ラットの視力を測定するための新しい光運動学的試験法

視運動性眼振(OKN)行動試験法は、げっ歯類の視力の評価に使用されます。ここでは、正常なラットと実験ラットの両方の視覚機能を確実に評価するために、研究室で簡単にセットアップできる簡単な方法が実証されています。

視運動性眼振(OKN)は、視野内の視覚刺激の動きによって開始される反射的な眼球運動です。OKNに関連するヘッドトラッキング運動は、げっ歯類の視覚機能の尺度として一般的に使用されます。正常ラットと実験ラットのOKN応答を記録するために、シンプルで安価な装置が開発されました。このセットアップでは、2つのタブレット画面を使用して、無料で入手できるソフトウェアであるOKN Stripes Visualization Webアプリケーションを使用して生成された高コントラストの黒と白のストライプで構成されるOKN視覚刺激を表示します。ラットは、ラットの頭がOKNディスプレイ画面に絶えず向くように動きを制限する透明なプレキシガラスホルダーの中に置かれます。ラットホルダーの位置を変更して、ラットと表示画面との距離を調整できます。ラットホルダーの上に配置されたマイクロカメラを使用して、ラットの視覚活動を記録します。これらの記録は、定量的評価に使用できます。明確なヘッドトラッキングの有無に基づいて、異なる空間周波数でのOKN応答を決定できます。収集されたデータは、正常および網膜変性ラットの視力を確実に測定するための新しい技術を示しています。

眼が持続的な全視野視覚運動にさらされると、視運動神経眼振(OKN^)1,2と呼ばれる、高速でスムーズな追跡眼球運動と低加速頭運動の明確なパターンが視覚運動の方向に現れます。OKNの神経経路は、網膜から外側膝状体、後頭葉、小脳凝集体に至り、眼の運動ニューロン3に繋が^{っている。}これらの神経経路に沿ったどこかの神経損傷は、OKN応答の変化につながる可能性があります。OKN応答は、ヒト患者の脳対称性、心因性失明、および視力を評価するためのツールとして使用されます^4,5。視力は、機能的反応を定量化することによって評価され、これは、神経^{変性疾患3,6,7}により失われた視力の回復を中心とした治療および実験の成功を決定する上で不可欠であり得る。動物では、OKN応答を使用して視力を正確に評価できるため、研究者は視覚機能に関する定量的および定性的データを収集することができます。げっ歯類では、縞模様の回転方向を時計回りと反時計回り8の両方に基づいて、左右の眼の視力を独立して測定^{することができる。}この反時計回りと時計回りの動きは、各目を鼻側頭(N-T)または側頭鼻(T-N)の動き⁹にそれぞれさらします。T-N刺激は、げっ歯類が背後または側面からの危険に対してより敏感であるため、N-T刺激と比較して有意に高い反応をもたらします。

以前に、正常な実験用ラットと網膜変性ラットの視覚機能は、異なるOKN試験方法を使用して試験されました^{6、10、11、12、13}。ただし、視力スコアの特定の変動は、現在の調査で示されているデータを含め、異なる研究間で観察されます。このばらつきは、主に使用するテスト設定の違いに起因します。テストアリーナのサイズ^{と使用される}OKN視覚刺激の種類の違い^6,10が主な要因になる可能性があります。これらの実験で使用された刺激には、仮想の円筒¹⁴の外観のための正弦波格子14、交換可能な回転円筒¹⁵、および4つのコンピュータモニタ¹⁰に表示される高コントラスト(黒と白)の縞模様が含まれる。これらのOKN試験装置および方法に関連する主な制限には、装置の大型化、試験領域内での動物の動き、および動物が^{試験プラットフォームから}落下する頻繁な発生率が含まれる^7,11,12。

上記の制限を最小限に抑えるために、ラットでのOKN試験のための新しい装置が開発されました。この装置は比較的安価で、効率的で操作が簡単で、視覚機能の評価が可能であることが証明されています(図1)。この装置は、2つのタブレット画面を使用して、OKN視覚刺激(視覚化ソフトウェア)を異なる空間周波数で表示します。マイクロカメラは、後でデータを分析するために、テスト中の動物の活動を記録するために使用されます。研究室で簡単にセットアップできるOKN装置を作ることを目的として、この新しいセットアップでは、既存のOKN試験装置に対する重要な変更の概要を示しています。ここで使用されるOKN刺激は、異なる空間周波数と異なる回転方向(左から右または右から左)の黒と白のストライプで構成されています。OKN試験装置の主要コンポーネントには、OKN刺激を表示するために使用される2つのタッチスクリーンタブレット画面(7.9インチ)が含まれます(図2)。2つの調整可能なホルダーを使用して、タブレットの画面を希望の位置に保持します。ホルダーは、高さと角度を調整できる処置テーブルの端にしっかりと取り付けられています。ラットは、ディスプレイ画面に面したラットホルダーに入れられます。ラットホルダーは透明なプラスチック(ポリメチルメタクリレート)チューブでできています。ホルダーは台座と金属製のスタンドに取り付けられており、施術台上で安定して配置できます。保持チューブのサイズは、使用するラットのサイズに応じて、長さが4〜6インチ、直径が2.5〜3インチです。ラットと表示画面との距離は、ラットホルダーの位置を変えることで調整します。ラットホルダーは、ラットの頭部がディスプレイ画面に向かって連続的に露出するのを維持し、試験中のラットの動きを減らすのに役立ちます。マイクロカメラを使用して、ヘッドトラッキングの応答を記録します。この新しいセットアップの欠点には、画面のリフレッシュレートが異なることや、細いストライプを使用すると目の錯覚が発生する可能性があることが含まれます。ただし、これらはコンピューター ベースの OKN セットアップに関連する一般的な問題と見なすことができます。上記の問題に加えて、現在のセットアップでは、ラットは、最適なOKN応答に影響を与える仮想^{シリンダー14} を使用してテストされていない。この方法の新規性は、この方法が採用される技術および装置にある。この技術は、げっ歯類の信頼性の高い視力測定のために、研究所で簡単にセットアップできます。

すべての動物処置は、地域当局によって承認され、南カリフォルニア大学(USC)の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって受け入れられた実験ガイドラインに準拠して実施され、眼科および視覚研究における動物の使用に関する眼科および眼科研究における動物の使用に関するARVOの声明および科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUに準拠していました。

注: この研究で使用されたラットは、色素性網膜変性王立外科学会 (RCS) ラットとロング エバンス (LE) ラットです。 図3 は、OKNのテストと分析のさまざまな段階を示す概略図を示しています。

1. 手続き

1. セットアップの準備
   1. ラットをケージに入れ、部屋の照明を消した状態で30分間試験室内に保管します。
      注:これにより、輸送中に発生するストレスを最小限に抑え、すべての実験に均一な照明条件を提供します。
   2. タブレットの画面が向かい合う位置を155°に設定して、OKN Stripes Visualization Webアプリケーションを表示します。
   3. ラットホルダーを2つのタブレット画面の中央、中心から4.5インチの位置に置きます。
      注意: この位置では、ラットの頭はディスプレイ画面から約3.5インチ離れています。
   4. タブレットのデスクトップから OKN Stripes Visualization Web Application をクリックすると、最も低い空間周波数から始まる視覚刺激(黒と白のストライプ)が表示されます。
      注:空間周波数0.08、0.15、0.2、0.24、0.28、0.33、0.38サイクル/度(c / d)が使用され、最も低い空間周波数(0.08c / d)から始まり、より高い空間周波数(最大0.38 c / d)に変化します。各空間周波数で、ラットは縞模様の回転(それぞれ1分)で時計回りと反時計回りの両方についてテストされます。
2. OKNテスト手順
   1. 適切なサイズのラットホルダーを選択してください。
   2. ラットをラットホルダーの開口部に持っていき、ラットを慎重に内側に導きます。
   3. テストの前に、ラットがホルダー内に落ち着くのを待ちます(1〜2分)。
      注:適切な取り扱いにより、ほとんどの場合、ラットをホルダー内に維持することが可能です。必要に応じて、ラットホルダーを数秒間高く(テーブルから最大2フィート上)保持します。高さへの恐怖は、ラットがラットホルダーから降りる傾向を減らすことがわかっています。必要に応じて、ラットが落ち着くまで追加の時間(1〜2分)が与えられます。
   4. ラットホルダーの台座を金属製のスタンドに挿入して安定して配置します。
      注意: この設定により、ラットの viewタブレット画面からの距離。
   5. カメラの電源を入れてビデオ録画を開始します。
   6. タブレットのデスクトップ画面から OKN Stripes Visualization Web Application をクリックし、プログラムの実行を開始します。
   7. OKN刺激を左から右または右から左方向に実行します。
      注意: 縞模様を時計回りに回転させると左目がアクティブになり、反時計回りに回転すると右目がアクティブになります。回転の初期方向は、潜在的な慣れを避けるためにランダムに選択されました。
   8. ラットのヘッドトラッキング行動を観察します。
   9. 最も低い空間周波数 (0.08 c/d) を使用してテストを開始し、次に空間周波数を段階的 (昇順) に増やします。
   10. OKN 応答の有無に注意してください。
   11. テストを続行すると、異なる空間周波数間に休息期間は与えられません。
   12. すべての空間周波数が完了したらビデオ録画を停止し、ラット識別番号を使用してデータを保存します。
   13. ラットをホルダーから取り出し、連続したテストの間に約30分間ケージに入れます。
   14. ラットごとにテストを3回繰り返します。

2. データ分析

1. 録画したビデオを確認し、ラットが反応した空間周波数を見つけることにより、各ラットの視力を判断します。
2. すべての回答(明確なヘッドトラッキングの有無)をスプレッドシートに記録します。
3. 3つのテストから、ラットが応答した最も高い空間周波数を見つけます。これが最終的な視力と見なされます。
   注:視力測定は主観的であるため、データは2人の独立した研究担当者によって評価され、各ラット¹²の視力スコアを確認します。最終スコアが合意されるまで、結果はクロスチェックされます。正の OKN 反応は、明確で持続的なヘッドトラッキング活動の存在として定義されます。ランダムなヘッドトラッキング(OKN視覚刺激とは無関係)または頭の動きがないことは、OKNの否定的な反応と見なされます。
4. 統計分析を実施して、グループ間または2つの目(左目と右目)を比較します。
   注意: ビデオ録画を確認して、必要に応じて肯定的または否定的な応答が行われていることを明確にします。

OKN試験は、網膜変性(RD)のRoyal College of Surgeons(RCS)ラットと年齢が一致した正常なLong Evans(LE)ラットを用いて実施されました。LEラット(n = 4)は、新しいセットアップを使用して正常なラットの視力スコアを決定するためのベースラインデータを確立するために使用されました。統計解析は、Microsoft Excel(平均±標準偏差)を用いて行った。LEラットは、0.15 c/dから0.33 c/dの空間周波数で堅牢なヘッドトラッキングを示しました。RDラットの視力測定における新しいOKN装置の信頼性と有効性を評価するために、出生後(P)35歳からP100歳までの5つの異なる時点でRCSラット(n = 9)を使用してテストを実施しました(図4)。RCSラットは、P50歳まで強力で持続的なヘッドトラッキング反応を示しました。P50以降、視力の大幅な低下がありました。P80歳以降、RCSラットの視覚感度は急激に低下しました。P100以降、RCSラットの視覚機能は、低い空間周波数でもヘッドトラッキング応答がないことからも明らかなように、著しく損なわれました。後の時点でテストした場合、RCSでは弱くランダムなヘッドトラッキング応答のみが観察されました。RCSラットで観察されたこの視力低下のパターンは、両眼で同様の方法で進行しました。また、この新しい装置を用いたOKN試験では、ラットの視力は視覚刺激とラットの眼との距離によって影響を受けることが示唆されました。LEラットを用いたパイロット実験では、ラットの頭部をディスプレイ画面から約3.5インチ離して配置すると、堅牢なOKN応答が観察されました。

図1:新しいOKNセットアップの概略図と代表画像 (A)台座に取り付けられたラットホルダーと平面上に置かれた金属製のスタンドの概略スケッチ、(B)生後6か月のラットに使用されるラットホルダーとスタンドの寸法、(C)新しいOKNセットアップの画像。向かい合ったタブレットの画面は、155°の角度で配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:新しいOKN試験装置。ラットは、テストのために透明なプラスチックチューブの内側に保持されます。(A-C)ラットがOKN刺激を見ていることを示す異なる角度から撮影された画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:OKNのテストと分析のさまざまな段階を示す概略図。 新しいOKN装置を使用したOKNテスト手順とデータ分析のさまざまな段階を説明するステップバイステップの説明。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:網膜変性疾患のさまざまな段階にある正常なLEラットと網膜変性(RD)Royal College of Surgeons(RCS)ラットの視力(±SD)測定。 正常なLEラットは、すべての空間周波数(0.15 c/dから0.33 c/d)で縞模様を追跡する能力を示しました。P35からP95(n = 9)の年齢のRCSラットを、5つの異なる時点でOKN試験に供した。P35では、ラットの大部分は上記のすべての空間周波数で追跡されました。2ヶ月齢から3ヶ月齢までのRCSラットでは、視力の急激な低下が認められました。P100の年齢を過ぎると、どのラットも強い頭部追跡行動を示すことができませんでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

OKNは、漂流する刺激に反応して目の鋸歯運動を行うもので、被験者の視力を評価するためのツールとして用いられています³。霊長類やげっ歯類などの動物では、視覚機能の定量的測定としてOKN試験が用いられています。本研究では、ラットのOKN行動試験のために研究室に簡単に設置できる、新しく安価なOKN装置について述べています。げっ歯類のOKN評価は、さまざまなアプローチで行われました。以前は、グレーティングの回転のためにモーターに取り付けられた交換可能なOKNドラムが使用されていました⁶。より最近では、仮想円柱を作成するようにプログラムされたものを含む視覚刺激¹⁰を表示するためにコンピュータ画面を使用したOKNテスト¹⁴が使用された。市販のOKN試験装置は、正常および網膜変性動物モデル16,17,18の視覚機能変化を評価するために、さまざまな研究者によって使用されてきた。動物の視力は、OKN刺激^7,15,19を表示する4つのコンピュータ画面を備えた試験室に動物を置いた後に測定される。以前は、ラットまたはマウスは試験チャンバーの中央にあるプラットフォームの上に置かれていました。その上に取り付けたマイクロカメラがネズミの動きを記録しています。収集されたデータは、さまざまなアプリケーションのためのヘッドトラッキング11,14,16の測定値について統計的に評価および分析されます。ヘッドトラッキングの動きを特定できる訓練を受けた個人が、マスキングされた方法でデータ分析を実行します。

現在の研究では、ラットの視覚機能を評価するために実験室で簡単に構築できる新しいOKN試験装置を使用することの信頼性が実証されました。この装置は、正常および網膜変性ラットの視力を評価するのに適していることが実証されています。この研究室からの最近の出版物^12,20も、この新しいOKNメソッドからのデータが信頼性が高く、以前に確立されたOKNシステムから得られたデータと同等であることを示しました。この新しいOKNテストセットアップでは、機器設計の変更を除けば、テスト手順は主に以前の研究^6,11,12,21で提供された説明に基づいていました。必要な重要なステップは、ラットをセミレストレイン内に配置すること(テスト中のラットの動きを最小限に抑えるため)と、ランダムな方法でOKN視覚化ソフトウェアを開始することです(ストライプの回転は左から右または右から左のいずれかです)。ストライプの幅を変更するだけでなく、ソフトウェアでは黒と白のストライプのコントラストやストライプの回転速度を変更することもできます。この研究では、OKN 視力スコア (ストライプ幅の変化に基づく) のみが測定されました。このために、ラットは最高のコントラスト(黒と白のストライプ)を使用してテストされました。動物は、最大コントラストレベルで試験されました(305.50 cd/m²対15.75 cd/m²、371 R光パワーメータを使用して測定、Graseby Optronics、フロリダ州オーランド)。OKN刺激における外部照明の影響を最小限に抑え、すべての実験に統一された試験環境を提供するために、すべての実験は暗い部屋で行われました。テストでは、0.08、0.15、0.2、0.24、0.28、0.33、0.38の空間周波数の黒と白のストライプを使用しました。ストライプの回転方向(右対左または左対右)は、ヘッドトラッキング行動の潜在的な慣れを避けるために、ランダムに開始されました。ラットは、評価が前のテストの影響を受けないように、連続した試行(約30分)の間に休ませました。ビデオ分析には、研究者がヘッドトラッキング反応とランダムな頭の動きを区別するための十分なトレーニングが必要です。

以前のOKN装置の大部分では、ラットは自由に動くことができるプラットフォーム(頭を含む)に置かれていました。これにより、視距離(目と視覚刺激の間の距離)が絶えず変動する可能性があります。ラットの視力は、視聴距離²²の変動に敏感であるため、試験室内でのその自由な動きは、視力スコアの変動を引き起こし得る。同じ動物群内または同じ動物内で異なる試験間で視力スコアのばらつきが大きいと、意味のある統計的推論を得るのが困難になる可能性があります。これに基づき、本研究では、試験中、ラットを半拘束体に維持し、OKN刺激に向かう動きまたはOKN刺激から離れる動きを最小限に抑えた。ラットの自由な動きを制限することにより、視距離の変動が最小限に抑えられます。ラットの頭は2つの錠剤の端が交わる角に向けられているため、両目は均等に縞模様にさらされます(視距離はほぼ一定のままです)。全体として、この新しいセットアップは、研究者が一貫した視覚機能データを取得する機会を提供する可能性があります。上記の観察結果をしっかりと結論付けるためには、表示距離の変更や他の設定とのデータの比較に基づく追加の調査が必要です。

新しいセットアップの信頼性を確立するために、正常なLEラットと網膜縮退RCSラットの両方をテストしました。この新しいセットアップを使用して測定された視力は、LEラットで0.33 c / dでした。RCSラットでは、網膜変性疾患の進行に基づいて視力スコアが変化しました。RCSラットでは、網膜色素上皮(RPE)細胞の機能不全により視細胞変性が起こり、網膜下空間に視細胞残骸が蓄積し、変性疾患の引き金となる^22,23。いくつかの先行研究^24,25は、RCSラットの疾患の進行が最初は遅いことを立証している。これは、重度の視細胞損傷が報告される生後2か月までにさらに急激になります。新しいセットアップを検証するために、出生後のさまざまな時点でRCSで視力検査を実施しました(図3)。この研究に基づくと、RCSラットの視力の進行性低下は、生後2か月までに発生します。3ヶ月齢までに、RCSラットのOKN視力は著しく損なわれ、これは光受容体の損失^26,27を伴っています。

本研究は、正常および網膜変性ラットにおけるOKNベースの視覚活動を評価するための、新しく、効率的で、経済的に有利な設計と装置を実証した。ラットの目と視覚刺激の間の距離は、ラットの視力の正確な評価に影響を与える可能性のある不可欠な変数であるため、この新しい機器は研究結果の変動を最小限に抑えることができます。結論として、この新しいOKN装置は、研究者が治療試験に焦点を当てたさまざまな研究アプリケーションでラットの視覚機能を比較するための信頼性の高いスクリーニング技術であることが証明されています。

著者には報告すべき利益相反はありません。

この研究は、CIRM (California Institute for Regenerative Medicine) の助成金 (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun)、ニューヨーク州ニューヨークの Research to Prevent Blindness, New York, and Bright Focus Foundation (M2016186, Thomas, PI) の眼科への無制限の助成金によって支援されました。この出版物で報告された研究は、米国国立衛生研究所の国立眼病研究所によって賞番号P30EY029220で支援されました。