계란 껍질없이 부화하여 조류 배아 개발에 미세 플라스틱의 생태 독성 효과

이 논문은 미세 플라스틱과 같은 입자 오염 물질의 독성 연구를 위해 달걀 껍질을 사용하지 않고 부화하는 방법을 소개합니다.

미세 플라스틱은 동물 조직과 장기의 섭취와 전역으로 인해 동물에게 큰 건강 위협을 가하는 신흥 글로벌 오염 물질 유형입니다. 조류 배아의 발달에 미세 플라스틱의 생태 독성 효과는 알려져 있지 않다. 조류 계란은 완전한 발달 및 영양 시스템이며, 전체 배아 발달은 계란 껍질에서 발생합니다. 따라서, 미세 플라스틱과 같은 오염물질의 스트레스하에서 조류 배아 발달의 직접적인 기록은 전통적인 부화에서 불투명한 달걀 껍질에 의해 매우 제한된다. 이 연구에서는, 메추라기 배아 발달에 미세 플라스틱의 효력은 계란 껍질 없이 부화에 의해 시각적으로 감시되었습니다. 주요 단계는 수정란의 세척 및 소독, 노출 전 잠복, 노출 후 단기 배양 및 샘플 추출을 포함합니다. 결과는 대조군과 비교하여, 미세 플라스틱 노출 군의 젖은 중량 및 체길이가 전체 노출된 그룹의 통계적 차이 및 간 비율을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 우리는 인큐베이션에 영향을 미치는 외부 요인을 평가했습니다: 온도, 습도, 계란 회전 각도 및 기타 조건. 이 실험 방법은 미세 플라스틱의 생태 독성학에 대한 귀중한 정보와 태아의 발달에 오염 물질의 부작용을 연구하는 새로운 방법을 제공합니다.

플라스틱 폐기물의 생산은 2015년에 약 6,300Mt였으며, 그 중 10분의 1은 재활용되었으며 나머지는 불에 타거나 지하에 묻혔습니다. 2050년 1년까지 약 12,000Mt의 플라스틱 폐기물이지하에 묻힐 것으로 추정됩니다. 플라스틱 폐기물에 대한 국제사회의 관심으로 톰슨은 2004년^2년에처음으로 미세 플라스틱 개념을 제안했다. 미세 플라스틱(MP)은 입자 직경이 5mm 미만인 작은 입자 플라스틱을 지칭합니다. 현재, 연구자들은 다양한 대륙, 대서양 제도, 내륙 호수, 북극,심해 서식지^3,4,5,6,7의해안선에서 의원의 유비쿼터스 존재를^{감지했다.} 따라서, 더 많은 연구원은 의원의 환경 적 위험을 연구하기 시작했다.

유기체는 환경에서 의원을 섭취 할 수 있습니다. 국회의원은 전 세계 233마리의 해양생물(거북이 100%, 물개 종 36%, 고래 59종, 해조류 59%, 해조류 92종, 무척추동물 6종 포함)^8. 또한, 의원은 유기체의 소화 시스템을 차단하고, 축적하고, 그들의 보비^9에서마이그레이션할 수 있다. 국회의원은 먹이사슬을 통해 전염될 수 있으며, 서식지, 성장 단계, 먹이 주기 습관 및 식량 원천^10의변화와 는 다른 섭취가 있는 것으로 나타났다. 일부 연구자들은 해조^11의배설물에 의원의 존재를보고, 이는 해조가 의원의 캐리어 역할을 한다는 것을 의미한다. 또한, 의원의 섭취는 일부 유기체의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 의원은 위장관에 얽혀, 따라서 고래의 사망률을 증가⁽¹²⁾.

의원만 다른 오염 물질과 유기체에 대 한 공동 독성 효과 뿐만 아니라 유기 체에 독성 효과. 플라스틱 파편의 환경 관련 농도의 섭취는 성인 물고기의 내분비 시스템 기능을 방해 할 수있다^(13. 미세 플라스틱의 크기는^{유기체14,15에}의한 그들의 섭취및 축적에 영향을 미치는 중요한 요인 중 하나입니다. 소형 플라스틱, 특히 나노 크기의 플라스틱은 독성이 높은 세포 및 유기체와^{16,17,18,19의}상호 작용하기 쉽다. 나노 입자 크기의 미세 플라스틱이 현재 연구 수준을 초과하지만, 여러 마이크로미터 미만의 크기의 미세 플라스틱의 검출 및 정량화, 특히 환경의 서브미크론 /나노 플라스틱은 여전히 큰 도전이다. 또한 나노 플라스틱은 배아에도 몇 가지 영향을 미칩니다. 폴리스티렌은 단백질과 유전자^{프로파일(20)을}조절하여 성게 배아의 발달을 손상시킬 수 있다.

의원들이 유기체에 미치는 잠재적 영향을 탐구하기 위해, 우리는 이 연구를 실시했습니다. 조류 배아와 인간 배아 사이의 유사성으로 인해, 그들은 일반적으로 혈관 신생 및 항 혈관 신생, 조직 공학, 생체 재료 임플란트 및 뇌 종양^22,23,24를포함한 발달 생물학 연구^21에 사용됩니다. 조류 배아는 저렴한 비용, 짧은 배양 주기 및 쉬운 작동^25,26의장점을 갖는다. 따라서, 우리는 이 연구 결과에 있는 실험적인 동물로 짧은 성장 주기와 메추라기 태아를 선택했습니다. 동시에, 우리는 계란 껍질없는 부화 기술을 사용하여 배아 발달 단계에서 의원에게 노출 된 메추라기 배아의 형태학적 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 사용된 실험물질은 폴리프로필렌(PP)과 폴리스티렌(PS)이었다. PP와^PS(27)는 전 세계적으로 퇴적물과 수문에서 수반되는 중합체 유형의 가장 큰 비중을 차지하기 때문에, 포획된 해양 유기체에서 추출한 가장 일반적인 폴리머 유형은 에틸렌과^{프로필렌(28)이다.} 이 실험 프로토콜은 의원에게 드러난 메추라기 배아에 대한 의원의 독성 효과의 시각적 평가를 위한 전체 프로세스를 설명합니다. 우리는 쉽게 다른 오염 물질의 독성을 검사하기 위해이 방법을 확장 할 수 있습니다 다른 oviparous 동물의 배아 개발에.

1. 노출 전 준비

1. 노출 테스트를 위해 같은 날 태어난 수정된 메추라기 계란을 선택합니다.
2. 비슷한 무게와 메추라기 계란을 선택합니다. 각 수정된 메추라기 달걀은 약 10-12g입니다.
3. 외부 대변 및 기타 파편에서 수정된 메추라기 알을 모두 완전히 청소하십시오.
4. 미리 부화된 비옥한 메추라기 달걀과 사용할 계란을 살균하여 항생제 용액(페니실린과 연쇄상구, 실온 1:1000) 및 함께 유사한 껍질 모양, 특히 달걀 끝을 선택하십시오. 75%의 에탄올로 인큐베이터를 살균합니다.
5. 치과 훈련의 무딘 끝으로 계란을 열고, 추가 사용을 위해 끝에 달걀 껍질을 떠나. 수정란을 옮기기 전에 계란의 내용물을 부어 넣습니다. 이것은 달걀 껍질의 수분을 유지하는 것입니다. 계란의 개구름은 약 3cm였습니다.
   참고: 메추라기 배아의 손상을 줄이려면 치과 용 드릴을 사용하여 달걀의 무딘 끝을 열고 균열을 가능한 한 부드럽게 만듭니다.
6. 살균 후, 24-48 h에 대한 60 %의 습도와 38 °C 인큐베이터에 수정 된 메추라기 계란을 배치합니다. 메추라기 달걀의 무딘 끝이 향하도록 하십시오.
7. 수정 된 메추라기 계란의 잠복 하는 동안, 살균 냄비에 후속 실험에 필요한 도구를 살균. 이러한 도구에는 플라스틱 랩, 비커, 멸균 물, 파이펫 팁, 수술 직선 가위, 핀셋 및 숟가락이 포함됩니다.
   참고: 고온 살균 문제를 피할 수 있을 만큼 온도 내성이 높은 필름을 사용하십시오.

2. 껍질없이 메추라기 달걀을 부화

1. 사전 부화 된 비옥한 메추라기 알을 인큐베이터에서 깨끗한 벤치로 옮기고 용기에 평평하게 놓아 약 1-2 분 동안 안정화하십시오.
2. 가위(12.5cm 수술 직선 가위)를 사용하여 미리 부화된 비옥한 메추라기 알의 중앙 축에 작은 구멍(직경 3mm)을 찌르고 1-2cm 작은 개구부를 잘라냅니다. 수정된 메추라기 달걀의 달걀 흰자와 노른자를 잘라낸 달걀 껍질로 조심스럽게 옮긴다.
   참고: 가위로 작은 개구부를 절단할 때메라일 달걀노른자를 만지지 마십시오.
3. 세 입자 크기(100, 200, 및 500 nm)를 가진 다른 질량(0.1, 0.2 및 0.3 mg)의 제어 용액(MP 제외)과 노출된 용액을 파이펫으로 계란 내용물에 추가합니다. 동시에 페니실린 1방울과 1mL 주사기로 연쇄절제술 1방울을 추가합니다.
4. 멸균 필름(1.6단계)으로 달걀 껍질의 개구부를 덮습니다.
5. 단계 2.1-2.4에 따르면, 모든 수정 된 메추라기 계란을 치료하십시오.
6. 이송된 메추라기 배아를 필요한 기간 동안 60%의 습도로 38°C 인큐베이터에 넣습니다. 이 실험에서는 ±30°의 계란 회전 각도를 사용합니다. 한 시간에 한 번 계란을 돌립니다.
   참고: 전송은 가능한 한 빨리 해야 하며, 초기 단계에서 더 많은 연습이 필요합니다.

3. 샘플 컬렉션

1. 7일간의 배양 후 노른자에서 육안으로 관찰된 잘 발달된 배아를 제거하고 인산완충액(PBS)으로 세척한다.
2. 세척된 배아 바깥에 흡수성 종이로 잉여 용액을 건조시키고 깨끗한 페트리 접시에 무게를 실어주세요.
3. 가슴 구멍 전체를 열고 간과 심장을 바늘 코 펜치로 분리하고 클리어 후 즉시 1.5 mL 원심 분리 튜브에 놓습니다.
4. 전자 균형에 무게를 빠르게 기록하고 간략한 지수 (HIS = 간 체중 / 체중 x 100)을 계산합니다. 흉골과 몸의 길이를 측정합니다.
5. 위의 지표에 기초하여, 배아 개발에 대한 의원의 영향을 평가합니다.
   참고 : 여기에서 배아 품질은 노른자 제거의 품질을 말합니다.

4. 데이터 분석

1. 평균 ± 표준 오류(SEM)의 형태로 실험 데이터를 보고합니다.
2. 분산의 단일 계수 분석을 사용하여 여러 샘플 그룹의 수단을 비교합니다. 유의한 차이 값은 α = 0.05였습니다.

실험 데이터의 분석을 위해, 우리는 습식 중량, 체길이, 흉골 길이 및 대조군과 6개의 실험군 사이의 간세포지수의 변화를 비교하여 매크로 관점에서 메추라기 배아의 성장과 발달을 측정하고 반영하였다. 우리는 각 단에 있는 6개의 일반적인 메추라기 배아를 검출했습니다. 각 배아는 필요한 햄버거와 해밀턴 (HH) 단계에 도달했다.

도 1에서는,미리 부화한 수정된 메추라기 달걀 내용을 반구체 계란 껍질로 옮기고 인큐베이터에 넣었습니다. 그런 다음 3 일 동안 잠복의 중간 기간에 배아의 발달을 기록했습니다. 도 2에도시된 바와 같이, A-A2는 대조군이고, B-B2는 하나의 치료군이다. 거시적인 배아 발달의 관점에서, 태아는 미세 플라스틱의 부작용 없이 정상적으로 개발되었습니다.

표 1 과 표 2는 1 주일 노출 후 메추라기 배아의 젖은 체중, 신체 길이 및 흉골 길이의 평균 ± SEM이다. 표는 젖은 무게와 몸 길이가 다른 노출 그룹에서 현저하게 변화한다는 것을 보여줍니다. 0.1 mg, 0.3 mg, 100 nm 및 500 nm MP로 치료 된 그룹의 체중과 몸 길이는 약간 감소했습니다. 체중과 몸 길이0.2 mg의 200 nm 마이크로 플라스틱 처리 그룹은 약간 증가했습니다 (P < 0.05).

간증지수(HIS)는 메추라기 배아에서 간 비율을 나타내며, 이는 간 발달 정도를 판단하는 중요한 징후입니다. 더욱이, HSI는 간 세포막 손상 및 염증성 침투의 병인에 있는 중요한 역할을 합니다. 도 3 및 도 4에도시된 바와 같이, 대조군에 비해, 전체 치료군에서 간 의 비율은 미세 플라스틱에 노출된 후 크게 증가하였다. 그러나, 0.2 mg과 0.3 mg의 100 nm 의원 치료 그룹과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다.

그림 1: 껍질없이 메추라기 계란을 부화하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 달걀 껍질없이 부화의 중간 단계에서 6, 7, 8 일에 메추라기의 배아 개발. 녹색 화살표는 눈을 가리킵니다. 파란색 화살표는 팔다리를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 7 일 동안 의원 (nm)에 노출 된 후 메추라기 배아의 간략한 지수. 대조군과 치료군 간의 유의한 차이는 * P < 0.05로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 7 일 동안 의원 (μm)에 노출 한 후 메추라기 배아의 간략적 인지. 대조군과 치료군 간의 유의한 차이는 * P < 0.05로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 7일 동안 의원(nm)에 노출된 후 메추라기 배아의 젖은 체중, 체길이 및 흉골 길이

표 2: 7일 동안 의원(μm)에 노출된 후 메추라기 배아의 젖은 무게, 체길이 및 흉골 길이. 대조군과 비교하여 * P < 0.05를 나타내고, ** P < 0.01을 나타냅니다.

본 논문은 기본 개발 지수를 검출하여 메추라기 배아 발달을 평가하는 효과적인 실험 방식을 제공합니다. 그러나 이 실험에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다.

첫째, 부화의 후반 단계에서 메추라기 배아의 사망률은 껍질이 없는 부화 때문에 더 높다. 실험 과정에서 정상 단백질 비의 파괴와 같은 인위적으로 통제할 수 없는 요인이 있다. 우리는 실험의 정확성을 보장하기 위해 배아의 노출 시간을 제한했습니다. 배아 독성의 연구는 배아 발달의 초기 및 중간 단계에서만 발생할 수 있습니다. 둘째, 메추라기 배아 발달에 대한 의원들의 연구는 기본적인 형태학적 분석 수준에서만 발생합니다. 따라서 결론은 비교적 간단하며 결함이 존재할 수 있습니다. 동시에 실험 조건 및 작동에 대한 요구 사항은 이 실험 과정에서 상대적으로 높습니다. 따라서 몇 가지 주목할 만한 점은 다음과 같이 나열됩니다.

수정된 메추라기 알 표면에 유해한 병원성 미생물로 인해 예비 작업에서 수정된 메추라기 알을 소독하고 살균하는 것이 매우 중요합니다. 소독하는 경우에, 미생물은 잠복기 도중 기름지게 한 메추라기 계란으로 침입할 수 있습니다, 메추라기 태아의 죽음의 결과로. 전송이 성공하더라도 사망률은 더 높을 것입니다. 따라서 실험 사망률을 줄이기 위해 소독 및 살균에서 좋은 작업을 수행해야합니다.

새가 계란을 부화 할 때, 그들은 종종 계란의 위치를 변경하고 계란에 대한 일정한 온도와 태아에 대한 올바른 위치를 유지하기 위해 공기 순환을 유지합니다. 이 실험은 필름을 사용하여 달걀 껍질을 밀봉했습니다. 계란 회전 각도가 너무 크면 달걀 흰자가 흐르게됩니다. 너무 작으면 배아 필름과 달걀 껍질 필름 사이의 접착이 발생하여 죽은 배아가 발생할 수 있습니다. 따라서 실제 상황에 따라 회전 각도를 설정합니다.

메추라기 배아의 전송 도중, 미리 기름지게 한 메추라기 계란은 수평으로 두어 달걀 껍질의 중간에 잘라냅니다. 이런 식으로 달걀 흰자의 작은 부분이 쉽게 흘러 나오며, 이는 두껍고 얇은 달걀 흰자의 정상적인 비율과 분포를 파괴합니다. 이것은 상단에 있었어야 하는 노른자를 한쪽에 기대어 배아가 죽게 합니다. 따라서, 모든 달걀 흰자가 새로운 반구체 계란 껍질로 흘러 들어가게하여 전송 하는 동안 정상적인 비율과 분포를 보장하십시오.

성공적인 전송 후, 실험자는 액체를 직접 떨어뜨리지 않도록 주의해야합니다. 액체는 오염 물질과 항생제의 추가 도중 천천히 흐르도록 달걀 껍질 벽에 의존해야 합니다.

위에서 언급한 4점 이외에 인큐베이션 조건을 엄격하게 제어합니다. 온도, 습도 및 환기의 균형을 조정합니다. 최고의 잠복 환경을 달성하기 위해 잠복 실험실을 조용하고 어둡게 유지하십시오.

결론적으로, 이 실험은 메추라기 배아의 발달에 환경 오염 물질의 효력을 연구하기 위한 기본적인 프로토콜을 제공합니다. 혈관 발달, 산화 스트레스 및 세포 손상을 포함한 배아 성장 및 개발 연구에는 다른 유형의 지표도 있습니다. 상기 실험은 형태학적 측면에서 배아 발달에 대한 단순한 거시적 평가일 뿐이다. 마지막으로, 미래에 향상된 연구 아이디어 및 프로토콜은 배아 성장 및 발달의 독성 연구를 위한 새로운 방법을 제공할 수 있었습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다. 모든 저자는 이 논문의 작품에 영향을 미칠 수 있는 사회적 이익이나 개인적인 관계가 알려져 있지 않다고 선언합니다.

이 작품은 신장 위구르 자치구의 주요 연구 개발 프로젝트 (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3)에서 지원되었습니다.