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OKN(Optokinetic Nystagmus) 행동 테스트 방법은 설치류의 시력 평가에 사용됩니다. 여기에서는 정상 쥐와 실험용 쥐 모두의 시각 기능에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 위해 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 간단한 방법을 보여줍니다.
안진(OKN)은 시야에서 시각적 자극의 움직임에 의해 시작되는 반사적 안구 운동입니다. OKN과 관련된 머리 추적 움직임은 일반적으로 설치류의 시각 기능을 측정하는 데 사용됩니다. 정상 및 실험용 쥐의 OKN 반응을 기록하기 위해 간단하고 저렴한 장치가 개발되었습니다. 이 설정은 두 개의 태블릿 화면을 사용하여 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어인 OKN Stripes Visualization Web Application을 사용하여 생성된 고대비 흑백 줄무늬로 구성된 OKN 시각적 자극을 표시합니다. 쥐는 쥐의 머리가 OKN 디스플레이 화면을 계속 향하도록 움직임을 제한하는 투명한 플렉시글라스 홀더 안에 넣습니다. 쥐 홀더의 위치를 변경하여 쥐와 디스플레이 화면 사이의 거리를 조정할 수 있습니다. 쥐 사육장 위에 위치한 마이크로 카메라는 쥐의 시각 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 이러한 녹음은 정량적 평가에 사용할 수 있습니다. 명확한 헤드 트래킹의 유무에 따라 서로 다른 공간 주파수에서 OKN 응답을 결정할 수 있습니다. 수집된 데이터는 정상 및 망막 퇴행성 쥐의 시력을 안정적으로 측정할 수 있는 새로운 기술을 보여줍니다.
눈이 지속적인 전체 시야 시각적 움직임에 노출되면 빠르고 부드러운 안구 움직임과 저가속 머리 움직임의 뚜렷한 패턴이 시각적 움직임 방향으로 나타나는데, 이를 광동태 안진(OKN)1,2이라고 합니다. OKN의 신경학적 경로는 망막에서 외측 외상체(lateral geniculate body), 후두엽(occipital lobe), 소뇌 응집체(cerebellar flocculus)로 지나가며 안구 운동 뉴런(ocular motor neuron)에 연결된다3. 이러한 신경 경로를 따라 어느 곳에서나 신경 손상이 발생하면 OKN 반응의 변화로 이어질 수 있습니다. OKN 반응은 인간 환자의 대뇌 대칭, 심인성 실명 및 시력을 평가하는 도구로 사용됩니다 4,5. 시력은 기능적 반응을 정량화하여 평가되며, 이는 신경퇴행성 질환으로 인해 상실된 시력을 회복하는 데 중점을 둔 치료 및 실험의 성공을 결정하는 데 필수적일 수 있습니다 3,6,7. 동물에서 OKN 반응은 시력을 정확하게 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 연구자는 시각 기능에 관한 정량적 및 정성적 데이터를 모두 수집할 수 있습니다. 설치류의 경우 시계 방향과 시계 반대 방향으로 줄무늬의 회전 방향에 따라 왼쪽과 오른쪽 눈의 시력을 독립적으로 측정 할 수 있습니다8. 이 시계 반대 방향 및 시계 방향 움직임은 각 눈을 각각 비측두(N-T) 또는 측두-비강(T-N) 움직임9에 노출시킵니다. T-N 자극은 설치류가 뒤나 옆에서 오는 위험에 더 민감하기 때문에 N-T 자극에 비해 훨씬 더 높은 반응을 보입니다.
이전에는 정상 실험실 쥐와 망막 퇴행성 쥐의 시각 기능을 서로 다른 OKN 테스트 방법 6,10,11,12,13을 사용하여 테스트했습니다. 그러나 시력 점수의 특정 변동은 본 조사에 표시된 데이터를 포함하여 서로 다른 연구 간에 관찰됩니다. 이러한 가변성은 주로 사용된 테스트 설정의 차이에 기인할 수 있습니다. 테스트 경기장의 크기와 사용된 OKN 시각적 자극 유형 6,10의 차이가 주요 요인이 될 수 있습니다. 이러한 실험에 사용된 자극은 가상 실린더(14)의 출현을 위한 사인파 격자, 교체 가능한 회전 실린더(15), 및 4개의 컴퓨터 모니터(10)에 표시되는 고대비(흑백) 스트라이프를 포함한다. 이러한 OKN 테스트 장치 및 방법과 관련된 주요 제한 사항에는 장비의 큰 크기, 테스트 경기장에서 동물의 이동, 테스트 플랫폼에서 동물이 떨어지는 빈번한 발생률 7,11,12 등이 있습니다.
위의 한계를 최소화하기 위해 쥐에서 OKN 테스트를 위한 새로운 장치가 개발되었습니다. 이 장치는 비교적 저렴하고, 효율성이 입증되었으며, 작동이 간편하고, 시각 기능을 평가할 수 있습니다(그림 1). 이 장치는 두 개의 태블릿 화면을 사용하여 서로 다른 공간 주파수에서 OKN 시각적 자극(시각화 소프트웨어)을 표시합니다. 마이크로 카메라는 나중에 데이터를 분석하기 위해 테스트 중 동물의 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 OKN 장치를 만들기 위한 목적으로 이 새로운 설정은 기존 OKN 테스트 장치에 대한 중요한 수정 사항을 간략하게 설명합니다. 여기에 사용된 OKN 자극은 서로 다른 공간 주파수와 서로 다른 회전 방향(왼쪽에서 오른쪽 또는 오른쪽에서 왼쪽)의 흑백 줄무늬로 구성됩니다. OKN 테스트 장치의 주요 구성 요소에는 OKN 자극을 표시하는 데 사용되는 두 개의 터치스크린 태블릿 화면(7.9인치)이 포함됩니다(그림 2). 두 개의 조정 가능한 홀더는 태블릿 화면을 원하는 위치에 고정하는 데 사용됩니다. 홀더는 높이와 각도를 조정할 수 있는 절차 테이블의 가장자리에 단단히 부착되어 있습니다. 쥐는 디스플레이 화면을 향하는 쥐 홀더에 넣습니다. 쥐 홀더는 투명 플라스틱(폴리메틸 메타크릴레이트) 튜브로 만들어졌습니다. 홀더는 받침대와 금속 스탠드에 부착되어 시술 테이블에 안정적으로 배치할 수 있습니다. 홀딩 튜브의 크기는 사용 된 쥐의 크기에 따라 길이가 4-6 인치, 직경이 2.5-3 인치까지 다양합니다. 쥐와 디스플레이 화면 사이의 거리는 쥐 홀더의 위치를 변경하여 조정됩니다. 쥐 홀더는 쥐의 머리가 디스플레이 화면을 향하는 지속적인 노출을 유지하고 테스트 중에 움직임을 줄이는 데 도움이 됩니다. 마이크로 카메라는 헤드 트래킹 응답을 기록하는 데 사용됩니다. 이 새로운 설정의 단점은 화면의 재생 빈도가 다르고 좁은 줄무늬를 사용할 때 착시 발생 가능성이 있다는 것입니다. 그러나 이러한 문제는 컴퓨터 기반 OKN 설정과 관련된 일반적인 문제로 간주될 수 있습니다. 위의 문제 외에도 현재 설정에서 랫드는 최적의 OKN 응답에 영향을 미치는 가상 실린더14 를 사용하여 테스트되지 않습니다. 이 방법의 참신함은 이 방법이 사용되는 기술과 장치에 있습니다. 이 기술은 설치류의 신뢰할 수 있는 시력 측정을 위해 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있습니다.
모든 동물 절차는 지역 당국이 승인하고 University of Southern California(USC)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 실험 지침에 따라 수행되었으며, ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research 및 Scientific Purposes(과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU)를 준수했습니다.
참고: 이 연구에 사용된 쥐는 색소 망막 퇴행성 왕립 외과 대학(RCS) 쥐와 Long Evans(LE) 쥐입니다. 그림 3 은 OKN 테스트 및 분석의 여러 단계를 보여주는 개략도를 보여줍니다.
1. 절차
2. 데이터 분석
OKN 검사는 망막 퇴행성(RD) 왕립 외과 대학(RCS) 쥐와 연령이 일치하는 정상 Long Evans(LE) 쥐를 사용하여 수행되었습니다. LE 쥐(n = 4)는 새로운 설정을 사용하여 정상 쥐의 시력 점수를 결정하기 위한 기준 데이터를 설정하는 데 사용되었습니다. 통계 분석은 Microsoft Excel(평균 ± 표준 편차)을 사용하여 수행되었습니다. LE 쥐는 0.15 c/d에서 0.33 c/d의 공간 주파수에서 강력한 헤드 트래킹을 보여주었습니다. RD 쥐의 시력 측정에 대한 새로운 OKN 장치의 신뢰성과 효과를 평가하기 위해 출생 후(P) 35세와 P100세 사이의 5가지 다른 시점에서 RCS 쥐(n = 9)를 사용하여 테스트를 수행했습니다(그림 4). RCS 쥐는 P50세까지 강력하고 지속적인 헤드 추적 반응을 보였습니다. P50 이후에는 시력이 상당히 떨어졌습니다. P80세 이후, RCS 쥐의 시각 민감도는 급격히 감소했다. P100 이후, RCS 쥐의 시각 기능은 심각하게 손상되었는데, 이는 낮은 공간 주파수에서도 헤드 트래킹 반응이 없는 것에서 명백히 드러난다. 이후 시점에서 테스트했을 때 RCS에서 약한 무작위 헤드 추적 반응만 관찰되었습니다. RCS 쥐에서 관찰된 이러한 시력 상실 패턴은 양쪽 눈에서도 비슷한 방식으로 진행되었습니다. 이 새로운 장치를 사용한 OKN 테스트는 또한 쥐의 시력이 시각적 자극과 쥐의 눈 사이의 거리에 의해 영향을 받을 수 있음을 시사했습니다. LE 쥐를 사용한 파일럿 실험에서 쥐의 머리가 디스플레이 화면에서 약 3.5인치 떨어진 곳에 위치할 때 강력한 OKN 반응이 관찰되었습니다.
그림 1: 새로운 OKN 설정의 다이어그램 스케치 및 대표 이미지. (A) 받침대에 부착된 쥐 홀더와 평평한 표면 위에 놓인 금속 스탠드의 다이어그램 스케치, (B) 6개월 된 쥐에 사용되는 쥐 홀더 및 스탠드의 치수, (C) 새로운 OKN 설정의 이미지. 태블릿 화면은 서로 마주보고 155° 각도로 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 새로운 OKN 테스트 장치. 쥐는 테스트를 위해 투명 플라스틱 튜브 내부에 보관됩니다. (A-C) OKN 자극을 보는 쥐를 보여주는 다양한 각도에서 촬영한 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OKN 테스트 및 분석의 여러 단계를 보여주는 개략도. 새로운 OKN 장치를 사용하여 OKN 테스트 절차 및 데이터 분석의 여러 단계를 설명하는 단계별 지침입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 망막 변성 질환의 여러 단계에서 정상 LE 쥐와 망막 퇴행성(RD) RCS(Royal College of Surgeons) 쥐의 시력(±SD) 측정. 정상적인 LE 쥐는 모든 공간 주파수(0.15 c/d에서 0.33 c/d)에서 줄무늬를 추적할 수 있는 능력을 보여주었습니다. P35에서 P95 사이의 RCS 쥐(n = 9)는 5개의 다른 시점에서 OKN 테스트를 받았습니다. P35에서, 대부분의 쥐는 위의 모든 공간 주파수에서 추적했다. 생후 2개월에서 3개월 사이의 RCS 쥐에서 시력의 급격한 감소가 관찰되었습니다. P100이 된 이후, 어떤 쥐도 강한 머리 추적 행동을 보일 수 없었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OKN은 표류하는 자극에 반응하여 눈의 반사적 톱니 운동으로, 인간 피험자의 시력을 평가하는 도구로 사용됩니다3. 영장류와 설치류를 포함한 동물에서 OKN 테스트는 시각 기능의 정량적 측정으로 사용됩니다. 본 연구는 쥐의 OKN 행동 테스트를 위해 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 새롭고 저렴한 OKN 장치에 대해 설명합니다. 설치류에 대한 OKN 평가는 다양한 접근 방식으로 수행되었습니다. 이전에는 격자 회전을 위해 모터에 부착 된 교체 가능한 OKN 드럼이 사용되었습니다6. 보다 최근에는, 가상 실린더를 생성하도록 프로그래밍된 것을 포함하여 시각적 자극(10)을 표시하기 위해 컴퓨터 화면을 사용하는 OKN 테스트가 사용되었다(14). 다양한 연구자들은 정상 및 망막 퇴행성 동물 모델에서 시각적 기능 변화를 평가하기 위해 상업적으로 이용 가능한 OKN 테스트 장치를 사용했습니다 16,17,18. 동물의 시력은 OKN 자극 7,15,19를 표시하는 4개의 컴퓨터 화면이 장착된 시험실에 동물을 배치한 후 측정합니다. 이전에는 쥐나 쥐를 실험실의 중앙에 있는 플랫폼 위에 놓았습니다. 위에 부착된 마이크로 카메라가 쥐의 움직임을 기록하고 있다. 수집된 데이터는 다양한 응용 프로그램에 대한 헤드 추적 11,14,16 측정을 위해 통계적으로 평가 및 분석됩니다. 헤드 트래킹 움직임을 식별할 수 있는 훈련된 개인은 마스킹된 방식으로 데이터 분석을 수행합니다.
이번 연구는 쥐의 시각 기능을 평가하기 위해 실험실에서 쉽게 구성할 수 있는 새로운 OKN 테스트 장치 사용의 신뢰성을 입증했습니다. 이 장치는 정상 및 망막 퇴행성 쥐의 시력을 평가하는 데 적합한 것으로 입증되었습니다. 이 실험실의 최근 간행물12,20 또한 이 새로운 OKN 방법의 데이터가 신뢰할 수 있고 이전에 확립된 OKN 시스템에서 얻은 데이터와 비슷하다는 것을 보여주었습니다. 이 새로운 OKN 테스트 설정에서 장비 설계의 변경 사항을 제외하고 테스트 절차는 대부분 이전 연구 6,11,12,21에 제공된 설명을 기반으로 했습니다. 필요한 중요한 단계는 쥐를 반 구속기 내부에 배치하고(테스트 중 쥐의 움직임을 최소화하기 위해) 무작위 방식으로 OKN 시각화 소프트웨어를 시작하는 것입니다(줄무늬 회전은 왼쪽에서 오른쪽 또는 오른쪽에서 왼쪽으로 할 수 있음). 스트라이프 너비를 변경하는 것 외에도 이 소프트웨어를 사용하면 검은색과 흰색 줄무늬 간의 대비와 줄무늬의 회전 속도를 변경할 수 있습니다. 이 연구에서는 OKN 시력 점수(줄무늬 너비의 변화에 따라)만 측정했습니다. 이를 위해 쥐는 가장 높은 대비(검은색 대 흰색 줄무늬)를 사용하여 테스트되었습니다. 동물은 최대 대비 수준(305.50cd/m2 대 15.75cd/m2는 371 R Optical Power Meter, Graseby Optronics, Orlando, FL)을 사용하여 측정)에서 테스트되었습니다. 모든 실험은 OKN 자극에서 외부 조명의 영향을 최소화하고 모든 실험에 균일한 테스트 환경을 제공하기 위해 암실에서 수행되었습니다. 테스트 중에 0.08, 0.15, 0.2, 0.24, 0.28, 0.33, 0.38 공간 주파수에서 흑백 줄무늬가 사용되었습니다. 줄무늬의 회전 방향(오른쪽 대 왼쪽 또는 왼쪽 대 오른쪽)은 헤드 트래킹 동작의 잠재적인 습관화를 피하기 위해 무작위 방식으로 시작되었습니다. 쥐는 평가가 이전 테스트의 영향을 받지 않도록 하기 위해 연속적인 시도(약 30분) 사이에 휴식을 취하도록 했습니다. 비디오 분석은 조사자가 머리 추적 반응과 무작위 머리 움직임을 구별할 수 있도록 충분한 교육이 필요합니다.
이전의 대부분의 OKN 기구에서, 쥐들은 (머리를 포함하여) 자유롭게 움직일 수 있는 플랫폼에 놓였다. 이로 인해 시청 거리(눈과 시각 자극 사이의 거리)가 지속적으로 달라질 수 있습니다. 쥐의 시력은 가시거리(22)의 변화에 민감하기 때문에, 시험실 내에서의 자유로운 움직임은 시력 점수의 변화를 야기할 수 있다. 동일한 동물 그룹 내에서 또는 동일한 동물 내에서 다른 테스트 간에 시력 점수의 변동성이 높으면 의미 있는 통계적 추론을 얻는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 테스트 중에 쥐를 반구속 상태로 유지하여 OKN 자극을 향하거나 자극으로부터 멀어지는 움직임을 최소화했습니다. 쥐의 자유로운 움직임을 제한함으로써 시청 거리의 변화를 최소화합니다. 쥐의 머리는 두 점토판의 가장자리가 만나는 모서리를 향하고 있기 때문에 양쪽 눈이 줄무늬에 동일하게 노출됩니다(시야 거리는 대부분 일정하게 유지됨). 전반적으로 이 새로운 설정은 연구자가 일관된 시각적 기능 데이터를 얻을 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 위의 관찰에 대한 강력한 결론을 내리기 위해서는 시청 거리를 변경하고 데이터를 다른 설정과 비교하는 것을 기반으로 한 추가 조사가 필요합니다.
새로운 설정의 신뢰성을 확립하기 위해 정상 LE 쥐와 망막 퇴행성 RCS 쥐를 모두 테스트했습니다. 이 새로운 설정을 사용하여 측정된 시력은 LE 쥐에서 0.33c/d였습니다. RCS 쥐의 경우 망막 변성 질환의 진행에 따라 시력 점수가 변경되었습니다. RCS 쥐에서 광수용체 변성은 망막 색소 상피(RPE) 세포의 기능 장애로 인해 발생하여 망막하 공간에 광수용체 파편이 축적되어 퇴행성 질환을 유발합니다22,23. 이전의 여러 연구24,25에 따르면 RCS 쥐의 질병 진행은 초기에 느리다는 것이 확인되었습니다. 이것은 심각한 광수용체 손상이 보고되는 기간 동안 생후 2개월이 되면 더욱 급격해집니다. 새로운 설정을 검증하기 위해 산후 시점에 RCS에서 시력 검사를 실시했습니다(그림 3). 이 연구에 따르면 RCS 쥐의 시력 상실은 생후 2개월까지 점진적으로 발생합니다. 생후 3개월이 되면 RCS 쥐의 OKN 시력이 심각하게 손상되었으며, 이는 광수용체 손실26,27과 수반됩니다.
본 연구는 정상 및 망막 퇴행성 쥐에서 OKN 기반 시각 활동을 평가하기 위한 새롭고 효율적이며 경제적으로 유리한 설계 및 장치를 보여주었습니다. 쥐의 눈과 시각 자극 사이의 거리는 쥐의 시력을 정확하게 평가하는 데 영향을 미칠 수 있는 필수 변수이기 때문에 이 새로운 장비는 연구 결과의 변동을 최소화할 수 있습니다. 결론적으로, 이 새로운 OKN 장치는 치료적 테스트에 중점을 둔 다양한 연구 응용 분야에서 쥐의 시각 기능을 비교하는 연구자에게 신뢰할 수 있는 스크리닝 기술임이 입증되었습니다.
저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 CIRM(California Institute for Regenerative Medicine) 보조금 (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun), 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕의 실명 방지 연구에서 안과에 대한 무제한 보조금 및 Bright Focus Foundation(M2016186, Thomas, PI)의 지원으로 지원되었습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 안과 연구소(National Eye Institute)의 수상 번호 P30EY029220의 지원을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
iPad Mini | Apple | A1489 | Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software. |
Micro-camera/Micro-Camera Attachment | Lanon | B097H6WWDS | The micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions. |
Plexiglass Tube/Rat Holder | Best Acrylics | B07KMF31MC | The Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab. |
Plexiglass Tube Attachment | Best Acrylics | B07KMF31MC | This attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated. |
Screen Holders | Kabcon | B08JLRPKQ1 | Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat. |
OKN Stripes Visualization Web Application | The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin | https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/ | This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies |
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ISSN 1940-087X
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