 (오른쪽) 지각 엽에서 PH3 ⁺ 세포의 비율의 정량을 보여줍니다. Welch의 t-test와 비교한 두 조건의 평균(***, p < 0.0005). 스케일 바 = 50 μm. 약어 : dpf = 수정 후 일; dps = 수술 후 일수; PH3 = 인산화된 히스톤 H3; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일: 그림 3C에 표시된 플롯에 대한 개요 및 지침. 이 파일에는 그림 3C와 같이 누구나 모든 데이터 요소가 겹쳐진 상자 플롯을 재현할 수 있도록 모든 데이터와 코드가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 논문에 설명 된 기술은 제브라 피쉬에서 척추 동물 시각 시스템 개발을 연구하기위한 많은 접근법 중 하나를 보여줍니다. 다른 연구자들은 배아 망막을 해부하고 유전자 발현 분석¹⁹ 를 수행하거나 광학 텍텀³⁰에서 신경 활동을 시각화하는 방법을 발표했습니다. 이 논문은 차등 망막 입력이 광학 텍텀의 세포 행동에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구하기위한 접근법을 제공합니다.

수술 후 성공적인 눈 소멸과 애벌레 생존을 보장하기 위해서는 유충이 건강하고 적절하게 마취되며 1 % 아가로스에 고정되어있는 것이 중요합니다. 포셉과 텅스텐 바늘이 매우 날카 롭고 깨끗한 것도 중요합니다. 유충은 수술 전후에 24 시간을 먹이지 않을 때 가장 잘 생존하며, 항생제가 보충 된 MMR에서 유충을 기르면 치유 과정이 빨라집니다. 중요하게도, MMR의 더 높은 이온 강도 및 특히 칼슘의 더 높은 농도는 치유를 촉진한다¹⁴. 그러나, 더 높은 염분에 더 오래 노출되면 배아 제브라피쉬³¹에 문서화된 것과 유사하게 생존이 감소할 수 있다. 가장 중요한 단계는 면역 염색 된 샘플의 이미지 데이터 분석에 필수적인 성공적인 뇌 해부를 보장하기위한 고정입니다. 4 % 자당 (애정을 가지고 달콤한 수정이라고 함)이 보충 된 갓 만든 4 % PFA를 사용하면 피부 제거 및 뇌 조직 보존의 용이성을 증가시키는 경향이 있습니다. 수술과 마찬가지로 날카 롭고 깨끗한 도구는 뇌를 해부하는 데 필수적입니다.

이 프로토콜의 가장 큰 과제 중 하나는 눈 멸종을 위해 애벌레를 내장하는 것입니다. 각 사람이 애벌레 눈을 자신있게 신속하게 제거 할 수 있도록 자신에게 가장 적합한 방법을 찾는 것이 중요합니다. 유충이 수술 중에 실수로 찔린 경우, 인도적으로 목을 졸라 죽입니다. 또 다른 과제는 전체 마운트 면역염색을 위한 가장 효과적인 항체 농도를 결정하는 것이다. 적절한 항체 농도를 결정할 때, 공개된 문헌을 시작점으로 사용하고, 상이한 조직(특히 더 큰 조직 또는 더 오래된 동물)에 공개된 시약을 사용하여 증가된 농도 및/또는 배양 시간을 필요로 할 수 있으므로 프로토콜을 최적화한다.

이 방법의 주요 한계는 단일 실험이 처음부터 끝까지 걸리는 시간과 주어진 시간에 연구 할 수있는 물고기의 수입니다. 예를 들어, 그림 3에 표시된 모든 데이터는 물고기의 초기 짝짓기에서 최종 데이터 수집 및 분석까지 약 한 달이 걸렸습니다. 이러한 비교적 낮은 처리량 접근법은 시각계(^32,33)에서 신경 활동을 선택적으로 침묵시키는 이종성 유전적 접근법 또는 RGC 축삭 또는 활성(^34,35)이 결여된 돌연변이에 의해 보완될 수 있다.

이 방법의 중요성은 현대 트랜스제닉 어선에 전통적인 배아 학적 기술을 도입하여 동일한 개체 내의 각 지각 엽에서 작동하는 세포 및 유전 적 메커니즘을 직접 비교할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 이 방법은 발달하는 어류 신경계가 그러한 극적인 손상에 어떻게 반응하는지를 연구하기 위해 형광 표지된 미세아교세포^37,38,39 및 성상세포(⁴⁰)를 갖는 아스타낙스 표면 어류³⁶ 및/또는 형질전환 제브라피쉬 유충을 포함하는 다른 실험 시스템에 적용하기에 무르익었다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 작업에 대한 기금은 주로 Reed College에서 KLC에 이르는 창업 기금, Helen Stafford Research Fellowship 기금에서 OLH로, Reed College Science Research Fellowship에서 YK에 지원되었습니다. 이 프로젝트는 Steve Wilson의 실험실에서 Wellcome Trust Studentship (2009-2014)의 지원을 받은 HR과의 협력으로 시작되었습니다. 이 프로젝트에 대한 초기 토론을 위해 Máté Varga, Steve Wilson 및 Wilson 연구소의 다른 구성원들에게 감사 드리며, 특히 KLC에 아가로스에 배아를 장착하고 제브라 피쉬 뇌 해부를 수행하는 방법을 처음으로 가르친 Florencia Cavodeassi와 Kate Edwards에게 감사드립니다. 우리는 또한 Greta Glover와 Jay Ewing에게 텅스텐 바늘 연마 장치를 조립하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.