הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

דגי זברה מפגינים יכולות צמיחה והתחדשות יוצאות דופן לאורך כל החיים. לדוגמה, נישות מיוחדות של תאי גזע שהוקמו במהלך העובריות תומכות בצמיחה מתמשכת של מערכת הראייה כולה, הן בעין והן במוח. צמיחה מתואמת בין הרשתית לבין טקטום אופטי מבטיחה מיפוי רטינוטופי מדויק כאשר נוירונים חדשים מתווספים לעיניים ולמוח. כדי לענות על השאלה אם אקסונים של הרשתית מספקים מידע חיוני לוויסות התנהגויות של גזע טקטלי ותאי אב כגון הישרדות, התפשטות ו/או התמיינות, יש צורך להיות מסוגלים להשוות אונות טקטליות מופנמות ומנוכרות בתוך אותה חיה ובין בעלי חיים.

הסרה כירורגית של עין אחת מדגי זברה זחליים חיים ולאחר מכן תצפית על טקטום אופטי משיגה מטרה זו. הסרטון הנלווה מדגים כיצד להרדים זחלים, לחדד באופן אלקטרוליטי מחטי טונגסטן ולהשתמש בהם כדי להסיר עין אחת. לאחר מכן הוא מראה כיצד לנתח מוחות מזחלי דגי זברה קבועים. לבסוף, הסרטון מספק סקירה כללית של הפרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והדגמה כיצד להרכיב עוברים מוכתמים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך מיקרוסקופיה.

מטרת שיטה זו היא לחקור כיצד קלט רשתית משפיע על הגדילה וההתפתחות של טקטום אופטי, מרכז העיבוד החזותי במוח דגי הזברה. על ידי הסרת עין אחת ולאחר מכן השוואת שני הצדדים של טקטום אופטי, ניתן לצפות ולנרמל שינויים טקטליים בתוך אותה דגימה, מה שמאפשר השוואה בין דגימות מרובות. גישות מולקולריות מודרניות בשילוב עם טכניקה זו יניבו תובנות על המנגנונים העומדים בבסיס הצמיחה וההתפתחות של מערכת הראייה, כמו גם על ניוון והתחדשות אקסונאלית.

מערכות חושיות - חזותיות, שמיעתיות וסומטוסנסוריות - אוספות מידע מאיברים חיצוניים ומעבירות את המידע הזה למערכת העצבים המרכזית, ויוצרות "מפות" של העולם החיצוני על פני המוח האמצעי ^1,2. ראייה היא השיטה החושית הדומיננטית עבור כמעט כל בעלי החוליות, כולל דגים רבים. הרשתית, הרקמה העצבית בעין, אוספת מידע עם מעגל עצבי המורכב בעיקר מפוטורצפטורים, תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית (RGCs), נוירוני ההקרנה של הרשתית. ל-RGCs יש אקסונים ארוכים שמוצאים את דרכם על פני השטח הפנימיים של הרשתית אל ראש עצב הראייה, שם הם מתפתלים ונעים יחד דרך המוח, ובסופו של דבר מסתיימים במרכז העיבוד החזותי במוח האמצע הגבי. מבנה זה נקרא טקטום אופטי בדגים ובבעלי חוליות אחרים שאינם יונקים והוא הומולוגי לקוליקולוס העליון ביונקים³.

טקטום אופטי הוא מבנה רב שכבתי סימטרי דו-צדדי במוח האמצע הגבי. בדגי זברה וברוב הדגים האחרים, כל אונה של טקטום אופטי מקבלת קלט חזותי אך ורק מהעין הקונטרולטרלית, כך שעצב הראייה השמאלי מסתיים באונה הטקטלית הימנית ועצב הראייה הימני מסתיים באונה הטקטלית השמאלית⁴ (איור 1). בדומה למקבילו היונקים, הקוליקולוס המעולה, טקטום אופטי משלב מידע חזותי עם קלטים חושיים אחרים, כולל אודישן וסומטוסנסציה, שליטה בשינויים בקשב החזותי ובתנועות עיניים כגון סקאדות ^1,5,6. עם זאת, שלא כמו הקוליקולוס העליון של היונקים, הטקטום האופטי מייצר ברציפות נוירונים וגליה חדשים מגומחת תאי גזע מיוחדת ליד הקצוות המדיאליים והקאודלים של האונות הטקטליות הנקראות אזור ההתרבות^{הטקטלית 7}. תחזוקה של אבות מתרבים בטקטום האופטי ובאזורים אחרים במערכת העצבים המרכזית תורמת, בין השאר, ליכולת ההתחדשות המדהימה המתועדת בדגי זברה⁸.

עבודות קודמות שבחנו את מוחותיהם של דגים עיוורים או חדי עין גילו כי גודל טקטום אופטי עומד ביחס ישר לכמות העצבנות ברשתית שהוא מקבל ^9,10,11. בדגי מערות בוגרים, שעיניהם מתנוונות באמבריוגנזה מוקדמת, טקטום הראייה קטן באופן ניכר מזה של דגי פני השטח הקרובים, בעלי הראייה הקרובה⁹. ניתן לחסום את ניוון העיניים של דגי המערות על ידי החלפת העדשה האנדוגנית בעדשה של דג פני השטח במהלך העובר. כאשר דגי מערות חדי עין אלה גדלים לבגרות, האונה הטקטלית העצבנית מכילה כ-10% יותר תאים מאשר האונה הטקטלית שאינה מוחננת⁹. באופן דומה, בדגי קטל זחלים שעברו טיפולים כימיים כדי ליצור עיניים בגדלים שונים בתוך אותו אדם, הצד של הטקטום עם יותר עצבנות היה גדול יותר והכיל יותר נוירונים¹⁰. עדויות מניסויים בריסוק עצבי ראייה בדגי זהב בוגרים מצביעות על כך שהתרבות העצבנות מקדמת התפשטות, כאשר התפשטות תאי הכרק פוחתת כאשר העצבנות שובשה¹¹.

כדי לאשר ולהרחיב את המחקרים הקלאסיים האלה, כמה דיווחים עדכניים מספקים נתונים המצביעים על כך שהתפשטות בתגובה להפנמה מווסתת, לפחות בחלקה, על ידי מסלול BDNF-TrkB^12,13. שאלות פתוחות רבות לגבי גדילה והתפתחות של טקטום אופטי נותרו בעינן, כולל כיצד מערכת חושית מתפתחת מתמודדת עם פציעה וניוון אקסון, אילו אותות תאיים ומולקולריים מאפשרים לקלט רשתית לווסת את צמיחת הטקטום האופטי, מתי מנגנונים אלה הופכים לפעילים, והאם התפשטות והתמיינות הקשורות לעירוי העצבנות מאפשרות לרשתית ולרקמת היעד שלה לתאם את קצבי הגדילה ולהבטיח מיפוי רטינוטופי מדויק. בנוסף, ישנן שאלות הרבה יותר גדולות על התפתחות תלוית פעילות שניתן לטפל בהן על ידי חקירת מערכת הראייה של דגי הזברה עם גישות כירורגיות כמו זו המתוארת להלן.

כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם פעילות עצבית, במיוחד מתוך קלט חזותי, משנה את הישרדות התאים ואת התפשטותם, הגישה המתוארת משווה באופן ישיר בין אונות טקטליות עצבוניות ומנוכרות (איור 1) בתוך זחלי דגי זברה בודדים. שיטה זו מאפשרת תיעוד של התנוונות אקסון RGC בטקטום האופטי ואישור לכך שמספר התאים המיטוטיים מתואם עם העצבנות.

איור 1: רישומים של זחלי דגי זברה לפני ואחרי הסרת עיניים חד-צדדית. (A) ציור של 5 זחלי dpf כפי שנצפו תחת מיקרוסקופ מנתח. כל זחל משובץ באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ומכוון לרוחב לפני שמחט טונגסטן עם קצה חד ומחובר משמשת כדי להוציא את העין הפונה כלפי מעלה (עין שמאל בדוגמה זו). (B) ציור הנוף הגבי של זחל 9 dpf כתוצאה מהניתוח המתואר ב-A. רק שלושה אקסוני RGC שעברו מיפוי גבוה מעין ימין נראים מתייבשים ומתחברים לנוירונים באונה הטקטלית השמאלית. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; dps = ימים לאחר הניתוח; RGC = תאי גנגליון רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

השיטות במאמר זה נערכו בהתאם להנחיות ולאישור הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ריד קולג' ויוניברסיטי קולג' בלונדון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על זני דגי זברה ששימשו במחקר זה.

1. הכינו חומרים וכלים

1. הכינו פתרונות.
   1. הפוך את העובר לבינוני (E3¹⁴) על ידי דילול מלאי של פי 60 (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-דיהידרט, ו-20 mM MgCl_{2-הקסהידרט} במים שעברו דה-יוניזציה, אוטוקלאבים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר). הוסיפו 160 מ"ל של 60x E3 עד 10 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
   2. צרו אגרוז נקודת התכה נמוכה של 1% (LMP) ב-E3. ממיסים 1 גרם של אגרוז LMP לתוך 100 מ"ל של E3 על ידי רתיחה במיקרוגל במשך 1-2 דקות בהספק גבוה. Aliquot מותך אגרוז לתוך צינורות microfuge 1.7 מ"ל, ומאוחסנים ב 4 °C (66 °F). מרתיחים באמבטיית מים ומחזיקים בלוק חום של 40 מעלות צלזיוס כאשר הם מוכנים לשימוש להטמעה.
   3. הפוך את תמיסת הצלצולים המהונדסים של מארק (MMR¹⁵) על ידי דילול מלאי של פי 10 (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-dihydrate, 50 mM HEPES, pH מותאם ל-7.5 עם NaOH של 10 M, ולאחר מכן מאוחסן באופן אוטומטי ומאוחסן בטמפרטורת החדר). הוסיפו 10 מ"ל של 10x MMR ל-90 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
2. יוצקים צלחות Sylgard על פי הוראות היצרן, ומאפשרים להם להגדיר ולייבש במשך מספר ימים¹⁶.
3. מחדדים באופן אלקטרוליטי מחטי טונגסטן (פרוטוקול שונה ^מ-17).
   1. ראשית, הכינו תמיסת KOH של 10% (w/v) על ידי הוספת 200 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לצנצנת זכוכית בעלת פה רחב עם מכסה בורג עליון. יש לערבב באיטיות פנימה 20 גרם של כדורי KOH.
      הערה: פתרון קאוסטי זה הוא אקסותרמי מאוד. לבשו כפפות והגנת עיניים, וערבבו את התמיסה במכסה המנוע.
   2. חותכים חוט טונגסטן באורך 2-3 ס"מ ומכניסים אותו למחזיק המחט.
   3. חבר את חוטי הקתודה והאנודה לאספקת החשמל. חברו את מהדק התנינים בקצה חוט הקתודה למהדק נייר מיושר חלקית והכניסו את מהדק הנייר לתמיסת KOH, והצמידו אותו לצד הצנצנת.
   4. לאחר מכן, חבר את קליפ התנין של חוט האנודה לצווארו של מחזיק המחט. הפעילו את החשמל (ל-~20 וולט) וטבלו את חוט הטונגסטן בתמיסת KOH, ומשכו את החוט מהתמיסה בזווית כדי לחדד את החוט באופן אלקטרוליטי לקצה דק.
      הערה: בועות יגיעו מהדק הנייר ככל שהתגובה תתקדם.
   5. בדוק את קצה המחט מתחת למיקרוסקופ הניתוח כדי לוודא שהיא חדה מספיק.
   6. שטפו את המחט במים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר את כל שאריות ה-KOH. הכינו מספר מחטים מראש ושמרו עליהן עד לניתוחי הזחלים ולניתוחים.
4. הכינו שקופיות קאמריות להדמיית דגימות של דגי זברה עם מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף.
   1. השג שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ושרף אפוקסי בשני חלקים (ראה טבלת החומרים). מערבבים את האפוקסי על פי ההוראות שעל האריזה, וצובעים טבעות או מלבנים עבים על שקופיות הזכוכית. אפשרו למגלשות לרפא ולייבש במכסה המנוע למשך 24 שעות לפחות לפני השימוש.

2. איסוף וגידול עוברים

1. זוג דגים זכרים ונקבות בוגרים של הגנוטיפים הרצויים בקופסאות רבייה בשעות אחר הצהריים המאוחרות / בשעות הערב המוקדמות. למחרת בבוקר, לאחר שהם משריצים, אוספים ביציות מופרות חדשות עם מסננת רשת ומעבירים אותן ל-E3 בכלי פטרי 100 מ"מ.
2. הדגירה של העוברים בטמפרטורה של כ-27.5 מעלות צלזיוס עם מחזור חשוך של 14 שעות/10 שעות עד ליום הניתוח. החלף את E3 מדי יום או לפי הצורך.
3. האכילו את הזחלים באמצעות טפטפת מלאה ברוטיפרים שנקטפו פעם ביום, החל מ-5 ימים לאחר ההפריה (dpf) או יום אחד לאחר הניתוח. לאחר שלזחלים יש מספר שעות לאכול, החליפו את ה-E3 כדי להסיר את כל הרוטיפרים ומוצרי הפסולת שנותרו.
   הערה: אין להאכיל זחלים ביום הניתוח.

3. הכינו זחלים לניתוח

1. ביום הניתוח, השתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית רחבה כדי להעביר 10-15 זחלים לצלחת פטרי 35 מ"מ במילוי E3 טרי.
2. מרדימים את הזחלים על ידי הוספת 3-5 טיפות של 0.4% w/v תמיסת טריקאין (0.4 גרם טריקאין מומס ב-210 mM Tris, pH 9; התמיסה הסופית מותאמת ל-pH של 7.4 במידת הצורך¹⁸) למנה לקבלת ריכוז סופי של ~0.0015% w/v Tricaine. חפשו חוסר תגובה למגע כדי לקבוע אם הזחלים מורדמים כראוי. אם הם עדיין מגיבים למגע לאחר ~ 3 דקות, הוסף 2-3 טיפות נוספות של 0.4% w / v תמיסת טריקאין והערכה מחדש.
   הערה: בשלב זה של ההתפתחות, ניתן לעקוב אחר זרימת הדם וקצב הלב בנוסף לתנועתיות תחת מיקרוסקופ הניתוח.
3. שתקו את זחלי דגי הזברה המורדמים על ידי הטבעתם באגרוז LMP 1% המומס ב-E3.
   1. ראשית, הניחו את המכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ עם הפנים כלפי מעלה מתחת למיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, קחו זחל אחד למעלה לתוך פיפטת פסטר צרה מזכוכית עם כמות קטנה בלבד של E3.
   2. לאחר מכן, שאפו ~ 200 μL של נמס, חם (~ 40 מעלות צלזיוס) 1% LMP אגרוז לתוך הפיפטה עם הזחל. לבסוף, התיזו את הזחל והאגרוז על מכסה צלחת פטרי ההפוך.
   3. השתמש במחט טונגסטן עמומה כדי לתמרן במהירות אך בעדינות את הזחל כך שיהיה רוחבי, כאשר עין אחת פונה כלפי מעלה. המתן עד שהאגרוז ישקע (~ 5 דקות).
      הערה: אם האגרוז מתקשה בזמן שהזחל אינו לרוחב, שחררו אותו מהאגרוז (כמתואר בשלב 5) והחזירו אותו למנה עם E3 וטריקאין.

4. הסרת עיניים

1. לאחר שהאגרוז מוגדר, והזחל ממוקם לרוחב, השתמש בקצה של מחט טונגסטן עדינה מאוד, מחודדת אלקטרוליטית, כדי לחדור את העור סביב העין, בעקבות קצה מסלול העין.
2. לאחר מכן, החליקו את קצה המחט (לא את הקצה) מתחת לעין מהצד הטמפורלי-גחוני של העין. השתמש בלחץ מבוקר כדי לשחרר את העין מהשקע.
3. השתמש במלקחיים כירורגיים עדינים מאוד כדי להסיר את העין על ידי צביטה של עצב הראייה ודחיפת העין ממדיאלית לרוחבית. לחלופין, פשוט המשיכו ללחוץ על העין בצורה הגבית והקדמית עם צד המחט, ובסופו של דבר חותכים דרך עצב הראייה ומשחררים את העין.
   הערה: אם רקמות שאינן העין נדקרו בטעות במהלך הניתוח, הרגו במהירות ובאופן אנושי את הזחל על ידי עריפה מהירה.

5. טיפול לאחר הניתוח עד לנקודת הסיום הניסויית

1. לאחר הסרת עיניים מוצלחת, לכסות את האגרוז עם תמיסת MMR.
2. שחררו כל זחל מהאגרוז על ידי הברשה עדינה של מחט טונגסטן סביב ראשם ולאחר מכן סביב גופם תוך ייצוב מכסה צלחת פטרי עם מלקחיים.
3. העבירו את הזחלים בעלי העין האחת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה MMR בתוספת דילול של 1:100 של קוקטייל פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה של העוברים בטמפרטורה של כ-27.5 מעלות צלזיוס עם מחזור חשוך של 14 שעות/10 שעות.
   הערה: תמיסה איזוטונית זו של MMR בתוספת אנטיביוטיקה מסייעת בתחילה לריפוי הזחל ולהישרדותם. כל מנה יכולה להכיל עד 15 זחלים מחלימים.
4. למחרת, החזירו את הזחלים ל-E3. החל משעות אחר הצהריים שלאחר הניתוח, האכילו זחלים (כ-6 dpf ומעלה) באמצעות טפטפת מלאה ברוטיפרים שנקטפו פעם ביום. לאחר שלזחלים היו מספר שעות לאכול, החליפו את ה-E3 כדי להסיר את כל הרוטיפרים ומוצרי הפסולת שנותרו.

6. תיקון זחלים

1. לאחר שהזחלים הגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי לניתוח, הרדימו אותם במינון קטלני של טריקאין (כ-0.4% ריכוז סופי) עד שהלב שלהם ייפסק.
2. פיפטה עד 30 זחלים לכל צינור מיקרופוג 1.5 מ"ל. הסר עודף E3 ולאחר מכן הוסף 0.5-1 מ"ל של תמיסה מקבעת (4% paraformaldehyde (PFA) ו-4% סוכרוז במי מלח עם מאגר פוספט (PBS)) כדי לתקן את הרקמה. דגירה של הזחלים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. שטפו את הזחלים עם PBS למחרת על ידי הסרת המקבע ושטיפת הזחלים 3-4 פעמים עם PBS. אחסנו את הזחלים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים לפני הכריתה.

7. ניתוח זחלים כדי לחשוף מוחות (מותאמים ^מ-15)

1. תלו את הזחלים הקבועים בטיפות PBS על צלחת סילגארד תחת מיקרוסקופ מנתח. אבטחו אותם לרוחב על ידי הצבת שני סיכות טונגסטן (בדרך כלל מחטי טונגסטן ישנות שגודלן פחות מ-2 ס"מ) דרך הנוטוקורד, כאשר סיכה אחת רק אחורית לאזור הפיגמנטי המכסה את אזור אבי העורקים-גונד-מזונפרוס (AGM) וסיכה נוספת בקו אחד בקו אחד עם סוף הרחבת החלמון.
   הערה: מקם את סיכות הטונגסטן בכמה שפחות ניסיונות מכיוון שהרקמה תהפוך לפריכה יותר עם כל נקב.
2. השתמשו במחט טונגסטן חדה מאוד ובמלקחיים חדי מחט כדי לחשוף את המוח על ידי הסרת העיניים, בסדר זה, העיניים, האוזן, הלסת, מערכת העיכול ועור הגולגולת הגבי.
   1. ראשית, הסר את העין בטכניקה הדומה להסרת העין הניתוחית בשלב 4. לאחר מכן, פתחו את ההצמדה של הזחל והפכו אותו לצד הנגדי, כך שהעין השנייה תהיה נגישה ותחזור על הפעולה. לחלופין, תקעו את המחט דרך הלסת לצד השני והסירו את העין מבלי להתיר את הסיכה.
      הערה: ניתן לאסוף עיניים בשלב זה אם רוצים ניתוח של רקמה זו (בדומה ^ל-19).
   2. לאחר מכן, השתמש במחט הטונגסטן כדי לגרד מהצד הטמפורלי לצד הגחוני של האוזן. באותה פעולה/תנועה, הביאו את המחט האחורית ללסת ומשכו בעדינות קדמית עד להסרת האוזן והלסת.
   3. השתמש במלקחיים כדי למשוך את איברי הגחון ואת כל החלמון שנותר החוצה.
   4. לבסוף, בצע חתך רדוד בעור הגולגולת הגבי ליד הצומת בין המוח האחורי לחוט השדרה. הרימו את העור עם המלקחיים ומשכו אותו קדימה וסביב הטלנספלון. אם זה מתגלה כקשה מדי, התחילו בחתך הראשוני בחלק האחורי ומשכו את העור תחילה לרוחב ולאחר מכן בגחון ובחזית, תוך הקפדה רבה שלא לגרד את הקצוות הצדדיים של הטקטום.
      הערה: מכיוון שהמוח האמצעי הוא מושא המחקר, ניתן לחתוך את המוח האחורי; עם זאת, חתך עמוק עלול לגרום לעריפה.
   5. הסר את כל הרקמה שנותרה עם מלקחיים. שחררו את הזחל והעבירו ל-PBS בצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.
      הערה: השאר את הזנב מחובר למוח כדי לקבל נראות טובה יותר בעת ביצוע פרוטוקולים שלמים.

8. התייבשות המוח ואחסון

1. הסר PBS מהמוח והוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% TritonX-100 (PBST). דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הסר את ה- PBST והחלף אותו בפתרון 50:50 מתנול:PBST. דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את המוח עם 100% מתנול (MeOH) פעמיים במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
4. אחסן את המוחות ב-100% MeOH בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפחות לפני ביצוע אימונוהיסטוכימיה או הליכים אחרים שלמים.
   הערה: ניתן לאחסן מוחות ב- MeOH למשך עד שנתיים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

9. אימונוהיסטוכימיה

הערה: פרוטוקולים מבוססים עבור טכניקות שימושיות רבות של Wholemount בדגי זברה ניתן למצוא ב- ZFIN²⁰. כתב היד הזה מספק דוגמאות להשוואה בין זחלים חדי עין וזחלים בעלי שתי עיניים שהיו נגועים בנוגדנים שמזהים את החלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP), המבוטא באקסונים של עצב הראייה בקו Tg[atoh7:RFP] (איור 2), או בהיסטון H3 (PH3) שעבר זרחון, המדגיש תאים מיטוטיים (איור 3). פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לעוברים וזחלים שלמים מסוכם להלן.

1. ראשית, לייבש מחדש את מוחות הזחלים עם סדרה מדורגת של שטיפות MeOH:PBST בטמפרטורת החדר על ידי דגירה של הדגימות בשעה 50:50 MeOH:PBST למשך 5 דקות, ולאחר מכן בשעה 30:70 MeOH:PBST למשך 5 דקות, ולסיים עם 3 שטיפות של PBST.
2. כדי לחלחל למוח, דגירו אותם ב-PBST בתוספת פרוטאינאז K (PK) בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל PK למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש לאחסן אליקוטים של 10 מ"ג/מ"ל PK בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותם לפני השימוש.
3. הסירו את תמיסת ה-PK ושטפו את כל האנזימים שנותרו על ידי שטיפת המוחות ב-PBST 3 פעמים במשך 15 דקות.
4. שחזרו את המוחות החודרים על ידי דגירה שלהם ב-4% PFA למשך 20 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (או טמפרטורת החדר). לאחר מכן, הסר PFA ושטף את כל הקיבוע שנותר על ידי שטיפת המוח 3 פעמים מעל 15 דקות עם PBST.
5. החליפו את שטיפת ה-PBST הסופית במאגר חיסוני (IB) טרי (10% סרום עיזים תקין ו-1% DMSO ב-PBST) והדגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.
6. דילול נוגדנים ראשוניים למאגר IB בריכוז המתאים (למשל, 1:500 ל-RFP ו-1:300 לנוגדני PH3).
7. מוציאים את מאגר ה-IB מהמוח ומחליפים אותו בדילול הנוגדנים העיקרי. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי עם נדנדה עדינה. ודא שהצינורות מונחים בבטחה על צדם.
8. למחרת בבוקר, להסיר את תמיסת הנוגדן העיקרית עם micropipette, לשטוף כמה פעמים PBST, ולאחר מכן לשטוף את המוח ב PBST בטמפרטורת החדר במשך 4 x 30 דקות.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול נוגדנים ראשוני פעם אחת תוך כ-7 ימים אם הם מאוחסנים בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).
9. שטפו את המוחות במאגר IB תוך דילול נוגדנים משניים למאגר IB בריכוז המתאים (למשל, 1:500 עבור אלקסה-פלואור 568 אנטי-ארנב).
10. הסר את מאגר ה- IB והחלף אותו בדילול הנוגדן המשני. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי עם נדנדה עדינה של הצינורות המונחים על צדם.
11. למחרת בבוקר, הסר את תמיסת הנוגדן המשנית, שטפו עם PBST ולאחר מכן שטפו מוחות ב- PBST בטמפרטורת החדר במשך 4 x 30 דקות.
12. כתם נגדי עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) או ToPro3 (1:5,000 ב-PBST ב-4 מעלות צלזיוס בלילה).
13. למחרת בבוקר, העבירו את מוחות הזחלים ל-PBS והמשיכו לשלבי ההרכבה וההדמיה המפורטים להלן.

10. הרכבה והדמיה

1. הקפידו על מגלשה נעולה לתוך המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ עם שומן ואקום.
2. העבירו את הזחלים המוכתמים והמוחצבים לצלחת באר או לשקופית דיכאון כדי לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
3. הר את הזחלים על המגלשה הסגורה בעמודים של 1% אגרוז LMP.
   1. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, שים זחל אחד על המגלשה התאית, והפקיד כמה שפחות PBS. עם אותה פיפטה, לכסות את הזחל עם אגרוז LMP מותך 1% (~ 40 מעלות צלזיוס).
   2. בעזרת מחט טונגסטן קהה או מלקחיים, משכו את האגרוז לתוך עמוד ואז מיקמו את הזחל בצורה סימטרית ככל האפשר, כאשר פני השטח הגביים נראים לעין.
   3. חזור על הליך זה עבור הזחלים הנותרים.
   4. לאחר שהאגרוז התקלקל, מכסים אותו בכמה טיפות של PBS ואז מניחים אותו על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי.
4. יישמו את העדשה האובייקטיבית עם הדגימה, מקד את המיקרוסקופ באמצעות אור משודר, והאיר את הדגימה בלייזרים המתאימים.
   הערה: בדוגמה זו, אורכי גל של 405 ננומטר ו-568 ננומטר שימשו כדי לעורר DAPI ו-RFP, בהתאמה.
5. התאם את כוח הרווח, ההסטה והלייזר על-ידי הזזת פסי המחוון לרמה מתאימה ביחס לאות ולגלאי המשומש. בדוק את ההיסטוגרמות עבור כל ערוץ ולחץ על לחצן מחוון מצב הרוויה מעל התמונה כדי לאמוד את רמת החשיפה, כדי לוודא שאף אחד מהפיקסלים אינו רווי ושיחס האות לרעש גבוה. לדוגמה לפרמטרים אופטימליים של הדמיה קונפוקלית עבור רזולוציה תאית ותת-תאית בתוך דגי זברה, ראו ²¹.
6. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת מישורי z על-ידי שימוש בגלגל הגלילה בעכבר כדי למצוא את החלק העליון והתחתון של הדגימה. לחץ על הגבול העליון והתחתון לרכישת תמונה ולאחר מכן הפעל את לכידת z-stack על-ידי לחיצה על לחצן הפעל כעת .
   הערה: בהתאם לאופן הסימטרי שבו המוח מותקן, עומק ה-z הכולל עבור מוח של דג זברה זחלי 9 dpf יהיה ~150-200 מיקרומטר.
7. לעבד ולצבוע את התמונות תוך מחשבה על נגישות עיוורי צבעים (לדוגמה, השתמש בכחול וכתום או במג'נטה וירוק לתמונות בשני צבעים). הגדר טבלאות בדיקת מידע בתוכנה המשמשת ללכידת התמונות או תוכנות עיבוד התמונה כגון Photoshop מבית Adobe.
8. ב- Photoshop, פוטומיקרוגרפיות גולמיות צבעוניות שנשמרו כפורמט קובץ תמונה מתויג של 8 סיביות (TIFF) על-ידי (i) המרת מצב התמונה ל- RGB ו- (ii) גישה לאפשרות עקומות תחת | התאמות תפריטים ולאחר מכן (iii) החלקת תפוקות האור הצבעוניות המתאימות ל-0 או 255 רמות כדי להשיג את הצבע הרצוי. לדוגמה, כדי להשיג אות ירוק, בחר את הערוץ האדום והחלק את הפלט שלו ל - 0; לאחר מכן, בחר את הערוץ הכחול והחלק את הפלט שלו גם ל - 0 . באופן דומה, כדי להשיג אות מג'נטה, בחר את הערוץ הירוק והחלק את הפלט שלו ל-0; להשאיר את הערוצים האדומים והכחולים כפי שהם.
   הערה: שלבים דומים ניתן לבצע בתוכנית מניפולציית התמונות החינמית של גנו (GIMP).
9. כימת באופן ידני את מספרי התאים המציגים סמן מסוים באמצעות תוסף מונה התאים ב- ImageJ²², הזמין תחת ניתוח בתפריט תוספים. דוגמאות לשימוש ב- ImageJ לספירת תאים ניתן למצוא בערכות לימוד רבות, כולל ²³.
10. יצירת ייצוגים גרפיים של נתונים בתוכנות סטטיסטיות כגון RStudio (ראה נתונים משלימים עבור . קובץ Rmd).

כדי לוודא אם הסרת העיניים הושלמה ולהעריך כיצד הטקטום האופטי משתנה, בוצעו ניתוחים בזן Tg[atoh7:RFP], המסמנת את כל ה-RGCs עם RFP ממוקד ממברנה, וכך גם את כל האקסונים המקרינים מהרשתית ויוצרים את עצב הראייה²⁴. למרות ששימוש בזן זה אינו הכרחי לחלוטין, הוא מאפשר תצפית והדמיה פשוטה של עצב הראייה בנוירופיל טקטום אופטי. גישות אחרות לתיוג עצב הראייה, כגון מעקב אחר אקסון עם צבעי DiI ליפופיליים או DiO^25,26 או תיוג מולטיספקטרלי עם brainbow²⁷, יהיו אפשריות גם הן.

כפי שניתן לראות באיור 2, התנוונות הדרגתית של אקסונים ברשתית בנוירופיל טקטום אופטי נצפתה לאחר הסרת העיניים. במשך יומיים לאחר הניתוח, אקסונים שסומנו על ידי RFP הפגינו סימני היכר של התנוונות וולרית מהירה²⁸ כגון בליבה ופיצול (איור 2A,B). עבודות אחרונות הראו כי מיקרוגליה בולעת יותר חומר מיאלין כאשר נוירונים מושתקים²⁹. בהתאם למיקרוגליה שבלעה פיסות של אקסוני ה-RGC המתנוונים ונודדת הרחק ממקור הניוון, נצפתה פונקטה בהירה המסומנת על-ידי RFP בתוך ומחוץ לנוירופיל הטקטלי (איור 1B, חצים). בארבעה ימים לאחר הניתוח, אקסונים מקוטעים ופסולת אקסונאלית המסומנת על ידי RFP מופחתים במידה ניכרת באחת מהאונה הטקטלית, מה שמעיד על פינוי מהיר יחסית של האקסונים הגוססים והמתנוונים (איור 2C,D).

כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה מלאה ולדמיין את הטקטום האופטי של דגי הזברה הזחליים, המוח נחשף על ידי ניתוח העיניים, הלסת, האוזניים וכובע הגולגולת של העור ורקמות החיבור. באופן אידיאלי, המוח נשאר שלם במהלך ההליך הזה (למשל, איור 2C,D). עם זאת, חלקים של המוח הקדמי, במיוחד נורת חוש הריח, צפויים להינזק או להיות מוסרים לחלוטין כאשר מכסה הגולגולת של העור או הלסת מוסר (איור 2A, ראש החץ). יתר על כן, לפעמים ניתן לפרוס את הקצה הצדדי של הטקטום בעת פירסינג או צביטה של העור כדי למשוך אותו מהמוח (למשל, איור 2A; קרע על האונה הטקטלית הימנית).

אימונוהיסטוכימיה שימשה גם להערכת מספר התאים המיטוטיים באונות העצבוניות והלא מופנמות של הטקטום האופטי על ידי הכתמת מוחות שלמים בנוגדן PH3. נתונים אלה מראים הרבה פחות תאים מיטוטיים בצד המנוכר של דגי זחל חד-עין (p = 0.00033, מבחן ה-t של וולש; איור 3).

איור 2: הסרת עיניים ב-5 dpf גורמת לניוון של אקסונים של עצב הראייה. (א-ד) הקרנות מייצגות בעוצמה מרבית המציגות מראות גב של מוחות מסוג פראי מזחלים שלמים הקבועים ב-7 dpf (A) או 9 dpf (C), או זחלים חד-עין מניתוחי הכחדת עיניים ב-5 dpf, קבועים 2 dps (B) או 4 dps (D). כל הגרעינים מוכתמים ב-DAPI (ירוק), ואקסונים של עצב הראייה המסתיימים בנוירופיל של הטקטום האופטי מסומנים על ידי atoh7:RFP transgene (מג'נטה). כוכבית מצביעה על נוירופיל טקטלי עצבני בזחלים כאשר רק עין ימין שלמה. חיצים מצביעים על דוגמאות של שברים של אקסוני RGC מנוונים הנובעים מהטקטום האופטי המנוון. ראש החץ מציין חלקים חסרים של המוח הקדמי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; dps = ימים לאחר הניתוח; RGC = תאי גנגליון רשתית; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: מספר התאים המיטוטיים בטקטום האופטי גדל עם העצבנות. (A-B) הקרנות מייצגות בעוצמה מרבית המראות תצוגות גביות של מוחות מסוג פראי מתוך זחלים שלמים (A) או חד-עין (B) 9 dpf חיסון עם נוגדנים עבור הסמן המיטוטי PH3 (magenta) וגרעינים נגדיים עם DAPI (ירוק). כוכבית מציינת נוירופיל טקטלי פנימי מעין ימין שלמה. (C) תרשים תיבה עם כל נקודות הנתונים הבודדות בשכבת-על המראה את הכמות של היחס בין תאי PH3⁺ באונה טקטלית מופנמת (שמאלית) לעומת אונה טקטלית מנוכרת (ימין) כיחס הפרש (שמאל-ימין/סה"כ) עבור זחלים חד-עין (n = 12) וזחלים דו-עיניים (n = 8) 9 dpf. אמצעי שני התנאים בהשוואה למבחן t של וולש (***, p < 0.0005). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; dps = ימים לאחר הניתוח; PH3 = היסטון H3 זרחני; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים: חלוקה לרמות והוראות לעלילה המוצגות באיור 3C. קובץ זה מכיל את כל הנתונים והקוד, כך שכל אחד יכול לשחזר את תרשים התיבה כאשר כל נקודות הנתונים מכוסות בשכבת-על, כפי שמוצג באיור 3C. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

הטכניקות המתוארות במאמר זה ממחישות אחת מגישות רבות לחקר התפתחות מערכת הראייה של בעלי חוליות בדגי זברה. חוקרים אחרים פרסמו שיטות לנתח את הרשתית העוברית ולבצע ניתוחי ביטוי גנים¹⁹ או לדמיין פעילות עצבית בטקטום אופטי³⁰. מאמר זה מספק גישה לבחינת האופן שבו קלט רשתית דיפרנציאלי עשוי להשפיע על התנהגויות תאים בטקטום האופטי.

כדי להבטיח הכחדת עיניים מוצלחת והישרדות זחלים לאחר הניתוח, חשוב שהזחלים יהיו בריאים, מורדמים כראוי ומשותקים ב-1% אגרוז. חשוב גם שהמלקחיים ומחטי הטונגסטן יהיו חדים ונקיים מאוד. הזחלים שורדים בצורה הטובה ביותר כאשר הם אינם מוזנים 24 שעות לפני הניתוח או אחריו, וגידול זחלים ב-MMR בתוספת אנטיביוטיקה מאיץ את תהליך הריפוי. חשוב לציין כי העוצמה היונית הגבוהה יותר של MMR ובמיוחד הריכוז הגבוה יותר של סידן מקדם ריפוי¹⁴. עם זאת, חשיפה ארוכה יותר למליחות הגבוהה יותר עלולה להפחית את ההישרדות, בדומה למה שתועד אצל דגי זברה עובריים³¹. שלב קריטי ביותר הוא קיבוע כדי להבטיח ניתוחי מוח מוצלחים, החיוניים לניתוח נתונים של תמונות של דגימות מוכתמות חיסוניות. שימוש ב-4% PFA טריים עם תוספת של 4% סוכרוז (הנקרא בחיבה Sweet fix) נוטה להגביר את הקלות של הסרת העור ושימור רקמות המוח. כמו בניתוחים, כלים חדים ונקיים הם חובה לניתוח מוחות.

אחד האתגרים הגדולים ביותר של פרוטוקול זה הוא הטמעת זחלים להכחדת עיניים. חשוב שכל אדם ימצא את הדרך המתאימה ביותר עבורו, כך שיוכלו להסיר בביטחון ובמהירות את עין הזחל. אם הזחל נדקר בטעות במהלך הניתוח, הרגו אותו באופן אנושי על ידי עריפה. אתגר נוסף הוא קביעת ריכוזי הנוגדנים היעילים ביותר לשמירה חיסונית מלאה. בעת קביעת ריכוזי הנוגדנים המתאימים, השתמש בספרות שפורסמה כנקודת מוצא וייעל את הפרוטוקול שכן שימוש בריאגנטים שפורסמו על רקמות שונות (במיוחד על רקמות גדולות יותר או על בעלי חיים מבוגרים יותר) עשוי לדרוש ריכוזים מוגברים ו /או זמני דגירה.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא הזמן שלוקח לניסוי בודד מתחילתו ועד סופו ומספר הדגים שניתן לחקור בכל זמן נתון. לדוגמה, כל הנתונים המוצגים באיור 3 ארכו כחודש מהזיווג הראשוני של הדגים ועד לאיסוף הנתונים הסופי ולניתוחם. גישה זו של תפוקה נמוכה יחסית יכולה להיות מושלמת על ידי גישות גנטיות הטרולוגיות שמשתיקות באופן סלקטיבי את הפעילות העצבית במערכת הראייה^32,33 או על ידי מוטנטים חסרי אקסונים של RGC או פעילות^34,35.

משמעותה של שיטה זו היא בכך שהיא מביאה טכניקה אמבריולוגית מסורתית שתתבסס על קווי דגים מהונדסים מודרניים, ומאפשרת השוואה ישירה של מנגנונים תאיים וגנטיים הפועלים בכל אחת מהאונות הטקטליות בתוך אותו אדם. יתר על כן, שיטה זו בשלה ליישום במערכות ניסיוניות אחרות, כולל דגי פני השטח של Astyanax ³⁶ ו/או זחלי דגי זברה מהונדסים עם מיקרוגליה ^37,38,39 עם תווית פלואורסצנטית ואסטרוציטים⁴⁰ כדי לחקור כיצד מערכת העצבים המתפתחת של הדגים מגיבה לפציעה כה דרמטית.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

המימון לעבודה זו נתמך בעיקר על ידי קרנות סטארט-אפ ממכללת ריד ל-KLC, קרנות מלגת המחקר של הלן סטאפורד ל-OLH, ומלגת מחקר מדעי של מכללת ריד ל-YK. פרויקט זה החל במעבדתו של סטיב וילסון כשיתוף פעולה עם משאבי אנוש, שנתמך על ידי סטודנטית של Wellcome Trust (2009-2014). אנו מודים למט וארגה, סטיב וילסון וחברים אחרים במעבדת וילסון על הדיונים הראשוניים על הפרויקט הזה, ואנו מודים במיוחד לפלורנסיה קאבודאסי וקייט אדוארדס, שהיו הראשונות שלימדו את KLC כיצד להרכיב עוברים באגרוס ולבצע ניתוחי מוח של דגי זברה. אנו מודים גם לגרטה גלובר ולג'יי יואינג על העזרה בהרכבת המכשיר שלנו להשחזת מחט טונגסטן.