^15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

¹⁵N 추적기 연구를 위한 마이크로플롯 설계는 여러 계절식물 및 토양 샘플링 이벤트를 수용하기 위해 설명된다. ^15N분석을 위해 연삭 및 계량 프로토콜을 포함한 토양 및 식물 샘플 수집 및 처리 절차가 제시됩니다.

많은 질소 비료 연구는 곡물 수율 또는 누적 N 손실과 같은 시즌 종료 측정에 대한 치료의 전반적인 효과를 평가합니다. 토양 작물 시스템을 통해 비료 유래 N(FDN)의 운명을 따르고 정량화하기 위해서는 안정적인 동위원소 접근법이 필요하다. 이 논문의 목적은 두 번의 재배 시즌 동안 여러 토양 및 식물 샘플링 이벤트에 대한 비밀한 ¹⁵N 농축 마이크로플롯을 활용한 소규모 플롯 연구 설계를 설명하고 총 ^15N분석을 위한 샘플 수집, 처리 및 처리 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 미네소타 중남부에서 옥수수에 심은 복제된 연구를 사용하여입증되었습니다(Zea mays L.). 각 처리는 1끝에 내장된 마이크로플롯(2.4m x 3.8m)으로 6개의 옥수수 행(76cm 행 간격) 15.2m로 구성되었다. 비료 급 우레아는 심기 시 135kg^N∙ha-1로 적용되었으며, 마이크로플롯은 재배 기간 동안 5원자% ^15N토양 및 식물 샘플로 농축된 우레아를 여러 번 수차례 취했으며, 별도의 도구를 사용하여 교차 오염을 최소화하고 모든 시술 중에 풍부하지 않고 농축된 시료를 물리적으로 분리하여 교차 오염을 최소화했습니다. 토양 및 식물 샘플은 건조되어 2mm 화면을 통과한 다음 롤러 항아리 밀을 사용하여 밀가루와 같은 일관성으로 접지했습니다. Tracer 연구는 추가 계획, 샘플 처리 시간 및 수동 노동이 필요하며 기존 N 연구보다 ¹⁵N 농축 재료 및 샘플 분석에 대해 더 높은 비용이 발생합니다. 그러나, 질량 균형 접근 방식을 사용하여, 여러 시즌 샘플링 이벤트를 가진 추적자 연구는 연구원이 토양 작물 시스템을 통해 FDN 분포를 추정하고 시스템에서 FDN에 대한 회계되지 않은 추정을 할 수 있습니다.

비료 질소 (N) 사용은 증가하는 글로벌 인구의 식품, 섬유, 사료 및 연료 요구를 충족하기 위해 농업에 필수적이지만 농업 분야의 N 손실은 환경 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. N은 토양 작물 시스템에서 많은 변화를 겪고 있기 때문에 N 사이클링, 작물 활용 및 비료 N의 전반적인 운명에 대한 더 나은 이해가 N 사용 효율성을 촉진하고 환경 손실을 최소화하는 관리 관행을 개선하는 데 필요합니다. 전통적인 N 비료 연구는 주로 작물 수확량, N 속도에 비해 작물 N 섭취량(명백한 비료 사용 효율) 및 잔류 토양 N과 같은 시즌 종료 측정에 대한 치료의 효과에 중점을 둡니다. 이러한 연구는 전체 시스템 N 입력, 출력 및 효율성을 정량화하지만 비료 소스 또는 토양에서 파생된 토양 작물 시스템에서 N을 식별하거나 정량화할 수 없습니다. 안정적인 동위원소를 사용하는 다른 접근법은 토양 작물 시스템에서 비료 유래 N(FDN)의 운명을 추적하고 정량화하는 데 사용되어야 한다.

질소는 2개의 안정동위원소, ¹⁴N 및 ¹⁵N을 가지고 있으며, 이는 자연에서 비교적 일정한 비율로 발생하며 ¹⁴N/15 N¹⁵1(0.366 원자% ¹⁵N 또는 3600 ppm ¹⁵N^{1 2,,3)에}대해 비교적 일정한 비율로 발생합니다. ^15N농축 비료를 첨가하여 토양 시스템의 총 ^15N함량을 증가시킨다. ¹⁵N 농축 비료가 농축되지 않은 토양 N과 혼합됨에 ^{따라, 14}N/¹⁵N 비의 측정된 변화는 연구원이 토양 프로파일과 작물^3,,4로FDN을 추적할 수 있게 한다. 질량 저울은 시스템의 ^{총 15N}트레이서 양과 각 부품^2를측정하여 계산할 수 있다. ^15N농축 비료는 기존 비료보다 훨씬 비싸기 때문에 ^15N농축 마이크로플롯이 치료 플롯 내에 내장되어 있는 경우가 많습니다. 이 방법의 목적은 옥수수(Zea mays L.)에 대한 여러 계절 토양 및 식물 샘플링 이벤트에 대한 마이크로 플롯을 활용하는 작은 플롯 연구 설계를 설명하고 총 ¹⁵N 분석을위한 식물 및 토양 샘플을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이러한 결과는 N 비료 사용 효율을 추정하고 벌크 토양 및 작물에서 FDN에 대한 부분 N 예산을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 필드 사이트 설명

참고: ^15N추적자 필드 시험을 수행할 때 선택한 사이트는 토양, 지형 및 물리적 특징^5로인한 변동을 최소화해야 합니다. 교차 오염은 경사, 바람 또는 물 전좌, 또는 틸지로 인한 측면 토양 이동에 따라 발생할 수 있으며, N 토양의 수직 분포는 지하 수분 흐름 및 타일 배수^6에의해 영향을 받을 수 있다.

1. 과거 관리(예: 이전 작물 및 경도), 위도 및 경도, 토양 물리적 및 화학적 특성(예: 토양 텍스처 분석, 초기 불임 조건, pH 및 토양 벌크 밀도)을 포함한 실험 현장 부위를 설명합니다.
2. 연구 사이트와 필드 코너에 대한 GPS 좌표를 기록합니다.
3. 해충 및 질병 관리(제초제, 살충제 또는 살균제 사용), 토양 불임 관리(비율, 출처, 배치 및 적용 타이밍 포함), 경유, 관개 이벤트 및 양 및 잔류물 관리를 포함한 성장하는 계절 관리를 설명합니다.
4. 작물 성장과 미생물 매개 N 변환은 토양 수분, 토양 온도 및 공기 온도의 영향을 받아 토양 샘플링 깊이를 반영하는 여러 깊이에서 매일 높고 낮은 온도, 일일 강수량 및 토양 수분 및 온도를 포함한 기후 정보를 기록합니다.

2. 플롯 디자인

1. 76cm 간격에 6개의 옥수수 행(~86,000식물 ha^-1)을심고 최종 플롯 치수는 15.2mx 4.6m입니다.
   1. 표본오차는 1.5m(0-1.5m, 13.7~15.2m) 및 추가 국경면적 1.5m(9.8~11.3m)를 표본오차 와 수확지역(그림1)의각 끝에서 설정한다.
   2. 2행과 3행을 제철 식물 및 토양 샘플링 영역(1.5-9.8m)으로 지정하고 4열과 5열을 옥수수 곡물 수율에 대한 수확지역(1.5~9.8m)으로 지정한다.
   3. 폭 치수를 중심으로 2.4m x 3.8m의 치수로 마이크로플롯 영역(11.3~13.7m)을 설정합니다. 이 지역에서 ^15N농축 식물 및 토양 샘플을 모두 수집하여 길이 및 너비 치수에 0.38m의 비샘플링 테두리를 남기고 에지 효과를 최소화합니다(그림2).
2. 다른 색깔의 깃발처리 플롯 및 마이크로플롯 모서리를 묘사합니다.

3. 토양 및 식물 샘플 예방 조치

1. 농축되지 않고 농축된 재료에 전용 장비 및 가공 영역을 사용하십시오. 농축 된 재료에 의한 농축되지 않은 재료 (비료, 토양 또는 식물)의 오염은 결과에 크게 영향을 미칠 수 있습니다.
2. ^15N농축 토양 및 식물 시료를 가장 낮은 ^15N의농축 순서로 수집하고 처리하여 교차 오염을 최소화합니다. 작업 표면, 장갑, 기구 및 기계류가 각 샘플 간에 철저히 세척되어 샘플 이월로 인한 교차 오염을 최소화하십시오.
3. 마이크로플롯의 발 트래픽을 최소화하여 농축되지 않은 샘플링 영역의 오염을 방지합니다. 마이크로플롯에 접근할 때 보호 신발 덮개를 착용하고 마이크로플롯 영역을 빠져나갈 때 제거합니다.

4. ¹⁵N 농축 비료 준비 및 응용 프로그램

1. 비료 ¹⁵N 사용 효율 (F¹⁵NUE) 연구에 대한 Ref. 2에 의해 제시 된 지침에 따라, 10 원자 % ¹⁵N 농축 우레아를 희석 5 원자 % ¹⁵N 농축 우레아와 용해 2 L의 열화 된 풍부함을 보장하기 위해 우레아 비료의 균일 한 농축을 보장합니다.
   참고: ¹⁵N 농축 비료의 필요한 농도는 농업 연구의 목표에 따라 달라집니다. 주식 ¹⁵N 농축 비료의 농도가 연구원의 요구 사항을 초과하는 경우, 주식 비료 농도는 다음과 같은 공식^3을사용하여 유사한 종래의 비료로 희석 될 수 있습니다.
   X2 = [(C1/C2) - 1] × X1 C1C2
   X2는 종래의 비료의 질량이고, X1은 트레이서 비료의 질량이며, X1은 동위원소 농도[원자%+과잉으로 표현됨(원자%++0.3663 atom%]로 추정되는 천연 배경 농도로, C2는 최종 혼합물의 이소성 농도이다. 예를 들어, 10 원자 %농축 우레아의 100g을 감안할 때, 종래의 비농축 비료 92.7 g는 5 원자 %의 최종 동위원소 농도에 필요합니다.
   X2 = {[(10-0.3663)/5] - 1} × 100.
2. ¹⁵N 농도용 용액을 분석하여 농축을 확인합니다. 저자는 UC 데이비스 안정 동위원소 시설에서 제공하는 분석 서비스를 활용.
   참고: 비료 첨가에 대한 토양 식물-미생물 정권의 반응은 비료의 물리적 형태에 의해 영향을 받을 수 있다. 연구의 목표에 따라, 우레아 용액은 액정으로 적용되거나 결정개혁을 위해 탈수될 수 있다. 결정은 10,000 psi에서 카버 프레스를 사용하여 케이크로 압축 될 수 있으며, 케이크를 분쇄하고 입자를 원하는 크기 3로 선별할 수^{있습니다.}
3. 보정된 배낭_CO2 분무기(도3A)를이용하여Figure 3 ^15N농축 우레아 용액을 마이크로플롯에 균일하게 적용한다. 여러 N 속도 또는 농축 수준을 사용하는 경우 각 농축 수준에 지정된_CO2 분무기를 사용하거나 단일 분무기를 사용하고 가장 낮은 농축에서 가장 높은 농축에 대한 솔루션을 적용하여 처리 교차 오염을 최소화하십시오.
4. 발광 손실 가능성을 최소화하기 위해 24시간 이내에 광 경유, 손 갈퀴 또는 최소 0.6cm의 관개를 함유한 우레아 함유 비료를 통합한다.
5. 두 번째 성장 기 동안 마이크로 플롯에 ^{추가 15}N 농축 우레아 비료가 적용되지 않습니다. 질소로 인한 옥수수 성장에 차동 반응을 피하기 위해 기존의 농축되지 않은 우레아를 전체 치료에 적용하십시오.

5. 필드 샘플 처리 : 지상 옥수수 바이오 매스

1. 각 샘플링 단계에서, 샘플링 영역 내에서 6-지상 옥수수 식물 복합 샘플을 수집⁽¹⁵N 농축) 및 ¹⁵N 농축 마이크로 플롯에서 6 지상 옥수수 식물 복합 샘플. 식물 성장 역학을 크게 변경하지 않도록 적어도 두 개의 식물은 각 샘플링 된 식물을 분리해야합니다. 저자는 V8 및 R1 옥수수 생리학적 발달^{단계(11)와} 생리성성숙도(그림 2)에서식물 샘플을 수집하였다.
2. 단계 3.1 및 3.2에 기술 된 원리에 따라, V8 및 R1 지상 바이오 매스 (≤5cm x ≤5 cm); 야드 폐기물 치퍼는 만족스러운 옵션입니다. 다진 바이오매스를 라벨이 붙은 직물이나 종이 봉투에 넣고 일정한 질량이 될 때까지 60°C의 강제 공기 오븐에서 건조시십시오. 바이오매스 건성중량(그림3B)을기록합니다.
3. 생리학적으로 성숙한 옥수수 식물을 스테버 (잎, 껍질 및 줄기를 포함한 모든 식물 조직), 곡물 및 코브 분획으로 분할하십시오. 일정한 질량까지 60 °C에서 강제 공기 오븐에서 잘라 건조. 바이오매스 건식 중량을 기록합니다.
4. 마이크로 플롯 내에서, 토양 표면에 있는 모든 옥수수 줄기를 잘라 묶고, 플롯에 따라 라벨을 붙이고, 필드에서 제거합니다(그림3C). 마이크로플롯 코너 플래그를 조정하여 토양 표면과 거의 플러시되어 수확 또는 수확 후 수확 후 결합하여 제거 위험을 최소화합니다.
5. 수확 지역에서 곡물을 수확하고 15.5 %의 수분 함량^12에서수율을 보고합니다. 플롯결합으로 남은 연구 영역을 수확하십시오.
6. 마이크로플롯 지역에서 농축되지 않은 바이오매스를 긁어내라. 올바른플롯(그림3D)에지상 바이오매스 위에 마이크로플롯을 잘라서 다시 적용한다.
7. 토양 및 옥수수 잔류물 수송을 최소화하기 위해 주의를 기울여 토양 표면에 잔류물을 통합하여 마이크로플롯 영역 안팎으로 이동합니다. 경유로 인해 제거된 마이크로플롯 모서리 플래그를 교체합니다.
8. 1년차 옥수수와 같은 줄에 2년째 옥수수를 심는다.
9. 단계 5.3에 설명된 바와 같이 1학년 옥수수 샘플과 같은 생리적 성숙및 공정에서만 2년째 옥수수 바이오매스를 수집합니다. 마이크로플롯 영역(1.52m~0.76m)의 중심에서 마이크로플롯 샘플을 수집하여 경유(그림2)에따른 잠재적신호 희석을 피한다. 수확 지역에서 곡물을 수확하고 15.5 %의 수분 함량으로 수율을보고합니다.
10. 3.1 및 3.2 단계의 원칙에 따라 2mm 체를 통과하기 위해 말린 식물 재료 100 ~ 200 g을 철저히 혼합하고 갈아냅니다. 접지 재료를 철저히 혼합하고 추가 처리를 위해 라벨이 붙은 동전 봉투에 하위 샘플을 저장합니다.
    참고: 토마스 와일리 공장은 식물 조직 연삭에 만족하는 옵션이며 퍼튼 실험실 밀 3610은 곡물을 연마하는 데 만족스러운 옵션입니다.
    주의: 식물 샘플을 연마하는 사람들은 귀 보호를 착용하고 N95 미립자 필터링 페이스피스 호흡보호기를 승인한 국립 산업 안전 보건 연구소를 착용하여 먼지를 흡입하지 않도록 보호해야 합니다.

6. 필드 샘플 처리 : 토양

1. ^15N농축 비료 응용 프로그램, V8, R1 및 수확 후 8일 후에 1학년 토양 샘플을 수집합니다. 2년차 토양 샘플을 사전 식물 및 수확 후에서 수집합니다. 물류 샘플링 제약으로 인해 저자는 0-15-의 계절 토양 샘플을 수집했습니다. 15-30-60cm 깊이, 수확 후 토양 샘플0-15-15- 30-30- 60-60-, 60-90cm 깊이, 2년제 전식물 토양 샘플0~30-30~60-60-10-10cm
   참고: 토양 프로브가 단일 코어로서 가장 깊은 깊이까지 토양 코어를 수집할 수 없는 경우, 상심1cm의 토양을 폐기하는 상부 깊이와 동일한 시추공에서 심층 코어를 수집하여 토양의 상부 깊이에서 떨어지는 토양으로부터 오염을 방지합니다.
   1. 손 프로브를 사용하여 V8 및 R1의 농축되지 않은 샘플링 영역에서 4코어(직경 1.8cm) 복합 토양 샘플을 수집합니다. 옥수수 행에 코어 1개, 옥수수 행 사이에 3개의 코어를 수집합니다.
   2. 유압 프로브를 사용하여 사전 식물 및 후 수확에서 농축되지 않은 샘플링 영역에서 2 코어 (직경 5cm 직경) 복합 토양 샘플을 수집합니다.
   3. 15N 농축 비료 적용, V8 및 R1 후 8일 후 마이크로플롯 영역에서 ^{15코어(직경}1.8cm) 복합 토양 샘플을 수거하여 손 프로브를 이용하여 수집한다. 옥수수 행에 3 ~4 개의 코어와 옥수수 행 사이에 11 ~ 12 코어를 수집합니다.
      참고 : 토양은 매우 이질적입니다. 농축 된 마이크로 플롯 내에서 수집 된 코어의 큰 수는 토양 N^13의진정한 ¹⁵N 농축의 더 나은 추정을 제공한다.
   4. 유압 프로브를 사용하여 사전 식물 및 수확 후 마이크로플롯 영역에서 3 코어 (직경 5cm 직경) 복합 토양 샘플을 수집합니다.
   5. 각 복합 토양 샘플을 양동이에 균질화하고 미리 표지된 종이 봉투에 넣습니다.
2. 일정한 질량까지 강제 공기 오븐에서 35 °C에서 건조 토양 샘플. 각 샘플을 갈아서 2mm 체를 통과합니다. 기계토양 분쇄기는 각 시료 간에 철저히 세척할 수 있다면 만족합니다.
   참고: 토양 샘플은 얇은 층의 트레이에 샘플을 퍼뜨리면 공기 건조될 수 있습니다. 트레이는 N 외부 소스에 의해 오염이없는 지역에 있어야합니다. 농축되지 않고 농축된 시료는 교차 오염을 방지하기 위해 물리적으로 분리되어야 합니다.
   주의: 토양 샘플을 분쇄하는 사람들은 귀 보호를 착용하고 N95 미립자 필터링 페이스피스 호흡보호기를 승인한 국립 산업 안전 보건 연구소를 착용하여 먼지를 흡입하지 않도록 보호해야 합니다.

7. 실험실 샘플 처리 : 분쇄 토양 및 식물 샘플

1. 60 °C에서 오븐에서 하룻밤 동안 건조 분쇄 식물 샘플 (2mm).
2. 3단계에서 설명된 원리에 따라, 말린 식물 샘플이나 토양 물질을 밀가루와 같은 미세한 일관성으로 갈아줍니다. 롤러 항아리 공장은 만족스러운 옵션입니다.
   참고 : 저자의 항아리 공장은 한 번에 54 롤러 항아리를 처리 할 수있는 맞춤형 컨베이어 벨트 시스템입니다.
   1. 각 롤러 항아리(스크류 상단 뚜껑이 있는 250mL 보로실리케이트 유리 항아리)를 10~20g의 지상 식물 또는 토양 샘플과 7개의 스테인레스 스틸 봉(길이 8.5cm, 직경 0.7cm)으로 채웁니다.
   2. 롤러 항아리를 6-24 h의 경우 0.4 x g로 굴리거나 샘플이 밀가루와 같은 미세한 일관성을 가질 때까지 굴려줍니다.
   3. 미세하게 접지 된 재료를 20 mL 의 깨끗한 점성 유리병으로 옮습니다.
   4. 각 샘플 사이에, 세척 롤러 항아리, 스테인레스 스틸 막대, 비누와 물로 뚜껑을 씻어 어떤 잔류물을 제거합니다.
      1. 5% HCl 산성 목욕에 롤러 항아리와 뚜껑을 담그고 (36-38% 농축 재고에서 제조)^{하룻밤 14.}
         주의: 염산은 부식성입니다. 심한 피부 화상, 눈 손상을 일으킬 수 있으며 흡입하면 유해합니다. 항상 보호 복, 장갑, 눈과 얼굴 보호 기능을 착용하십시오. 물로 철저하게 조직에 연락 플러시. 산을 운반할 때항상 보조 용기를 사용하십시오. 이 반응은 외래이기 때문에 항상 물에 산을 추가하십시오. 베이킹 소다로 산성 유출을 즉시 중화시합니다.
         참고: 208L 플라스틱 용기에 5% HCl의 100L로 대산목욕을 제조할 수 있다. 연기 후드에 몇 가지 작은 볼륨을 준비 한 다음 플라스틱 용기에 솔루션을 전송합니다. 3개월마다 솔루션을 교체합니다.
      2. 산화 된 물과 공기 건조와 트리플 린스 롤러 항아리와 뚜껑.
      3. 0.05 M NaOH 욕조에 스테인레스 스틸 봉을 담그고(나오 2g을 탈수 1L에 용해하여 제조)^14. 매일 새로운 0.05 M NaOH 목욕을 준비합니다.
         주의: 수산화 나트륨은 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 항상 보호복과 눈 보호 기능을 착용하십시오. 오염된 옷을 즉시 제거하고 몇 분 동안 물로 피부나 눈을 헹구습니다.
      4. 뜨거운 수돗물 아래에서 5분간 막대를 헹구는 다. 데산과 삼중은 막대를 탈온된 물로 헹구는 다. 종이 타월 이늘어진 트레이에 막대가 건조하도록 합니다.

8. 총 N 및 ¹⁵N 분석을 위한 지상 식물 및 토양 시료의 계량

1. 총 N 함량(예: 연소 분석^15)에대한 몇 가지 대표적인 식물 및 토양 샘플을 분석합니다. 분석기 사양에 따라 ¹⁵N 분석에 적합한 N 함량을 제공하는 샘플 질량을 계산합니다.
   참고: 저자는 UC 데이비스 안정 동위원소 시설에서 제공하는 분석 서비스를 활용했습니다. 농축 된 샘플 가중치는 N의 20 μg에 최적화되었으며 최대 100 μg의 N.
2. 가장 낮은 에서 가장 높은 예상 ¹⁵N 농축에 같은 샘플을 구성합니다. 각 실행에서 8~12번째 샘플을 복제하여 샘플 정밀도를 확인합니다. 실행^16당하나 이상의 검사 샘플을 포함합니다.
3. 깨끗한 96웰 플레이트에 라벨을 부착하고 뚜껑에 개별 웰 증발 링이 장착되어 있습니다. 깨끗한 인덱스 카드를 뚜껑 바로 안쪽에 맞게 잘라 운송 중 우물 간의 샘플 이동을 방지합니다.
4. 니트릴 장갑을 착용하고 마이크로 스케일, 작업 표면, 주걱 및 집게를 실험실 와이프와 에탄올로 청소하십시오. 청소된 기구를 실험실 벤치에 김스와이프에 놓습니다.
   참고: 농축되지 않고 농축된 시료는 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 저울과 기구를 사용하여 처리해야 합니다.
5. 집게를 사용하여 5mm x 8mm의 스테인리스 스틸 블록과 같은 깨끗한 작업 표면에 미리 형성된 5mm x 9mm 주석 캡슐을 배치합니다. 캡슐을 웰에 부드럽게 탭하여 원통형 모양을 개혁하고 필요한 경우 캡슐 바닥을 평평하게 만듭니다.
   참고: 샘플 질량은 매우 작기 때문에 샘플 오염의 위험이 높습니다. 장갑으로 캡슐을 만지지 마십시오. 그것은 집게, 깨끗한 작업 표면, 스케일 계량 팬, 또는 96 웰 플레이트 이외의 표면에 터치하는 경우 캡슐을 폐기합니다.
6. 집게를 사용하여 캡슐의 상단 1mm를 부드럽게 플레어하여 조작을 용이하게 합니다. 캡슐의 무게를 타르팅 할 때 스케일 손상을 방지하기 위해 마이크로 스케일 계량 팬 위에 캡슐을 1 ~ 2mm 로 가져 갑니다. 캡슐을 타레. 집게를 사용하여 캡슐을 깨끗한 작업 표면으로 되돌려 보입니다.
7. 주걱을 사용하여 캡슐에 미세하게 접지 된 샘플 재료의 필요한 질량을 조심스럽게 추가하십시오. 캡슐또는 작업 표면의 외부 표면에 샘플 물질을 흘리지 마십시오.
8. 집게를 사용하여 캡슐의 상단 3분의 1을 천천히 압착하고 접어 서 밀봉합니다. 집게를 사용하여 캡슐을 계속 접고 압축하여 주석을 구멍을 뚫거나 찢지 않도록 주의하십시오.
   참고: N 함량이 낮은 샘플에는 5x9 mm 캡슐의 용량을 초과하는 샘플 볼륨이 필요할 수 있습니다. 더 큰 캡슐(예: 9mm x 10mm)은 이러한 경우에 사용될 수 있다.
9. 집게를 사용하여 포장 된 캡슐을 1cm 높이에서 깨끗하고 어두운 표면 또는 거울에 여러 번 떨어 뜨려 누출을 확인하십시오. 먼지가 나타나지 않으면 8.6 단계에서 설명된 것과 동일한 기술을 사용하여 시료의 무게를 측정합니다. 샘플 가중치를 기록합니다. 캡슐을 96웰 플레이트에 넣고 우물 배치를 기록합니다.
   1. 어두운 표면에 먼지가 나타나면 샘플 무게를 기록합니다. 샘플을 두 번째 주석 캡슐에 싸서 누출을 다시 확인하고 깨끗한 96웰 플레이트에 놓습니다.
      참고: 래핑된 캡슐이 너무 커서 96웰 플레이트에 들어갈 수 없다면 24웰 또는 48웰 플레이트를 사용하십시오.
10. 샘플 사이에 각 기구와 표면에 에탄올과 실험실 물티슈로 청소하여 주걱과 집게 가장자리에 특별한 주의를 기울입니다.
11. 테이프를 사용하여 96웰 플레이트에 뚜껑을 고정하고 건조기에 보관하십시오.

9. 계산

1. 다음 방정식을 사용하여 식물^-1또는 토양 샘플에 포함된 N(kg∙ha-1)의 질량을 계산합니다.
   
   
2. 식물 및 토양^{샘플(17)에}대해 비료 N 분획(Nf), 비료 유래N(FDN)및 토양 유래N(SDN)을계산한다._f
   
   여기서 A는 원자 % ¹⁵N 농축입니다.
3. 
   
4. 비료 를 계산 ¹⁵N 사용 효율⁽¹⁷⁾
   

이 논문에 제시된 결과는 2015년 미네소타 대학교 서던 아웃리치 및 연구 센터와 MN 근처에 위치한 현장 현장에서 나온 것입니다. 이 사이트는 2015년 이전에 옥수수대두[글리신 맥스(L.) Merr] 회전으로 관리되었지만 2015년과 2016년 재배 시즌 동안 옥수수 회전으로 관리되었습니다. 토양은 니콜렛 점토 로암 (미세 혐오, 혼합, 초활성, mesic Aquic Hapludolls)-웹스터 클레이 로암 (미세 혐오, 혼합, 초활성, mesic Typic Endoaquolls) 복합체였다. 토양 불임은 N^18을제외한 대학 지침에 따라 관리되었다. 몇몇 N 비료 처리는 4개의 복제를 가진 무작위화된 완전한 블록 디자인에서 배열되었습니다 그러나 단지 135 kg N∙ha^-1 비율은 심기에서 우레아로 적용된 이 논문에 제시됩니다. 토양 벌크 밀도는 그대로 코어^{방법(19)을}사용하여 복제당 2개의 5cm 깊이 샘플로부터 0-15-15-30-, 30-~ 60-60-60-, 60-- 60-to 90-및 60-120cm 깊이 층의 중심에서 측정하였다. 벌크 밀도는 복제 전반에 걸쳐 깊이 내에서 평균되었으며 필드 전체에서 일정한 것으로 가정했습니다. 플롯 설정 및 식물 및 토양 샘플은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 수집 및 처리되었다.

첫 번째 성장 시즌(그림 4)에걸쳐 각 연속 샘플링 이벤트와 함께 총 (FDN + SDN) 지상 바이오 매스 N 증가. 비료 유래 N 농도는 V8에서 전체 지상 바이오매스 N의 44 ±4%(평균 ±표준 오차)를 차지하는 성장 시즌 초기에 가장 높았으며, 각 연속 샘플링기간(도4A)으로감소하였다. 그러나, SDN은 일관되게 최적의 옥수수 성장을 위한 토양 N 공급의 중요성을 보여주는 지상 바이오매스 N의 가장 큰 부분이었습니다. 첫 해에 생리성 성숙도에서, 상기 바이오매스 N의 27±1%는 FDN에서 곡물, 스토버 및 코브 분획(그림4B)에서비슷한 비율을 가진 FDN로부터 이었다. 2학년 생리성 성숙기에서는 1학년 FDN의 2±0.1%만이 상기 바이오매스에서 1.6±0.2kg의 1.6±0.2kg의 곡물로^-1 수출하였다(그림4A).Figure 4

토양 작물 FDN 예산은 시간이 지남에 따라 시스템 내에서 FDN 사이클링을 정량화하는 데 유용합니다. 비료 응용 프로그램의 8 d 내에서, FDN의 대부분은 예상대로 토양 프로파일의 상위 15cm에 있었다(그림 5). 그러나, 22.2 ±4.4 kg N^ha-1은 이미 깊은 깊이로 이동한 반면 FDN의 4±10%는 미차였다. FDN에 대한 무명-이는 주로 FDN을 토양 샘플링 깊이 아래로 이동하거나 시스템에서 FDN을 완전히 제거하는 침출, 탈질 및 화산화를 포함한 N 손실 메커니즘에 의해 구동될 가능성이 높습니다. V8 및 R1에서는 FDN의 무과도가 평균 60.4 ±4.7kg N^ha-1로 증가했으며 토양 N(0-15cm)은 평균 31.6 ±6.8kg N^{ha-1이었다.} 옥수수의 급속한 성장과 V8에서 R1까지의 높은 N 수요는 17.7 ± 5.2 kg FDN ha^-1을 15- 60cm 토양 깊이에서 17.7 ± 5.2 kg FDN ha -1을 미러링하는 지상 식물 바이오매스에서 19.0 ± 4.4 kg FDN ha^-1의 증가를 초래했습니다. 이러한 옥수수 개발 단계 사이의 토양 온도 및 수분 조건은 유기 잔류물의 급속한 회전율과 미네랄 N의 재사용의 결과로 미생물 성장을 선호하는 경향이 있다. 이러한 결과는 0-15cm 깊이에서 FDN이 주로 토양 유기물과 미생물 분획 사이에서 순환된 반면, 옥수수 뿌리는 15-60cm 깊이에서 무기 FDN을 채굴했다는 것을 시사한다. 토양 무기 및 유기 N 풀의 추가 동위원소 분석은이 가설을 검증하고 FDN 사이클링 역학에 대한 자세한 내용과 통찰력을 제공하기 위해 필요하다^10. 수확 후 연도 1에 의해, 원래 FDN의 59 ± 2 %는 토양의 상위 30cm(도 5)와22.1 ± 2.3 kg FDN ha -1이 곡물(도 4B)로수출된 동안 18.1 ± 3.9 kg FDN ha^-1에 대해 회계되지 않았다.^-1 비료 ¹⁵N 사용 효율은 24%(방정식 7)였으며일반적으로 보고된 F¹⁵NUE 측정값 (25-45%)의 저단선에 있습니다. 다른 연구에 의해 보고²⁰. 장비는 각 샘플 사이에 철저하게 세척되었지만, 연구의 낮은 F¹⁵NUE 측정은 가장 낮은 것으로 예상되는 농축의 순서로 농축 된 샘플을 처리하여 농축 된 샘플 희석의 유물일 수 있습니다. 상위 30cm(36.0±5.2kg FDN^ha-1)의FDN 양은 수확 후 1년에서 전식물 2년까지 의일부 잔류물 고장으로 인해 이전 가을 이후 의약 잔류물 고장으로 인해 2개만 17.3±3.3kg FDN^ha-1로 토양-옥수수 시스템(도5)에서 여전히 발견되었다.Figure 5 이 연구는 1년과 2년 말까지 1년차 FDN의 41및 29%만이 토양 옥수수 시스템(곡물에서 수출된 FDN 포함)을 차지하고 나머지는 환경에 손실되거나 90cm 토양 샘플링 깊이 이하로 침출되었다는 것을 나타낸다.

샘플이 N_f,FDN 및 SDN의 계산에 영향을 미치는 교차 오염될 때 스퓨리어스 결과를 얻을 수 있다. 예를 들어, 실제 농축된 ^15N농축 식물 시료가 3.000 ^원자%15N의 농축을 가정하면 ^15N농도를 2.500 원자%15 N으로 희석시키는 농축되지 않은 물질로 오염된다. ¹⁵ 또한, 총_N식물이 100kg^Nha-1이고,비료의 ^원자%15N 농축은 5.000이고, 농축되지 않은 식물 샘플의 ^원자%15N 농축은 0.366이었다. ^15N농축식물샘플_Nf는 0.568(실제)에서 0.461(오염된 시료)로 감소하여 실제 FDN을 10.7kg N^ha-1로과소평가한다. FDN의 과대 평가는 낮은 ¹⁵N 농축을 가진 견본이 추가 ¹⁵N으로 오염될 때 생길 수 있습니다. 따라서, 샘플 오염을 최소화하기 위해 샘플 수집 및 처리의 모든 단계에서 극단적 인주의를 기울여야하지만, 특히 시료 질량이 감소 (예 : 연삭 및 계량 절차).

그림 1: 처리 플롯 및 마이크로 플롯에 대한 플롯 설계입니다. 이 그림은 처리 플롯 내의 국경 영역, 농축되지 않은 샘플링 영역, 수확 지역 및 마이크로 플롯 영역의 치수 및 상대 적 배치를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마이크로플롯 식물 및 토양 샘플링 다이어그램. 이 그림은 각 샘플링 단계에서 상대식물과 토양 샘플링 위치를 보여 주어 나중에 샘플링된 옥수수 식물의 옥수수 N 섭취 패턴을 변경하지 않도록 합니다. 샘플링 이벤트는 ^15N농축 비료 적용 후 8일 후, V8 및 R1 옥수수 생리학적 개발 단계에서 ^15N농축 비료 적용(PMY1)과 이듬해(PMY2) 및 2년째(PPY2) 경조(PPY2)의 생리적 성숙도에서 발생했다.PMY1PMY2PPY2 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마이크로플롯 관리의 연대순 묘사. (A) ¹⁵N 농축 우레아를 2L의 탈온화된 물에 녹여 심기 시 마이크로플롯에 스프레이한다. (b)샘플링 영역 내에서 6-지상 옥수수 식물 복합 샘플을 수집 및 잘라⁽¹⁵N 농축) 및 사전 결정 된 샘플링 시간에 ¹⁵N 농축 마이크로 플롯에서 6 지상 옥수수 식물 복합 샘플. (C)생리적 성숙시 샘플 수집에 따라, 마이크로플롯 내에서 남은 모든 지상 바이오매스를 제거한다. (D)수확 후, 마이크로 플롯 지역에서 고농축 옥수수 바이오 매스를 긁어. 마이크로플롯 영역에 마이크로플롯 옥수수를 칩및 재적용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 상기 지상 바이오매스 N의 예는 비료 유래 N(FDN) 및 토양 유래 N(SDN) 분획으로 분할된다. 총 상기 바이오매스 N은 FDN(솔리드 컬러) 및 SDN(해시색상)의 개별 공급원으로분리되었다(A)및(B). 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. (A)상기 바이오매스 N은 V8 및 R1 옥수수 생리학적 개발 단계및 ^15N비료적용(PMY1)의연도및 ^15N비료적용(PMY2)에이어 연도에 생리성 성숙도에서 측정하였다. 각 열 위의 값은 FDN인 총 N의 백분율을 나타냅니다. (B)PMY1 및 PMY2에서 측정된 지상 바이오매스 N은 cob(만 1년), 스토버(줄기 와 잎, PMY2용 코브 포함), FDN 및 SDN용 곡물의 개별 부위에 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 토양-옥수수 비료 유래 N(FDN) 예산의 예. FDN의 질량은 지상(Abvgd)옥수수 바이오 매스와 다양한 토양 샘플링 깊이에서 두 성장 계절동안 6 개의 샘플링 이벤트에 대해 보고된다. 샘플링 이벤트는 ^15N농축 비료적용(PA)에이어 8일 후, V8 및 R1 옥수수 생리학적 개발 ^{단계에서, 15N}농축 비료 적용(PMY1)의 연도및 이듬해(PMY2)의 생리성숙에서, 그리고 2년째(PPY2)를 심기 전에 발생했다.PMY1PMY2PPY2 토양 옥수수 부분에서 회수된 적용된 비료 비율(135kg N^ha-1)과FDN의 질량 간의 차이는 FDN 분획에 대한 미상부이다. PPY2및 PMY2의 FDN 의 총 질량은 113kg FDN^{ha-1이었기} 때문에 22kg FDN^ha-1은 토양 옥수수 시스템에서 1년 곡물로 수출되었기 때문이다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

안정적인 동위원소 연구는 토양 작물 시스템을 통해 FDN을 추적하고 정량화하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 N 추적기 연구와 관련된 세 가지 주요 가정이 위반되면이 방법론을 사용하여 얻은 결론을 무효화 할 수 있습니다. 그(것)들은 1) 트레이서가 시스템 전체에 균일하게 분포되고, 2) 연구 하에 프로세스는 동일한 비율로 발생하고, 3) N은 ¹⁵N 농축 풀을 떠나는 것은^3을반환하지 않는다. 이 연구는 토양 작물 시스템 전반에 걸쳐 총 FDN의 분포에 관심이 있기 때문에, 가정 2 및 3 최소한의 관심사^21입니다.

¹⁵N 농축 물질의 높은 비용은 일반적으로 ¹⁵N 추적기 연구의 크기를 제한합니다. 따라서 N 추적기 연구를 시작하기 전에 연구팀은 샘플링 이벤트 수, 연구 기간(일에서 수년) 및 N 비료 적용률 및 자연 풍요로움(0.366 atom%)의 차이를 측정하는 데 필요한 ^15N농축 농도를 고려하여 연구 프로젝트의 목표를 신중하게 계획해야 합니다. 다음 ¹⁵N 농축 비료 희석에 의해 벌크 토양^2. 일반적으로 사용되는 ¹⁵N 농축 수준 및 응용 속도는 Ref. 2에서 다양한 유형의 농업 연구에 대해 보고됩니다. 연구 목표를 결정한 후, 마이크로플롯은 토양과 식물 샘플링을 수용하고 에지 효과를 피하기에 충분히 커야 합니다. 이 프로토콜에 설명된 플롯 디자인은 샘플링되지 않은 테두리 영역을^6으로고용하도록 요구하는 비밀되지 않은 플롯을 사용합니다. 국경 지역의 ¹⁵N 농도는 마이크로플롯 경계를 가로지르는 질량 흐름과 마이크로플롯 외부의 N 섭취량에 의해 희석되며 1열과 6열에서 자라는 측면 옥수수 뿌리에 의해 희석된다. 물리적 장벽이 토양으로 구동되는 제한된 플롯은 국경 영역을 필요로하지 않지만 마이크로 플롯 설립 중에 추가 작업이 필요하며 일상적인 필드 운영^6을제한 할 수 있습니다. 참조 3, 6, 22-25는 마이크로 플롯 크기, 테두리 너비 선택 및 제한된 플롯 또는 비제한 플롯이 가장 적합할 수 있는 경우 에 대한 추가 지침을 제공합니다.

이 연구의 식물 및 토양 샘플링 계획은 두 번연속 성장 계절에 걸쳐 여러 샘플링 이벤트를 허용하도록 설계되었습니다. 초기 시즌 식물과 토양 샘플은 마이크로 플롯의 외부 가장자리 근처에서 촬영됩니다. 각 연속 샘플링 이벤트는 이전에 샘플링된 영역샘플링을 피하기 위해 마이크로플롯의 중앙에 더 가깝게 이동합니다. 옥수수 생리학적 발달의 변화를 최소화하기 위해 적어도 두 개의 옥수수 식물은 각 샘플링 된 식물을 분리합니다. 이 연구의 토양 샘플링 기법과 한 가지 과제는 토양 코어 샘플링 방법이 토양 프로파일^{3에서 15}N의 이기종 분포를 정확하게 차단하지 못할 수 있다는 것입니다. 토양 총 N의 공간 가변성은 15%^3의변동의 추정 계수로 높다. 완전한 마이크로플롯 굴착은 ^15N정량화 정확도를 향상시키지만 상당한 양의 토양을 처리하고 샘플링을 이 연구의 목적에 부합하지 않는 단일 이벤트^3로 제한해야 합니다. 마이크로플롯을 더 작은 샘플링 단위로 세분화하면 여러 굴착 이벤트가 가능하지만 샘플링되지 않은 유닛이 작물 캐노피 및 토양 물 역학에 대한 수정의 영향을 받지 않도록 필요한 마이크로플롯 크기를 증가시킬 수 있습니다. 정확도의 잠재적 감소에도 불구하고, 많은 연구는 마이크로 플롯 ≥1 m^{92,22,2,26,,27,,28에}대한 토양 코어 기술을 사용합니다. 샘플 정밀도는 다음^{공식(13)을}사용하여 마이크로플롯당 수집 및 복합토양 코어의 수를 증가시킴으로써 증가할 수 있다.

n =(Z^2)(CVCV^2)/(dd²⁾

여기서 n은 토양 코어의 수이고, Z는 해당 알파 레벨(0.05에 대해 1.96 및 0.10에 대한 1.65)에 대한 표준화된 정상 바리에이트이며, CV는 변동의 계수이며, d는 플롯 평균(소수점)에서 오차 범위입니다. 이 공식에 기초하여, 저자는 마이크로 플롯 당 15 코어가 플롯의 95 %에 ±7.6 %에 총 N을 추정 할 것으로 예상(n = 15; Z = 1.96; CV = 15%; d = 0.076). 참조(25)는 비슷한 수의 코어를 사용했지만 마이크로플롯을 각 샘플링 이벤트에서 4개 단위로 식물 및 토양 샘플을 수집하는 32개의 샘플링 단위로 세분화하였다.

다른 사람들은 마이크로 플롯 데이터가 전체^{플롯(29)으로}추정될 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이 가정이 유효하려면 치료 플롯과 마이크로플롯을 마찬가지로 관리해야 합니다. 가능하면, 비료 N은 이러한 특성이 N 손실 메커니즘, 고정, 토양 미생물 및^식물에대한 가용성을 포함하는 비료-토양 역학에 영향을 미치기 때문에 동일한 화학적 및 물리적 형태(예를 들어, 물에 용해된 우레아)에 적용되어야 한다.

이 프로토콜에 기재된 롤러 항아리 연삭 방법은 다량의 식물 및 토양 샘플을 분쇄할 수 있으며, 이는 대표적인 균질화된 시료를 보장하는 데 이상적입니다. 그러나 이 기술은 롤러 항아리를 로드, 언로드, 롤 및 청소하는 데 상당한 수동 노동과 시간이 필요합니다. 시료 처리는 롤러 항아리의 사용 가능한 수, 컨베이어 벨트 장치의 용량 및 산성 목욕의 크기에 의해 제한됩니다. 상업용 연삭 바이알은 롤러 항아리에 대한 대안일 수 있지만 가공된 식물 및 토양 샘플의 양을 제한할 수 있습니다. 실험실에서 만든 일회용 연삭 바이알은 잠재적으로 연삭 및 샘플 저장 용기로 사용될 수 있습니다. 이러한 연삭 방법의 주요 고려 사항은 샘플 간의 교차 오염을 최소화하는 것입니다.

마지막으로, ^15N농축 비료 물질이 비싸기 때문에, ^15N은지상 바이오매스와 토양 시료를 보존하고 향후 연구에서 사용하기 위해 균질화될 수 있다. 이러한 제품은 잔류물 분해, 광물화 잠재력 또는 기타 영양소 순환^{공정(21)을}조사할 때 특히 유용할 수 있다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

저자는 미네소타 옥수수 연구 및 진흥 위원회, 휴그 해리슨 펠로우십, 미네소타의 발견, 연구 및 불복 경제 (MnDRIVE) 펠로우십의 지원을 인정합니다.