Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Zebrafische weisen ein bemerkenswertes lebenslanges Wachstum und regenerative Fähigkeiten auf. Zum Beispiel unterstützen spezialisierte Stammzellnischen, die während der Embryogenese etabliert wurden, das kontinuierliche Wachstum des gesamten visuellen Systems, sowohl im Auge als auch im Gehirn. Koordiniertes Wachstum zwischen der Netzhaut und dem optischen Tectum gewährleistet eine genaue retinotopische Kartierung, wenn neue Neuronen in den Augen und im Gehirn hinzugefügt werden. Um zu untersuchen, ob retinale Axone entscheidende Informationen für die Regulierung des Verhaltens von tektalen Stamm- und Vorläuferzellen wie Überleben, Proliferation und / oder Differenzierung liefern, ist es notwendig, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren vergleichen zu können.

Die chirurgische Entfernung eines Auges aus lebenden Larvenzebrafischen mit anschließender Beobachtung des optischen Tectums erreicht dieses Ziel. Das begleitende Video zeigt, wie man Larven betäubt, Wolframnadeln elektrolytisch schärft und damit ein Auge entfernt. Als nächstes wird gezeigt, wie man Gehirne aus festsitzenden Zebrafischlarven seziert. Schließlich bietet das Video einen Überblick über das Protokoll für die Immunhistochemie und eine Demonstration, wie gefärbte Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für die Mikroskopie gemountet werden können.

Ziel dieser Methode ist es zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums, des visuellen Verarbeitungszentrums im Zebrafischgehirn, beeinflusst. Durch Entfernen eines Auges und anschließenden Vergleich der beiden Seiten des optischen Tektums können tektale Veränderungen innerhalb derselben Probe beobachtet und normalisiert werden, was einen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Moderne molekulare Ansätze in Kombination mit dieser Technik werden Einblicke in die Mechanismen liefern, die dem Wachstum und der Entwicklung des visuellen Systems sowie der axonalen Degeneration und Regeneration zugrunde liegen.

Sensorische Systeme - visuelle, auditive und somatosensorische - sammeln Informationen von externen Organen und leiten diese Informationen an das zentrale Nervensystem weiter, wodurch "Karten" der äußeren Welt im Mittelhirn erzeugt^{werden 1,2.} Das Sehen ist die dominierende sensorische Modalität für fast alle Wirbeltiere, einschließlich vieler Fische. Die Netzhaut, das Nervengewebe im Auge, sammelt Informationen mit einem neuronalen Schaltkreis, der hauptsächlich aus Photorezeptoren, bipolaren Zellen und retinalen Ganglienzellen (RGCs), den Projektionsneuronen der Netzhaut, besteht. RGCs haben lange Axone, die ihren Weg über die innere Oberfläche der Netzhaut zum Sehnervenkopf finden, wo sie faszikulieren und gemeinsam durch das Gehirn wandern und schließlich im visuellen Verarbeitungszentrum im dorsalen Mittelhirn enden. Diese Struktur wird bei Fischen und anderen Nicht-Säugetierwirbeltieren als optisches Tectum bezeichnet und ist homolog zum Colliculus superior bei Säugetieren³.

Das optische Tectum ist eine bilateral symmetrische Mehrschichtstruktur im dorsalen Mittelhirn. Bei Zebrafischen und den meisten anderen Fischen erhält jeder Lappen des optischen Tektums visuelle^Eingaben ausschließlich vom kontralateralen Auge, so dass der linke Sehnerv im rechten Tektallappen und der rechte Sehnerv im linken Tektallappen 4 endet (Abbildung 1). Wie sein Gegenstück bei Säugetieren, der Colliculus superior, integriert das optische Tectum visuelle Informationen mit anderen sensorischen Eingaben, einschließlich Vorsprechen und Somatosensation, und steuert Verschiebungen der visuellen Aufmerksamkeit und Augenbewegungen wie Sakkaden ^1,5,6. Im Gegensatz zum Colliculus superior des Säugetiers erzeugt das optische Tectum jedoch kontinuierlich neue Neuronen und Glia aus einer spezialisierten Stammzellnische in der Nähe der medialen und kaudalen Ränder der tektalen Lappen, der sogenannten tektalen Proliferationszone⁷. Die Aufrechterhaltung proliferativer Vorläufer im optischen Tectum und anderen Regionen des zentralen Nervensystems trägt zum Teil zu der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit bei, die in Zebrafisch⁸ dokumentiert ist.

Frühere Arbeiten, die das Gehirn von blinden oder einäugigen Fischen untersuchten, ergaben, dass die Größe des optischen Tektums direkt proportional zur Menge der retinalen Innervation ist, die sie erhält ^9,10,11. Bei erwachsenen Höhlenfischen, deren Augen in der frühen Embryogenese degenerieren, ist das optische Tectum merklich kleiner als bei eng verwandten, gesichteten Oberflächenfischen⁹. Die Degeneration der Höhlenfischaugen kann blockiert werden, indem die endogene Linse während der Embryogenese durch eine Linse von einem Oberflächenfisch ersetzt wird. Wenn diese einäugigen Höhlenfische bis ins Erwachsenenalter aufgezogen werden, enthält der innervierte Tektallappen etwa 10% mehr Zellen als der nicht innervierte Tektallappen⁹. In ähnlicher Weise war bei Larvenkillifischen, die mit chemischen Behandlungen inkubiert wurden, um Augen unterschiedlicher Größe innerhalb desselben Individuums zu erzeugen, die Seite des Tektums mit mehr Innervation größer und enthielt mehr Neuronen¹⁰. Beweise aus Experimenten zur Quetschung des Sehnervs an erwachsenen Goldfischen deuten darauf hin, dass die Innervation die Proliferation fördert, wobei die Proliferation der tektalen Zellen abnimmt, wenn die Innervation gestört ist¹¹.

Mehrere neuere Berichte, die diese klassischen Studien bestätigen und erweitern, liefern Daten, die darauf hindeuten, dass die Proliferation als Reaktion auf Innervation zumindest teilweise durch den BDNF-TrkB-Signalweg^12,13 moduliert wird. Es bleiben viele offene Fragen zum Wachstum und zur Entwicklung des optischen Tektums, einschließlich der Frage, wie ein sich entwickelndes sensorisches System mit Verletzungen und Axondegeneration fertig wird, welche zellulären und molekularen Signale es ermöglichen, dass der Netzhauteintrag das Wachstum des optischen Tektums reguliert, wann diese Mechanismen aktiv werden und ob die innervationsbedingte Proliferation und Differenzierung es der Netzhaut und ihrem Zielgewebe ermöglicht, Wachstumsraten zu koordinieren und eine genaue retinotopische Kartierung zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es viel größere Fragen zur aktivitätsabhängigen Entwicklung, die durch die Befragung des visuellen Systems des Zebrafisches mit chirurgischen Ansätzen wie dem unten beschriebenen beantwortet werden können.

Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die neuronale Aktivität, insbesondere durch visuellen Input, das Überleben und die Proliferation von Zellen verändert, vergleicht der beschriebene Ansatz direkt innervierte und denervierte tektale Lappen (Abbildung 1) innerhalb einzelner Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Dokumentation der RGC-Axondegeneration im optischen Tectum und die Bestätigung, dass die Anzahl der mitotischen Zellen mit der Innervation korreliert.

Abbildung 1: Skizzen von Zebrafischlarven vor und nach einseitiger Augenentfernung . (A) Zeichnung von 5 dpf-Larven unter einem Seziermikroskop. Jede Larve ist in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und seitlich ausgerichtet, bevor eine Wolframnadel mit einer scharfen, hakenförmigen Spitze verwendet wird, um das nach oben gerichtete Auge (in diesem Beispiel linkes Auge) herauszuholen. (B) Zeichnung der dorsalen Ansicht einer 9 dpf Larve, die aus der in A dargestellten Operation resultiert. Nur drei hochschematisierte RGC-Axone aus dem rechten Auge sind defaszikulierend und verbinden sich mit Neuronen im linken tektalen Lappen. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; RGC = retinale Ganglienzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Methoden in diesem Papier wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und der Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees des Reed College und des University College London durchgeführt. Weitere Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Zebrafischstämmen finden Sie in der Materialtabelle .

1. Bereiten Sie Materialien und Werkzeuge vor

1. Machen Sie Lösungen.
   1. Machen Sie Embryo-Medium (E3¹⁴), indem Sie einen 60-fachen Stamm verdünnen (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-Dihydrat und 20 mM_{MgCl 2-Hexahydrat} in entionisiertem Wasser, autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert). Fügen Sie 160 ml 60x E3 zu 10 L deionisiertem Wasser hinzu. Bei Raumtemperatur lagern.
   2. Machen Sie 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) in E3. Lösen Sie 1 g LMP-Agarose in 100 ml E3 auf, indem Sie in der Mikrowelle für 1-2 min bei hoher Leistung sieden. Aliquot geschmolzene Agarose in 1,7 ml Mikrofugenröhrchen und lagern bei 4 ° C. Kochen Sie in einem Wasserbad und halten Sie es in einem 40 ° C-Wärmeblock, wenn es zum Einbetten bereit ist.
   3. Stellen Sie Marc's Modified Ringers (MMR¹⁵) isotonische Lösung her, indem Sie einen 10-fachen Stamm verdünnen (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl_2-Dihydrat, 50 mM HEPES, pH-Wert auf 7,5 mit 10 M NaOH eingestellt, dann autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert). Fügen Sie 10 ml 10x MMR zu 90 ml entionisiertem Wasser hinzu.
2. Gießen Sie die Sylgard-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers ein, damit sie mehrere Tage einwirken und trocknen^{können 16}.
3. Wolframnadeln elektrolytisch schärfen (Protokoll modifiziert von ¹⁷).
   1. Bereiten Sie zunächst eine 10% (w/v) KOH-Lösung vor, indem Sie 200 ml deionisiertes Wasser in ein Glas mit breitem Mund und Schraubdeckel geben. Langsam 20 g KOH-Pellets einrühren.
      HINWEIS: Diese ätzende Lösung ist sehr exotherm. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz und rühren Sie die Lösung in der Kapuze um.
   2. Schneiden Sie einen 2-3 cm langen Wolframdraht ab und stecken Sie ihn in den Nadelhalter.
   3. Schließen Sie die Kathoden- und Anodendrähte an die Stromversorgung an. Befestigen Sie die Krokodilklemme am Ende des Kathodendrahtes an einer teilweise begradigten Büroklammer und setzen Sie die Büroklammer in die KOH-Lösung ein und befestigen Sie sie an der Seite des Glases.
   4. Als nächstes befestigen Sie den Krokodilklemme des Anodendrahtes am Hals des Nadelhalters. Schalten Sie die Stromversorgung ein (auf ~ 20 V) und tauchen Sie den Wolframdraht in die KOH-Lösung, wobei Sie den Draht in einem Winkel aus der Lösung ziehen, um den Draht elektrolytisch in eine feine Spitze zu schärfen.
      HINWEIS: Blasen werden aus der Büroklammer kommen, während die Reaktion fortschreitet.
   5. Überprüfen Sie die Nadelspitze unter dem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sie scharf genug ist.
   6. Spülen Sie die Nadel mit entionisiertem Wasser ab, um alle KOH-Rückstände zu entfernen. Machen Sie mehrere Nadeln im Voraus und bewahren Sie sie bis zu den Larvenoperationen und -dissektionen auf.
4. Erstellen Sie gekammerte Objektträger für die Abbildung von Zebrafischproben mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop.
   1. Erhalten Sie Glasmikroskopobjektträger und zweiteiliges Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Mischen Sie das Epoxidharz gemäß den Anweisungen auf der Verpackung und malen Sie dicke Ringe oder Rechtecke auf die Glasobjektträger. Lassen Sie die Objektträger vor Gebrauch mindestens 24 Stunden in der Haube aushärten und trocknen.

2. Embryonenentnahme und -aufzucht

1. Paaren Sie erwachsene männliche und weibliche Fische der gewünschten Genotypen in Zuchtboxen am späten Nachmittag / frühen Abend. Am nächsten Morgen, nachdem sie gelaicht haben, sammeln Sie neu befruchtete Eier mit einem Maschensieb und geben Sie sie in 100 mm Petrischalen auf E3.
2. Inkubieren Sie die Embryonen bei ~27,5 °C mit einem 14 h hellen/10 h dunklen Zyklus bis zum Tag der Operation. Wechseln Sie die E3 täglich oder nach Bedarf.
3. Füttern Sie die Larven einmal täglich mit einer Pipette voller geernteter Rädertiere, beginnend entweder 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) oder einen Tag nach der Operation. Nachdem die Larven mehrere Stunden zu fressen haben, wechseln Sie den E3, um alle verbleibenden Rädertierchen und Abfallprodukte zu entfernen.
   HINWEIS: Füttern Sie keine Larven am Tag der Operation.

3. Bereiten Sie Larven auf die Operation vor

1. Verwenden Sie am Tag der Operation eine breit gebohrte Pasteur-Pipette aus Glas, um 10-15 Larven auf eine 35 mm große Petrischale zu übertragen, die mit frischem E3 gefüllt ist.
2. Betäuben Sie die Larven, indem Sie 3-5 Tropfen 0,4% w/v Tricainlösung (0,4 g Tricain gelöst in 210 mM Tris, pH 9; gegebenenfalls auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt¹⁸) in die Schale geben, um eine Endkonzentration von ~ 0,0015% w/v Tricain zu erhalten. Suchen Sie nach mangelnder Reaktion auf Berührungen, um festzustellen, ob die Larven ausreichend betäubt sind. Wenn sie nach ~ 3 Minuten immer noch auf Berührungen reagieren, fügen Sie 2-3 weitere Tropfen von 0,4% w / v Tricainlösung hinzu und bewerten Sie sie erneut.
   HINWEIS: In diesem Entwicklungsstadium ist es möglich, den Blutfluss und die Herzfrequenz zusätzlich zur Motilität unter dem Seziermikroskop zu überwachen.
3. Immobilisieren Sie die betäubten Zebrafischlarven, indem Sie sie in 1% LMP-Agarose einbetten, die in E3 gelöst ist.
   1. Legen Sie zunächst den Deckel einer 35 mm Petrischale mit dem Gesicht nach oben unter das Seziermikroskop. Als nächstes nehmen Sie eine Larve in eine schmale Pasteur-Pipette aus Glas mit nur einer kleinen Menge E3.
   2. Dann aspirieren ~200 μL geschmolzene, warme (~40 °C) 1% LMP Agarose in die Pipette mit der Larve. Zum Schluss die Larve und Agarose auf den umgedrehten Petrischalendeckel spritzen.
   3. Verwenden Sie eine stumpfe Wolframnadel, um die Larve schnell, aber sanft so zu manövrieren, dass sie seitlich ist, mit einem Auge nach oben. Warten Sie, bis die Agarose aushärtet (~ 5 min).
      HINWEIS: Wenn die Agarose verhärtet, während die Larve nicht lateral ist, befreien Sie sie von der Agarose (wie in Schritt 5 beschrieben) und geben Sie sie mit E3 und Tricain in die Schale zurück.

4. Augenentfernung

1. Sobald die Agarose gesetzt ist und die Larve seitlich positioniert ist, verwenden Sie die Spitze einer sehr feinen, elektrolytisch geschärften Wolframnadel, um die Haut um das Auge herum zu durchbohren und dem Rand der Augenhöhle zu folgen.
2. Als nächstes schieben Sie den Rand der Nadel (nicht die Spitze) unter dem Auge von der zeitlich-ventralen Seite des Auges. Verwenden Sie kontrollierten Druck, um das Auge aus der Augenhöhle zu lösen.
3. Verwenden Sie eine sehr feine chirurgische Pinzette, um das Auge zu entfernen, indem Sie den Sehnerv kneifen und das Auge von medial nach lateral drücken. Alternativ drücken Sie das Auge einfach dorsal und anterior mit der Seite der Nadel, schneiden Sie schließlich durch den Sehnerv und lassen Sie das Auge los.
   HINWEIS: Wenn andere Gewebe als das Auge während der Operation versehentlich gestochen werden, töten Sie die Larve schnell und human durch schnelle Enthauptung.

5. Nachsorge bis zum experimentellen Endpunkt

1. Nach erfolgreicher Augenentfernung die Agarose mit MMR-Lösung abdecken.
2. Befreien Sie jede Larve von der Agarose, indem Sie vorsichtig eine Wolframnadel um ihren Kopf und dann um ihren Körper streichen, während Sie den Petrischalendeckel mit einer Pinzette stabilisieren.
3. Übertragen Sie die einäugigen Larven in eine 35-mm-Petrischale, die MMR enthält, ergänzt mit einer 1:100-Verdünnung eines Penicillin/Streptomycin-Cocktails. Inkubieren Sie die Embryonen bei ~27,5 °C mit einem 14 h hellen/10 h dunklen Zyklus.
   HINWEIS: Diese isotonische Lösung von MMR, die mit Antibiotika ergänzt wird, unterstützt zunächst die Heilung und das Überleben der Larven. Jede Schale kann bis zu 15 sich erholende Larven aufnehmen.
4. Am nächsten Tag kehren Sie die Larven zur E3 zurück. Beginnend am Nachmittag nach der Operation füttern Sie Larven (~ 6 dpf und älter) einmal täglich mit einer Pipette voller geernteter Rädertierchen. Nachdem die Larven mehrere Stunden zu fressen hatten, wechseln Sie den E3, um alle verbleibenden Rädertierchen und Abfallprodukte zu entfernen.

6. Fixieren von Larven

1. Sobald die Larven das gewünschte Entwicklungsstadium für die Analyse erreicht haben, betäuben Sie sie mit einer tödlichen Dosis Tricain (~ 0,4% Endkonzentration), bis ihre Herzen stehen geblieben sind.
2. Pipette bis zu 30 Larven pro 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Entfernen Sie überschüssiges E3 und fügen Sie dann 0,5-1 ml Fixierlösung (4% Paraformaldehyd (PFA) und 4% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) hinzu, um das Gewebe zu fixieren. Inkubieren Sie die Larven über Nacht bei 4 °C.
3. Waschen Sie die Larven am nächsten Tag mit PBS, indem Sie das Fixiermittel entfernen und die Larven 3-4 Mal mit PBS spülen. Lagern Sie die Larven bis zu 7 Tage vor der Dissektion bei 4 ° C.

7. Sezieren von Larven, um Gehirne zu enthüllen (angepasst von ¹⁵)

1. Suspendieren Sie die fixierten Larven in PBS-Tröpfchen auf einer Sylgard-Platte unter einem Seziermikroskop. Sichern Sie sie seitlich, indem Sie zwei Wolframstifte (typischerweise alte Wolframnadeln, die weniger als 2 cm groß sind) durch das Notochord legen, wobei ein Stift direkt nach dem pigmentierten Bereich die Aorta-Gona-Mesonephros-Region (AGM) bedeckt und ein weiterer in Linie mit dem Ende der Dotterverlängerung.
   HINWEIS: Positionieren Sie die Wolframstifte in so wenigen Versuchen wie möglich, da das Gewebe mit jeder Punktion brüchiger wird.
2. Verwenden Sie eine sehr scharfe Wolframnadel und eine nadelscharfe Pinzette, um das Gehirn freizulegen, indem Sie in dieser Reihenfolge die Augen, das Ohr, den Kiefer, den Verdauungstrakt und die dorsale Schädelhaut entfernen.
   1. Entfernen Sie zunächst das Auge mit einer Technik, die der chirurgischen Augenentfernung in Schritt 4 ähnelt. Lösen Sie dann die Larve und drehen Sie sie auf die gegenüberliegende Seite, damit das andere Auge zugänglich ist und wiederholen Sie sie. Alternativ stechen Sie die Nadel durch den Kiefer auf die andere Seite und entfernen Sie das Auge, ohne es zu lösen.
      HINWEIS: Augen können an dieser Stelle gesammelt werden, wenn eine Analyse dieses Gewebes gewünscht ist (ähnlich ^{wie bei 19}).
   2. Als nächstes verwenden Sie die Wolframnadel, um von der Schläfen- zur Bauchseite des Ohres zu kratzen. In der gleichen Aktion / Bewegung bringen Sie die Nadel posterior zum Kiefer und ziehen Sie vorsichtig vorne, bis das Ohr und der Kiefer entfernt sind.
   3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchorgane und das verbleibende Eigelb herauszuziehen.
   4. Machen Sie schließlich einen flachen Schnitt in der dorsalen Schädelhaut in der Nähe der Verbindung zwischen Hinterhirn und Rückenmark. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und ziehen Sie sie anterior und um das Telencephalon herum. Wenn sich dies als zu schwierig erweist, beginnen Sie mit dem ersten Schnitt im Hinterhirn und ziehen Sie die Haut zuerst seitlich und dann ventral und anterior, wobei Sie sehr darauf achten, die Seitenränder des Tektums nicht zu zerkratzen.
      HINWEIS: Da das Mittelhirn das Studienobjekt ist, kann das Hinterhirn geschnitten werden; Ein tiefer Schnitt kann jedoch zur Enthauptung führen.
   5. Entfernen Sie das restliche Gewebe mit einer Pinzette. Lösen Sie die Larve und übertragen Sie sie in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen auf PBS.
      HINWEIS: Lassen Sie den Schwanz am Gehirn befestigt, um die Sichtbarkeit bei der Durchführung von Wholemount-Protokollen zu verbessern.

8. Dehydrierung und Speicherung des Gehirns

1. Entfernen Sie PBS aus dem Gehirn und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, das 0,1% TritonX-100 (PBST) enthält. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Entfernen Sie den PBST und ersetzen Sie ihn durch eine 50:50 Methanol:PBST-Lösung. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Waschen Sie das Gehirn zweimal mit 100% Methanol (MeOH) für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Lagern Sie das Gehirn in 100% MeOH bei -20 °C für mindestens 16 Stunden, bevor Sie Immunhistochemie oder andere Wholemount-Verfahren durchführen.
   HINWEIS: Gehirne können in MeOH für bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden.

9. Immunhistochemie

HINWEIS: Etablierte Protokolle für viele nützliche Wholemount-Techniken in Zebrafischen finden Sie auf ZFIN²⁰. Dieses Manuskript enthält Beispiele für den Vergleich von einäugigen und zweiäugigen Larven, die immungefärbt waren, mit Antikörpern, die entweder das rot fluoreszierende Protein (RFP) erkennen, das in Sehnervaxonen in der Tg [atoh7: RFP] -Linie exprimiert wird (Abbildung 2), oder phosphoryliertes Histon H3 (PH3), das mitotische Zellen hervorhebt (Abbildung 3). Ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll für Embryonen und Larven im ganzen Gebirge ist unten zusammengefasst.

1. Rehydrieren Sie zuerst die Larvengehirne mit einer abgestuften Reihe von MeOH: PBST-Waschungen bei Raumtemperatur, indem Sie die Proben in 50: 50 MeOH: PBST für 5 Minuten inkubieren, dann in 30: 70 MeOH: PBST für 5 min und enden mit 3 Waschungen von PBST.
2. Um das Gehirn zu durchdringen, inkubieren Sie sie in PBST, ergänzt mit Proteinase K (PK) in einer Endkonzentration von 20 μg/ml PK für 30 min bei 37 °C. Aliquots von 10 mg/ml PK bei -20 °C lagern und vor Gebrauch auftauen.
3. Entfernen Sie die PK-Lösung und waschen Sie das verbleibende Enzym weg, indem Sie das Gehirn 3 Mal über 15 Minuten mit PBST spülen.
4. Fixieren Sie die permeabilisierten Gehirne, indem Sie sie in 4% PFA für 20 Minuten bei 25 ° C (oder Raumtemperatur) inkubieren. Entfernen Sie dann PFA und waschen Sie alle verbleibenden Fixiermittel weg, indem Sie das Gehirn 3 Mal über 15 Minuten mit PBST spülen.
5. Ersetzen Sie die letzte PBST-Spülung durch frisch hergestellten Immunblocking-Puffer (IB) (10% normales Ziegenserum und 1% DMSO in PBST) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
6. Verdünnen Sie primäre Antikörper in IB-Puffer in der entsprechenden Konzentration (z. B. 1:500 für RFP und 1:300 für PH3-Antikörper).
7. Entfernen Sie den IB-Puffer aus dem Gehirn und ersetzen Sie ihn durch die primäre Antikörperverdünnung. Über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Schaukeln inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche sicher auf ihren Seiten ruhen.
8. Entfernen Sie am nächsten Morgen die primäre Antikörperlösung mit einer Mikropipette, spülen Sie sie ein paar Mal in PBST ab und waschen Sie dann die Gehirne in PBST bei Raumtemperatur für 4 x 30 min.
   HINWEIS: Primäre Antikörperverdünnungen können einmal innerhalb von ~ 7 Tagen wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 ° C gelagert werden.
9. Spülen Sie das Gehirn in IB-Puffer, während Sie sekundäre Antikörper in der entsprechenden Konzentration in IB-Puffer verdünnen (z. B. 1:500 für Alexa-Fluor 568 Anti-Kaninchen).
10. Entfernen Sie den IB-Puffer und ersetzen Sie ihn durch die sekundäre Antikörperverdünnung. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Schaukeln der auf ihren Seiten ruhenden Röhren.
11. Am nächsten Morgen die sekundäre Antikörperlösung entfernen, mit PBST abspülen und dann das Gehirn in PBST bei Raumtemperatur für 4 x 30 min waschen.
12. Gegen Färbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder ToPro3 (1:5.000 in PBST bei 4 °C über Nacht).
13. Am nächsten Morgen übertragen Sie die Larvengehirne in PBS und fahren Sie mit den unten aufgeführten Montage- und Bildgebungsschritten fort.

10. Montage und Bildgebung

1. Befestigen Sie einen gekammerten Schlitten in den Deckel einer 100 mm Petrischale mit Vakuumfett.
2. Übertragen Sie die immungefärbten und verarbeiteten Larven auf eine Brunnenplatte oder einen Vertiefungsobjektträger, um sie mit einem Seziermikroskop zu betrachten.
3. Montieren Sie die Larven auf dem gekammerten Objektträger in Säulen von 1% LMP-Agarose.
   1. Legen Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas eine Larve auf den Kammerschlitten und legen Sie so wenig PBS wie möglich ab. Mit der gleichen Pipette die Larve mit geschmolzener 1% LMP-Agarose (~40 °C) bedecken.
   2. Ziehen Sie mit einer stumpfen Wolframnadel oder Pinzette die Agarose in eine Säule und positionieren Sie die Larve dann so symmetrisch wie möglich, wobei die dorsale Oberfläche sichtbar ist.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Larven.
   4. Sobald die Agarose geliert ist, bedecken Sie sie mit ein paar Tropfen PBS und legen Sie sie dann auf die Bühne des konfokalen Mikroskops.
4. Richten Sie die Objektivlinse mit der Probe aus, fokussieren Sie das Mikroskop mit Durchlicht und beleuchten Sie die Probe mit den entsprechenden Lasern.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 405 nm und 568 nm Wellenlängen verwendet, um DAPI bzw. RFP anzuregen.
5. Stellen Sie die Verstärkung, den Versatz und die Laserleistung ein, indem Sie die Schieberegler auf ein geeignetes Niveau relativ zum Signal und zum verwendeten Detektor bewegen. Überprüfen Sie die Histogramme für jeden Kanal und klicken Sie auf die Schaltfläche Sättigungsanzeige über dem Bild, um die Belichtungsstärke zu messen, um sicherzustellen, dass keines der Pixel gesättigt ist und das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist. Ein Beispiel für optimale konfokale Bildgebungsparameter für die zelluläre und subzelluläre Auflösung innerhalb von Zebrafischen finden Sie unter ²¹.
6. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen des Stapels von z-Ebenen fest, indem Sie das Scrollrad der Maus verwenden, um die Ober- und Unterseite des Beispiels zu finden. Klicken Sie auf den oberen und unteren Grenzwert für die Bildaufnahme und lösen Sie dann die Z-Stack-Aufnahme aus, indem Sie auf die Schaltfläche Jetzt ausführen klicken.
   HINWEIS: Je nachdem, wie symmetrisch das Gehirn montiert ist, beträgt die Gesamt-Z-Tiefe für ein 9 dpf Larven-Zebrafischgehirn ~ 150-200 μm.
7. Verarbeiten und kolorieren Sie die Bilder unter Berücksichtigung der farbblinden Barrierefreiheit (z. B. verwenden Sie Blau und Orange oder Magenta und Grün für zweifarbige Bilder). Richten Sie Nachschlagetabellen in der Software ein, die zum Erfassen der Bilder verwendet wird, oder in der Bildverarbeitungssoftware wie Photoshop von Adobe.
8. In Photoshop werden Farbrohfotos als 8-Bit-TIFF-Format (Tagged Image File Format) gespeichert, indem (i) der Bildmodus in RGB konvertiert und (ii) auf die Option " Kurven" unter der Bild-| zugegriffen wird Passt Menüs an und verschiebt dann (iii) die entsprechenden farbigen Lichtausgaben auf 0 oder 255 Stufen, um die gewünschte Farbe zu erreichen. Um beispielsweise ein grünes Signal zu erhalten, wählen Sie den roten Kanal aus und schieben Sie seinen Ausgang auf 0. Wählen Sie dann den blauen Kanal aus und schieben Sie seine Ausgabe ebenfalls auf 0. Um ein Magenta-Signal zu erhalten, wählen Sie den grünen Kanal und schieben Sie seinen Ausgang auf 0. Lassen Sie die roten und blauen Kanäle so, wie sie sind.
   HINWEIS: Ähnliche Schritte können im kostenlosen Gnu Image Manipulation Program (GIMP) durchgeführt werden.
9. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen, die eine bestimmte Markierung anzeigen, manuell mit dem Zellenzähler-Plugin in ImageJ²², das im Menü "Plugins" unter " Analysieren" verfügbar ist. Beispiele für die Verwendung von ImageJ für die Zellenzählung finden Sie in vielen Tutorials, einschließlich ²³.
10. Generieren Sie grafische Darstellungen von Daten in Statistiksoftware wie RStudio (siehe ergänzende Daten für . Rmd-Datei).

Um zu bestätigen, ob die Augenentfernung abgeschlossen war und um zu beurteilen, wie sich das optische Tectum verändert, wurden Operationen im Tg[atoh7:RFP]-Stamm durchgeführt, der alle RGCs mit einem membrangerichteten RFP und damit alle Axone markiert, die aus der Netzhaut ragen und den Sehnerv²⁴ bilden. Obwohl die Verwendung dieser Belastung nicht unbedingt erforderlich ist, ermöglicht sie eine einfache Beobachtung und Visualisierung der Sehnerventermini im optischen Tectum neuropil. Auch andere Ansätze zur Markierung des Sehnervs, wie die Axonverfolgung mit lipophilen DiI- oder DiO-Farbstoffen ^25,26 oder die multispektrale Markierung mit brainbow²⁷, wären möglich.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurde eine fortschreitende Degeneration von retinalen Axonen im optischen Tectum Neuropil nach der Entfernung der Augen beobachtet. Zwei Tage nach der Operation zeigten RFP-markierte Axone Merkmale einer schnellen Wallerschen Degeneration²⁸ wie Blebbing und Fragmentierung (Abbildung 2A, B). Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Mikroglia mehr Myelinmaterial verschlingen, wenn Neuronen zum Schweigen gebracht werden²⁹. In Übereinstimmung mit Mikroglia, die Teile der degenerierenden RGC-Axone verschlingen und von der Quelle der Degeneration wegwandern, wurden helle RFP-markierte Puncta innerhalb und außerhalb des tektalen Neuropils festgestellt (Abbildung 1B, Pfeile). Vier Tage nach der Operation werden fragmentierte Axone und RFP-markierte axonale Ablagerungen in beiden tektalen Lappen erheblich reduziert, was auf eine relativ schnelle Clearance der sterbenden und degenerierenden Axone hinweist (Abbildung 2C, D).

Um eine Ganzkörper-Immunhistochemie durchzuführen und das optische Tectum von Larvenzebrafischen zu visualisieren, wurde das Gehirn durch Sezieren des Auges/der Augen, des Kiefers, der Ohren und der Schädeldecke der Haut und des Bindegewebes freigelegt. Idealerweise bleibt das Gehirn während dieses Eingriffs intakt (z.B. Abbildung 2C,D). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass Teile des Vorderhirns, insbesondere der Riechkolben, beschädigt oder vollständig entfernt werden, wenn die Schädeldecke der Haut oder des Kiefers entfernt wird (Abbildung 2A, Pfeilspitze). Darüber hinaus kann manchmal der seitliche Rand des Tektums geschnitten werden, wenn die Haut durchbohrt oder eingeklemmt wird, um sie vom Gehirn zu ziehen (z. B. Abbildung 2A; Riss am rechten tektalen Lappen).

Die Immunhistochemie wurde auch verwendet, um die Anzahl der mitotischen Zellen in innervierten und nicht innervierten Lappen des optischen Tectums zu beurteilen, indem ganze Gehirne mit einem PH3-Antikörper gefärbt wurden. Diese Daten zeigen deutlich weniger mitotische Zellen auf der entnervten Seite von einäugigen Larvenfischen (p = 0,00033, Welchs t-Test; Abbildung 3).

Abbildung 2: Die Augenentfernung bei 5 dpf löst eine Degeneration von Sehnervaxonen aus. (A-D) Repräsentative Projektionen mit maximaler Intensität, die dorsale Ansichten von Wildtyp-Gehirnen aus intakten Larven zeigen, die bei 7 dpf (A) oder 9 dpf (C) fixiert sind, oder einäugige Larven von Augenexstirpationsoperationen bei 5 dpf, fixiert 2 dps (B) oder 4 dps (D). Alle Kerne sind mit DAPI (grün) gefärbt, und die im Neuropil des optischen Tektums endenden Axone des Sehnervs werden durch das atoh7:RFP-Transgen (Magenta) markiert. Das Sternchen zeigt innerviertes tektales Neuropil in Larven an, bei denen nur das rechte Auge intakt ist. Pfeile zeigen Beispiele für Fragmente degenerierter RGC-Axone, die vom denervierten optischen Tektum ausgehen. Pfeilspitze zeigt fehlende Teile des Vorderhirns an. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; RGC = retinale Ganglienzellen; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Die Anzahl der mitotischen Zellen im optischen Tectum nimmt mit der Innervation zu. (A-B) Repräsentative Projektionen mit maximaler Intensität, die dorsale Ansichten von Wildtyp-Gehirnen aus intakten (A) oder einäugigen (B) 9 dpf-Larven zeigen, die mit Antikörpern für den mitotischen Marker PH3 (Magenta) und mit DAPI (grün) gefärbten Kernen immunisiert sind. Das Sternchen weist auf einen innervierten tektalen Neuropil aus dem intakten rechten Auge hin. (C) Box-Diagramm mit allen einzelnen Datenpunkten überlagert, das die Quantifizierung des Verhältnisses von PH3+-Zellen in innervierten (links) versus denervierten (rechts) tektalen Lappen als Differenzverhältnis (links-rechts/total) für einäugige (n = 12) und zweiäugige (n = 8⁾ 9 dpf-Larven zeigt. Mittel der beiden Bedingungen im Vergleich zu Welchs t-Test (***, p < 0,0005). Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; PH3 = phosphoryliertes Histon H3; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei: Gliederung und Anweisungen für das Diagramm in Abbildung 3C. Diese Datei enthält alle Daten und Codes, sodass jeder das Boxplot mit allen überlagerten Datenpunkten reproduzieren kann, wie in Abbildung 3C dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Techniken veranschaulichen einen von vielen Ansätzen zur Untersuchung der visuellen Systementwicklung von Wirbeltieren bei Zebrafischen. Andere Forscher haben Methoden veröffentlicht, um die embryonale Netzhaut zu sezieren und Genexpressionsanalysen^{durchzuführen 19} oder neuronale Aktivität im optischen Tectum³⁰ zu visualisieren. Dieses Papier bietet einen Ansatz, um zu untersuchen, wie differentieller Netzhauteintrag das Zellverhalten im optischen Tektum beeinflussen kann.

Um eine erfolgreiche Augenexstirpation und das Überleben der Larven nach der Operation zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Larven gesund, ausreichend betäubt und in 1% Agarose immobilisiert sind. Es ist auch wichtig, dass Pinzetten und Wolframnadeln sehr scharf und sauber sind. Larven überleben am besten, wenn sie vor oder nach der Operation nicht 24 h gefüttert werden, und die Aufzucht von Larven in MMR, ergänzt durch Antibiotika, beschleunigt den Heilungsprozess. Wichtig ist, dass die höhere Ionenstärke von MMR und insbesondere die höhere Konzentration von Kalzium die Heilung^{fördert 14}. Eine längere Exposition gegenüber dem höheren Salzgehalt kann jedoch das Überleben verringern, ähnlich wie bei embryonalen Zebrafischen³¹. Ein äußerst kritischer Schritt ist die Fixierung, um erfolgreiche Hirndissektionen zu gewährleisten, die für die Datenanalyse von Bildern immungefärbter Proben unerlässlich sind. Die Verwendung von frisch hergestelltem 4% PFA, ergänzt mit 4% Saccharose (liebevoll Sweet Fix genannt), neigt dazu, die Leichtigkeit der Hautentfernung und der Erhaltung des Gehirngewebes zu erhöhen. Wie bei den Operationen sind scharfe und saubere Werkzeuge ein Muss für die Sezierung von Gehirnen.

Eine der größten Herausforderungen dieses Protokolls ist die Einbettung von Larven für Augenausrottungen. Es ist wichtig, dass jede Person den Weg findet, der für sie am besten funktioniert, damit sie das Larvenauge sicher und schnell entfernen kann. Wenn die Larve während der Operation versehentlich erstochen wird, töten Sie sie human durch Enthauptung. Eine weitere Herausforderung besteht darin, die effektivsten Antikörperkonzentrationen für die Immunfärbung im ganzen Mount-Bereich zu bestimmen. Verwenden Sie bei der Bestimmung der geeigneten Antikörperkonzentrationen die veröffentlichte Literatur als Ausgangspunkt und optimieren Sie das Protokoll, da die Verwendung von veröffentlichten Reagenzien auf verschiedenen Geweben (insbesondere auf größeren Geweben oder älteren Tieren) erhöhte Konzentrationen und/oder Inkubationszeiten erfordern kann.

Die Haupteinschränkung dieser Methode ist die Zeit, die ein einzelnes Experiment von Anfang bis Ende in Anspruch nimmt, und die Anzahl der Fische, die zu einem bestimmten Zeitpunkt untersucht werden können. Beispielsweise dauerten alle in Abbildung 3 gezeigten Daten etwa einen Monat von der ersten Paarung der Fische bis zur endgültigen Datenerhebung und -analyse. Dieser relativ niedrige Durchsatzansatz könnte durch heterologe genetische Ansätze ergänzt werden, die entweder selektiv die neuronale Aktivität im visuellen System^{zum Schweigen bringen 32,33} oder durch Mutanten, denen RGC-Axone oder Aktivität ^34,35 fehlen.

Die Bedeutung dieser Methode besteht darin, dass sie eine traditionelle embryologische Technik auf modernen transgenen Fischlinien zum Tragen bringt und einen direkten Vergleich der zellulären und genetischen Mechanismen ermöglicht, die in jedem der tektalen Lappen innerhalb desselben Individuums funktionieren. Darüber hinaus ist diese Methode reif für die Anwendung auf andere experimentelle Systeme, einschließlich Astyanax-Oberflächenfisch ³⁶ und / oder transgener Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten Mikroglia^37,38,39 und Astrozyten⁴⁰, um zu untersuchen^, wie das sich entwickelnde Nervensystem der Fische auf eine so dramatische Verletzung reagiert.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde in erster Linie durch Startkapital vom Reed College an KLC, Helen Stafford Research Fellowship-Mittel an OLH und ein Reed College Science Research Fellowship an YK unterstützt. Dieses Projekt begann im Labor von Steve Wilson als Zusammenarbeit mit HR, die von einer Wellcome Trust Studentship (2009-2014) unterstützt wurde. Wir danken Máté Varga, Steve Wilson und anderen Mitgliedern des Wilson-Labors für die ersten Diskussionen über dieses Projekt, und wir danken insbesondere Florencia Cavodeassi und Kate Edwards, die als erste KLC beigebracht haben, wie man Embryonen in Agarose besteigt und Zebrafisch-Hirndissektionen durchführt. Wir danken auch Greta Glover und Jay Ewing für die Hilfe bei der Montage unseres Wolfram-Nadelschärfgeräts.