Conception de microplots et préparation d’échantillons de plantes et de sols pour ¹⁵analyses d’azote

Une conception de microplots pour la recherche sur les traceurs ^{de 15}N est décrite pour tenir compte de multiples événements d’échantillonnage des plantes et des sols en saison. Des procédures de collecte et de traitement des échantillons de sol et d’usine, y compris les protocoles de broyage et de pesage, pour ^{l’analyse de 15}N sont mises de l’avant.

De nombreuses études sur les engrais azotés évaluent l’effet global d’un traitement sur les mesures de fin de saison, comme le rendement des grains ou les pertes cumulatives de N. Une approche isotopique stable est nécessaire pour suivre et quantifier le sort de l’engrais dérivé du N (FDN) par le système de culture du sol. Le but de ce document est de décrire une conception de recherche sur de petites parcelles utilisant des microplots non confinés ^{enrichis de 15}N pour de multiples événements d’échantillonnage des sols et des plantes sur deux saisons de croissance et de fournir des protocoles de collecte, de manipulation et de traitement d’échantillons pour l’analyse totale ^{de 15}N. Les méthodes ont été démontrées à l’aide d’une étude reproduite du centre-sud du Minnesota plantée au maïs (Zea mays L.). Chaque traitement consistait en six rangées de maïs (espacement des rangées de 76 cm) de 15,2 m de long avec un microlot (2,4 m sur 3,8 m) intégré à une extrémité. L’urée de qualité engrais a été appliquée à 135 kg N-ha^-1 lors de la plantation, tandis que le microplot a reçu de l’urée enrichie à 5 atomes % ¹⁵N. Des échantillons de sol et de plantes ont été prélevés plusieurs fois tout au long de la saison de croissance, en prenant soin de minimiser la contamination croisée en utilisant des outils distincts et en séparant physiquement des échantillons non enrichis et enrichis pendant toutes les procédures. Les échantillons de sol et de plantes ont été séchés, moulus pour passer à travers un écran de 2 mm, puis moulus à une consistance semblable à de la farine à l’aide d’un moulin à rouleaux. Les études de traceur exigent la planification supplémentaire, le temps de traitement d’échantillon et le travail manuel, et engagent des coûts plus élevés pour ¹⁵matériaux enrichis de N et l’analyse d’échantillon que les études traditionnelles de N. Toutefois, à l’aide de l’approche de l’équilibre de masse, les études de traceur avec de multiples événements d’échantillonnage en saison permettent au chercheur d’estimer la distribution du FDN par l’intermédiaire du système de culture du sol et d’estimer le FDN non comptabilisé du système.

L’utilisation d’azote d’engrais (N) est essentielle dans l’agriculture pour répondre aux demandes alimentaires, de fibres, d’aliments pour animaux et de carburant d’une population mondiale croissante, mais les pertes de N provenant des champs agricoles peuvent avoir un impact négatif sur la qualité de l’environnement. Étant donné que n subit de nombreuses transformations dans le système de culture du sol, une meilleure compréhension du cycle N, l’utilisation des cultures et le sort global de l’engrais N sont nécessaires pour améliorer les pratiques de gestion qui favorisent l’efficacité de l’utilisation de N et minimisent les pertes environnementales. Les études traditionnelles sur les engrais n se concentrent principalement sur l’effet d’un traitement sur les mesures de fin de saison telles que le rendement des cultures, l’absorption de N par rapport au taux de N appliqué (efficacité apparente de l’utilisation des engrais) et l’efficacité résiduelle du sol N. Bien que ces études quantifient l’ensemble des intrants, des extrants et des gains d’efficacité du système N, elles ne peuvent ni identifier ni quantifier le N dans le système de culture du sol dérivé des sources d’engrais ou du sol. Une approche différente à l’aide d’isotopes stables doit être utilisée pour suivre et quantifier le sort du N dérivé de l’engrais (FDN) dans le système de culture du sol.

L’azote a deux isotopes stables, ¹⁴N et ¹⁵N, qui se produisent dans la nature à un rapport relativement constant de 272:1 pour ¹⁴N/¹⁵N¹ (concentration de 0,366 atome % ¹⁵N ou 3600 ppm ¹⁵N^2,3). L’ajout de ¹⁵engrais enrichis de N augmente la teneur totale de ¹⁵N du système de sol. Comme ¹⁵N engrais enrichi se mélange avec le sol non enrichi N, le changement mesuré de ¹⁴N /¹⁵N rapport permet aux chercheurs de tracer FDN dans le profil du sol et dans la culture^3,4. Un solde de masse peut être calculé en mesurant la quantité totale de traceur de ¹⁵N dans le système et chacune de ses parties². Étant donné que ¹⁵engrais enrichis de 15 N sont beaucoup plus chers que les engrais conventionnels, ¹⁵microplots enrichis de N sont souvent intégrés dans les parcelles de traitement. Le but de ce document de méthodes est de décrire une conception de recherche de petites parcelles utilisant des microplots pour de multiples épreuves d’échantillonnage en saison et d’échantillonnage des plantes pour le maïs(Zea mays L.) et de présenter des protocoles pour la préparation d’échantillons de plantes et de sols pour une analyse totale ^{de 15}N. Ces résultats peuvent ensuite être utilisés pour estimer l’efficacité de l’utilisation des engrais N et créer un budget N partiel tenant compte du FDN dans le sol en vrac et la culture.

1. Description du site sur le terrain

REMARQUE : Lors de l’exécution d’essais sur le terrain de ^{traçage de 15}N, les sites sélectionnés doivent réduire au minimum les variations dues au sol, à la topographie et aux caractéristiques physiques⁵. La contamination croisée peut se produire à la suite d’un mouvement latéral du sol dû à la translocation de la pente, du vent ou de l’eau, ou du travail du sol, tandis que la distribution verticale du sol N peut être affectée par le débit d’eau souterrain et le drainage des tuiles⁶.

1. Décrire le site expérimental du champ, y compris la gestion antérieure (p. ex., les cultures et le travail du sol antérieurs), la latitude et la longitude, les propriétés physiques et chimiques du sol (p. ex., analyse texturale du sol, conditions initiales de fertilité, pH et densité en vrac du sol).
2. Enregistrez les coordonnées GPS du site de recherche et des coins de terrain.
3. Décrire la gestion de la saison de croissance, y compris la lutte contre les ravageurs et les maladies (utilisation d’herbicides, d’insecticides ou de fongicides), la gestion de la fertilité du sol (y compris le taux, la source, le placement et le moment de l’application), le travail du sol, les événements et les quantités d’irrigation et la gestion des résidus.
4. À mesure que la croissance des cultures et les transformations de N médiées par les microbes sont affectées par l’humidité du sol, la température du sol et la température de l’air, enregistrez l’information sur le climat, y compris les températures quotidiennes élevées et basses, les précipitations quotidiennes et l’humidité et les températures du sol à plusieurs profondeurs qui reflètent les profondeurs d’échantillonnage du sol.

2. Conception de parcelle

1. Plantez six rangées de maïs (~86 000 plants ha^-1) sur un espacement de 76 cm avec une dimension de parcelle finale de 15,2 m sur 4,6 m.
   1. Établir des zones frontalières à 1,5 m de chaque extrémité de la dimension dans le sens de la longueur (0-1,5 m, 13,7-15,2 m) et une zone frontalière supplémentaire de 1,5 m de long (9,8 à 11,3 m) attenante aux aires d’échantillonnage et de récolte (figure 1).
   2. Désigner les rangées 2 et 3 comme zone d’échantillonnage des plantes et du sol en saison (1,5 à 9,8 m) et les rangées 4 et 5 comme zone de récolte (1,5 à 9,8 m) pour le rendement des grains de maïs.
   3. Établir une zone de microplot (11,3-13,7 m) avec des dimensions de 2,4 m par 3,8 m centrées sur la dimension de largeur. Prélever les ¹⁵échantillons de plantes et de sol enrichis de N de cette zone, en laissant 0,38 m de bordure non masquée sur les dimensions de longueur et de largeur pour minimiser les effets des bords (figure 2).
2. Délimiter la parcelle de traitement et les coins microplots avec différents drapeaux colorés.

3. Précautions relatives aux échantillons de sol et de plantes

1. Utiliser des équipements dédiés et des zones de traitement pour les matériaux non enrichis et enrichis. La contamination des matériaux non enrichis (engrais, sol ou plante) par des matériaux enrichis et vice versa peut avoir une incidence considérable sur les résultats.
2. Recueillir et traiter ¹⁵échantillons de sol et de plantes enrichis de N de l’ordre de ¹⁵N d’enrichissement prévu le plus bas à le plus élevé afin de minimiser la contamination croisée. Assurez-vous que les surfaces de travail, les gants, les ustensiles et les machines sont bien nettoyés entre chaque échantillon afin de minimiser la contamination croisée du report de l’échantillon.
3. Réduire au minimum la circulation à pied dans les microplots afin d’éviter la contamination des zones d’échantillonnage non enrichies. Portez des revêtements de chaussures de protection lors de l’accès aux microplots et retirez-les à la sortie de la zone du microplot.

4. ¹⁵N préparation et application d’engrais enrichis

1. Conformément aux directives avancées par le Réf. 2 pour les études sur l’efficacité de l’utilisation des engrais ¹⁵N (F¹⁵NUE), diluer 10 atomes % ¹⁵N d’urée enrichie à 5 atomes ^{% 15}N d’urée enrichie et dissoudre dans 2 L d’eau déionisée pour assurer un enrichissement uniforme de l’engrais d’urée.
   REMARQUE : La concentration requise de ¹⁵engrais enrichis de N dépend des objectifs de l’étude agronomique. Si la concentration d’engrais enrichi en stock ¹⁵N dépasse les besoins du chercheur, la concentration d’engrais de stock peut être diluée avec des engrais conventionnels similaires en utilisant la formule³suivante .
   X2 = [(C1/C2) - 1] × X1
   X2 est la masse de l’engrais conventionnel non enrichi, X1 est la masse de l’engrais traceur, C1 est la concentration isotopique [exprimée en atome % excès (atome mesuré % enrichissement moins la concentration naturelle de fond supposé être 0,3663 atome %)] de l’engrais traceur original, et C2 est la concentration isotopique du mélange final. À titre d’exemple, étant donné 100 g d’urée enrichie de 10 atomes, 92,7 g d’engrais conventionnel non enrichi seraient nécessaires pour une concentration isotopique finale de 5 atomes %;
   X2 = {[(10-0.3663)/5] - 1} × 100.
2. Analyser la solution pour une concentration de ¹⁵N afin de vérifier l’enrichissement. Les auteurs ont utilisé les services d’analyse fournis par UC Davis Stable Isotope Facility.
   REMARQUE : Les réactions du régime de microbe-plante-sol aux ajouts d’engrais peuvent être affectées par la forme physique d’engrais. Selon les objectifs de l’étude, la solution d’urée peut être appliquée comme liquide ou déshydratée pour réformer les cristaux. Les cristaux peuvent être compactés dans un gâteau à l’aide d’une presse Carver à 10.000 psi, suivie par l’écrasement du gâteau et le dépistage des particules à la taille désirée³.
3. Appliquez uniformément les 15 solutions d’urée enrichies ^{de 15}N aux microplots à l’aide d’un pulvérisateur de CO₂ calibré à dos (Figure 3A). Si plusieurs taux de N ou niveaux d’enrichissement sont utilisés, envisagez d’utiliser des pulvérisateurs de CO₂ désignés pour chaque niveau d’enrichissement ou d’utiliser un seul pulvérisateur et appliquez des solutions allant du plus bas à l’enrichissement le plus élevé pour minimiser la contamination croisée du traitement.
4. Incorporer des engrais contenant de l’urée avec du travail du sol léger, des râteaux à main ou au moins 0,6 cm d’irrigation dans les 24 h suivant l’application afin de minimiser le potentiel de perte de volatilisation.
5. Aucun engrais supplémentaire enrichi de ¹⁵N n’est appliqué au microplot au cours de la deuxième saison de croissance. Appliquer l’urée conventionnelle non enrichie à l’ensemble du traitement afin d’éviter une réaction différentielle dans la croissance du maïs due à l’azote.

5. Traitement des échantillons de champ : biomasse de maïs hors sol

1. À chaque étape d’échantillonnage, prélever un échantillon composite de six plantes de maïs hors-sol à l’intérieur de la zone d’échantillonnage⁽¹⁵N non enrichi) et un échantillon composite de six plantes de maïs hors-sol du microplot enrichi ^{de 15}N. Au moins deux plantes devraient séparer chaque plante échantillonnée pour éviter de modifier de façon significative la dynamique de croissance des plantes. Les auteurs ont recueilli des échantillons de plantes aux stades de développement physiologique du maïs V8 et R1¹¹ et à maturité physiologique (figure 2).
2. Suivant les principes décrits aux étapes 3.1 et 3.2, hacher la biomasse hors sol V8 et R1 (≤5 cm par ≤5 cm); un broyeur de déchets de jardin est une option satisfaisante. Placer la biomasse hachée dans des sacs en tissu ou en papier étiquetés et sécher dans un four à air forcé à 60 °C jusqu’à ce qu’il soit en masse constante. Enregistrer le poids sec de la biomasse (figure 3B).
3. Partitionnez physiologiquement les plants de maïs matures en stover (tous les tissus végétatifs, y compris les feuilles, les cosses et les tiges), les fractions de grains et d’épis. Hacher et sécher dans un four à air forcé à 60 °C jusqu’à ce qu’il soit à masse constante. Enregistrez le poids sec de la biomasse.
4. Dans le microplot, couper toutes les tiges de maïs à la surface du sol, les attacher dans un faisceau, l’étiquette selon la parcelle et retirer du champ (Figure 3C). Ajuster les indicateurs d’angle de microplot pour qu’ils soient presque rincés avec la surface du sol afin de minimiser le risque d’enlèvement par la moissonneuse-batteuse pendant la récolte ou la récolte du sol.
5. Récolter le grain de la zone de récolte et déclarer le rendement à 15,5 % de teneur en humidité¹². Récolter les zones de recherche restantes avec une parcelle de combiner.
6. Râteau de la biomasse non enrichie à partir de la zone microplot. Hacher et réappliquer la biomasse hors sol de microlots à la parcelle correcte (Figure 3D).
7. Incorporer les résidus dans la surface du sol avec le travail du sol en prenant soin de minimiser le transport des résidus de sol et de maïs dans ou hors de la zone de microplot. Remplacez les drapeaux d’angle microplot retirés en raison du travail du sol.
8. Plantez du maïs de deuxième année sur les mêmes rangées que le maïs de première année.
9. Prélever de la biomasse de maïs hors sol de deuxième année seulement à maturité physiologique et à processus, comme les échantillons de maïs de première année, tel que décrit à l’étape 5.3. Prélever des échantillons de microplots au centre de la zone du microplot (1,52 m sur 0,76 m) afin d’éviter toute dilution potentielle du signal après le travail du sol (figure 2). Récolter les grains de la zone de récolte et déclarer le rendement à une teneur en humidité de 15,5 %.
10. Suivant les principes des étapes 3.1 et 3.2, mélanger et broyer soigneusement 100 à 200 g de matières végétales séchées pour passer à travers un tamis de 2 mm. Mélangez soigneusement le matériau moulu et rangez un sous-échantillon dans une enveloppe de pièces étiquetée pour un traitement ultérieur.
    REMARQUE : Une usine Thomas Wiley est une option satisfaisante pour le broyage des tissus végétaux, tandis qu’un usine de laboratoire 3610 de Perten est une option satisfaisante pour le broyage du grain.
    AVERTISSEMENT : Les personnes qui broient des échantillons d’usines doivent porter une protection contre l’oreille et être protégées contre l’inhalation de poussière en portant un respirateur de protection contre les particules N95 approuvé par l’Institut national de sécurité et de santé au travail.

6. Traitement des échantillons sur le terrain : sol

1. Prélever des échantillons de sol de première année 8 jours après l’épandage d’engrais enrichi de ¹⁵N, le V8, le R1 et le début de la récolte avant la récolte du sol. Prélever des échantillons de sol de deuxième année à la préinstation et après la récolte. En raison de contraintes d’échantillonnage logistique, les auteurs ont recueilli des échantillons de sol en saison à 0 à 15, 15 à 30 ans, et des échantillons de sol de 30 à 60 cm, des échantillons de sol post-récolte à 0- à 15- 15- à 30-, 30- à 60-, et 60- à 90 cm de profondeur, et des échantillons de sol pré-plante de deuxième année à 0- à 30-, 30- à 60-, 60- à 120 cm de profondeur.
   REMARQUE : Si une sonde de sol est incapable de recueillir un noyau de sol à la profondeur désirée la plus profonde sous forme de noyau unique, recueillir des carottes de profondeur plus profondes à partir des mêmes forages que les profondeurs supérieures rejetant les 1 cm supérieurs du sol pour éviter que la contamination du sol ne tombe des profondeurs supérieures.
   1. Prélever un échantillon de sol composite de quatre cœurs (1,8 cm de diamètre) dans la zone d’échantillonnage non enrichie à l’aide de V8 et R1 à l’aide d’une sonde à main. Recueillir un noyau dans la rangée de maïs et trois carottes entre les rangées de maïs.
   2. Prélever un échantillon de sol composite à deux cœurs (5 cm de diamètre) de la zone d’échantillonnage non enrichie à l’aide d’une sonde hydraulique à l’aide d’une sonde hydraulique.
   3. Prélever un échantillon de sol composite de 15 carottes (1,8 cm de diamètre) dans la zone du microplot 8 jours après l’application d’engrais enrichi ^{de 15}N, V8 et R1 à l’aide d’une sonde à main. Recueillir trois à quatre carottes dans la rangée de maïs et 11 à 12 carottes entre les rangées de maïs.
      REMARQUE : Les sols sont extrêmement hétérogènes. Le plus grand nombre de carottes recueillies à l’intérieur du microplot enrichi fournit une meilleure estimation de l’enrichissement réel de ¹⁵N du sol N¹³.
   4. Prélever un échantillon de sol composite de trois cœurs (5 cm de diamètre) de la zone de microplot à l’aide d’une sonde hydraulique à l’aide d’une sonde hydraulique.
   5. Homogénéiser chaque échantillon de sol composite dans un seau et le placer dans un sac en papier pré-étiqueté.
2. Échantillons de sol sec à 35 °C dans un four à air forcé jusqu’à ce qu’une masse constante. Broyer chaque échantillon pour passer à travers un tamis de 2 mm. Un broyeur de sol mécanique est satisfaisant s’il peut être soigneusement nettoyé entre chaque échantillon.
   REMARQUE : Les échantillons de sol peuvent être séchés à l’air en répandant des échantillons sur des plateaux en couche mince. Les plateaux doivent être dans une zone exempte de contamination par des sources extérieures de N. Les échantillons non enrichis et enrichis doivent être séparés physiquement afin de prévenir la contamination croisée.
   ATTENTION : Les personnes qui broient des échantillons de sol doivent porter une protection contre l’oreille et être protégées contre l’inhalation de poussière en portant un respirateur de protection contre les particules N95 approuvé par l’Institut national de sécurité et de santé au travail.

7. Traitement des échantillons de laboratoire : broyage des échantillons de sol et de plantes

1. Échantillons d’usines au sol sec (2 mm) pendant la nuit dans un four à 60 °C.
2. Suivant les principes décrits à l’étape 3, moudre les échantillons de plantes séchées ou les matériaux du sol jusqu’à une consistance fine semblable à celle de la farine. Un moulin à rouleaux est une option satisfaisante.
   REMARQUE : Le moulin à bocaux des auteurs est un système de bande transporteuse sur mesure qui peut traiter 54 pots à rouleaux à la fois.
   1. Remplissez chaque bocal à rouleaux (pot en verre borosilicate de 250 ml avec un couvercle à vis) avec 10 à 20 g d’échantillon de plantes ou de sol moulus et sept tiges en acier inoxydable (8,5 cm de long, 0,7 cm de diamètre).
   2. Rouler les pots à rouleaux à 0,4 x g pendant 6-24 h ou jusqu’à ce que les échantillons aient une consistance fine ressemblant à de la farine.
   3. Transférer le matériau finement moulu dans un flacon de scintillation propre et étiqueté de 20 mL.
   4. Entre chaque échantillon, lavez les pots à rouleaux, les tiges en acier inoxydable et les couvercles avec du savon et de l’eau pour enlever les résidus.
      1. Immerger les pots à rouleaux et les couvercles dans un bain d’acide HCl de 5 % (préparé à partir de 36-38 % de bouillon concentré) pendant la nuit¹⁴.
         ATTENTION : L’acide chlorhydrique est corrosif. Il peut causer de graves brûlures de la peau, des lésions oculaires, et est nocif en cas d’inhalation. Portez toujours des vêtements de protection, des gants et une protection pour les yeux et le visage. Rincer les tissus contactés à fond avec de l’eau. Utilisez toujours un contenant secondaire lors du transport des acides. Ajoutez toujours de l’acide à l’eau car cette réaction est exothermique. Neutraliser immédiatement les déversements d’acide avec du bicarbonate de soude.
         REMARQUE : Un grand bain acide peut être préparé sous forme de 100 L de 5 % HCl dans un contenant en plastique de 208 L. Préparer plusieurs petits volumes dans un capot de fumée, puis transférer les solutions dans le contenant en plastique. Remplacez la solution tous les trois mois.
      2. Triple rinçage des pots à rouleaux et des couvercles à l’eau déionisée et à sec à l’air.
      3. Immerger les tiges en acier inoxydable dans un bain NaOH de 0,05 M (préparé en dissolvant 2 g de NaOH dans 1 L d’eau déionisée) pendant la nuit¹⁴. Préparez un nouveau bain NaOH de 0,05 M chaque jour.
         ATTENTION : L’hydroxyde de sodium peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Portez toujours des vêtements de protection et une protection oculaire. Retirez immédiatement les vêtements contaminés et rincez la peau ou les yeux avec de l’eau pendant plusieurs minutes.
      4. Rincer les tiges sous l’eau chaude courante du robinet pendant 5 minutes. Décanter et tripler rincer les tiges à l’eau déionisée. Laisser sécher les tiges sur un plateau tapissé de papier essuie-tout.

8. Peser les échantillons d’usines et de sols pour l’analyse totale de N et ^{de 15}N

1. Analyser quelques échantillons représentatifs de plantes et de sols pour la teneur totale en N (p. ex., analyse de la combustion¹⁵). Calculer la masse d’échantillon qui fournit un contenu N adéquat pour ^{l’analyse de 15}N selon les spécifications de l’analyseur.
   REMARQUE : Les auteurs ont utilisé les services d’analyse fournis par UC Davis Stable Isotope Facility. Les poids d’échantillon enrichis ont été optimisés pour 20 μg de N avec un maximum de 100 μg de N.
2. Organisez des échantillons semblables de l’enrichissement le plus bas au plus élevé prévu ^{de 15}N. Dupliquer chaque huitième à douzième échantillon dans chaque course pour vérifier la précision de l’échantillon. Inclure au moins un échantillon de contrôle par exécution¹⁶.
3. Étiqueter une plaque propre de 96 puits et un couvercle ajusté avec des anneaux d’évaporation individuels. Coupez une carte d’index propre pour tenir juste à l’intérieur du couvercle pour empêcher le mouvement de l’échantillon entre les puits pendant le transport.
4. Porter des gants de nitrille, nettoyer la micro-échelle, les surfaces de travail, les spatules et les forceps avec des lingettes de laboratoire et de l’éthanol. Placez les ustensiles nettoyés sur un Kimwipe sur le banc du laboratoire.
   REMARQUE : Les échantillons non enrichis et enrichis doivent être traités à l’aide d’écailles et d’ustensiles distincts pour prévenir la contamination croisée.
5. Utilisez des forceps pour placer une capsule d’étain préformé de 5 mm x 9 mm sur une surface de travail propre, comme un bloc en acier inoxydable avec 5 mm x 8 mm de puits. Appuyez doucement sur la capsule dans le puits pour réformer la forme cylindrique et aplatir le fond de la capsule si nécessaire.
   REMARQUE : Comme les masses d’échantillons seront très faibles, le risque de contamination par l’échantillon est élevé. Ne touchez jamais les capsules avec des gants. Jetez la capsule si elle touche une surface autre que les forceps, la surface de travail propre, la plaque de pesée à l’échelle, ou la plaque de 96 puits.
6. Utilisez des forceps pour évaser doucement le haut de 1 mm de la capsule pour faciliter la manipulation. Pour éviter les dommages à l’échelle lors de l’engrégation du poids de la capsule, planez et relâchez la capsule de 1 à 2 mm au-dessus de la plaque de pesée microcal. Tare la capsule. Utilisez des forceps pour retourner la capsule à la surface de travail propre.
7. Utilisez une spatule pour ajouter soigneusement la masse requise de matériel d’échantillon finement moulu à la capsule. Évitez de renverser du matériel d’échantillonnage sur la surface extérieure de la capsule ou sur les surfaces de travail.
8. À l’aide de forceps, sertir lentement le tiers supérieur de la capsule et plier pour sceller. À l’aide de forceps, continuez à plier et comprimer la capsule en forme sphérique en prenant soin de ne pas perforer ou déchirer l’étain.
   REMARQUE : Les échantillons à faible teneur en N peuvent nécessiter des volumes d’échantillons qui dépassent la capacité de la capsule de 5x9 mm. Des capsules plus grandes (p. ex., 9 mm x 10 mm) peuvent être utilisées dans ces cas.
9. Utilisez des forceps pour déposer la capsule enveloppée plusieurs fois d’une hauteur de 1 cm sur une surface propre et sombre ou un miroir pour vérifier s’il y a des fuites. Si aucune poussière n’apparaît, pesez l’échantillon en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 8.6. Enregistrez le poids de l’échantillon. Placez la capsule dans une plaque de 96 puits et enregistrez le placement du puits.
   1. Si de la poussière apparaît sur la surface sombre, enregistrez le poids de l’échantillon. Enveloppez l’échantillon dans une deuxième capsule d’étain, vérifiez à nouveau les fuites et placez-le dans une assiette propre de 96 puits.
      REMARQUE : Si la capsule enveloppée est trop grande pour tenir dans une assiette de 96 puits, utilisez une plaque de 24 ou 48 puits.
10. Entre les échantillons, nettoyez chacun des ustensiles et des surfaces à l’éthanol et des lingettes de laboratoire en accordant une attention particulière aux bords de la spatule et des forceps.
11. Fixez le couvercle de la plaque de 96 puits à l’aide de ruban adhésif et conservez-le dans un dessiccateur.

9. Calculs

1. Calculer la masse de N (kg•ha^-1) contenue dans les échantillons de plantes ou de sol à l’aide des équations suivantes.
   
   
2. Calculer l’engrais N fraction (N_f), l’engrais dérivé N (FDN), et le sol dérivé N (SDN) pour les échantillons de plantes et de sol¹⁷.
   
   où A est l’atome % ¹⁵N d’enrichissement.
3. 
   
4. Calculer l’engrais ¹⁵N efficacité d’utilisation¹⁷.
   

Les résultats présentés dans cet article proviennent d’un site de terrain établi en 2015 à l’Université du Minnesota Southern Outreach and Research Center situé près de Waseca, MN. Le site a été géré comme une rotation maïs-soja[Glycine max (L.) Merr] avant 2015, mais a été géré comme une rotation maïs-maïs au cours des saisons de croissance 2015 et 2016. Le sol était un loam d’argile Nicollet (fine-loamy, mixte, superactif, mésique Aquic Haplulls)-Webster loam d’argile (fine-loamy, mélangé, superactif, mésique Typic Endoaquolls) complexe. La fertilité du sol a été gérée selon les directives de l’université, à l’exception de N¹⁸. Plusieurs traitements d’engrais N ont été organisés dans une conception de bloc complète randomisée avec quatre réplications, mais seulement le taux de 135 kg N-ha^-1 appliqué comme urée à la plantation est présenté dans ce document. La densité en vrac du sol a été mesurée au centre de couches de profondeur de 0 à 15, 15 à 30, 30 à 60, 60 à 90 et de 60 à 120 cm de profondeur à partir de deux échantillons de 5 cm de profondeur par réplication en utilisant la méthode de noyau intacte¹⁹. La densité en vrac a été calculée en moyenne dans la profondeur entre les réplications et on a supposé qu’elle était constante sur l’ensemble du champ. L’installation de parcelles et les échantillons de plantes et de sol ont été recueillis et traités comme décrit dans la section du protocole.

La biomasse hors sol N (FDN + SDN) a augmenté à chaque échantillonnage successif au cours de la première saison de croissance (figure 4). La concentration de N dérivée des engrais a été la plus élevée plus tôt dans la saison de croissance, représentant 44 ± 4 % (erreur moyenne ± standard) de la biomasse totale hors sol N à V8 et a diminué à chaque période d’échantillonnage successive (figure 4A). Toutefois, le SDN était constamment la plus grande fraction de la biomasse souterraine N, ce qui illustre l’importance de l’approvisionnement en N du sol pour une croissance optimale du maïs. À maturité physiologique au cours de la première année, 27 ± 1 % de la biomasse hors sol N provenait de FDN avec des proportions similaires dans les fractions de grains, de stover et d’épis (figure 4B). À maturité physiologique au cours de la deuxième année, seulement 2 ± 0,1 % du FDN de première année a été récupéré dans la biomasse hors sol avec 1,6 ± 0,2 kg de FDN ha^-1 de première année exporté dans le grain (figure 4A).

Le budget du FDN pour la culture du sol est utile pour quantifier le cycle du FDN dans le système au fil du temps. Dans les 8 d de l’application d’engrais, la majorité des FDN se trouvait dans le top 15 cm du profil du sol, comme prévu (figure 5). Cependant, 22,2 ± 4,4 kg N ha^-1 s’étaient déjà déplacés dans les profondeurs plus profondes tandis que 4 ± 10 % du FDN n’était pas comptabilisé. Le FDN non comptabilisé est probablement principalement motivé par des mécanismes de perte de N, y compris la lixiviation, la dénitrification et la volatilisation, qui déplacent le FDN sous les profondeurs d’échantillonnage du sol ou enlèvent entièrement le FDN du système. À V8 et R1, le FDN non comptabilisé est passé à 60,4 ± 4,7 kg N ha^-1 en moyenne, tandis que le sol N (0-15 cm) était de 31,6 ± 6,8 kg N ha^-1 en moyenne. La croissance rapide du maïs et la forte demande de N de V8 à R1 ont entraîné une augmentation de 19,0 ± 4,4 kg FDN ha^-1 dans la biomasse végétale hors sol reflétant la réduction de 17,7 ± 5,2 kg d’ha-1 de la profondeur du sol de 15 à 60 cm.^-1 Les conditions de température et d’humidité du sol entre ces stades de développement du maïs tendent à favoriser la croissance microbienne, ce qui entraîne un roulement rapide des résidus organiques et une réutilisation de l’N minéralisé. Ces résultats suggèrent que les racines de maïs ont extrait des FDN inorganiques des profondeurs de 15 à 60 cm tandis que le FDN dans la profondeur de 0 à 15 cm a été principalement cycle entre la matière organique du sol et les fractions microbiennes. Une analyse isotopique supplémentaire des bassins N inorganiques et organiques du sol est nécessaire pour valider cette hypothèse et fournir plus de détails et de perspicacité dans la dynamique cyclable^{FDN 10}. Au cours de la première année de récolte, 59 ± 2 % du FDN d’origine n’a pas été comptabilisé, tandis que 18,1 ± 3,9 kg FDN ha^-1 se trouvait dans les 30 cm supérieurs du sol (figure 5) et 22,1 ± 2,3 kg FDN ha^-1 ont été exportés dans le grain (figure 4B). L’efficacité de l’utilisation de l’engrais ¹⁵N était de 24 % (équation 7)et se situe à l’extrémité basse des mesures F¹⁵NUE couramment signalées (25-45 %) d’autres études²⁰. Bien que l’équipement ait été soigneusement nettoyé entre chaque échantillon, les mesures F¹⁵NUE inférieures de l’étude pourraient être un artefact de dilution enrichie d’échantillons par traitement d’échantillons enrichis dans l’ordre de l’enrichissement le plus faible à le plus élevé prévu. La quantité de FDN dans les 30 cm supérieurs a doublé (36,0 ± 5,2 kg FDN ha^-1) de l’année 1 à l’année pré-plante en raison de la dégradation partielle des résidus depuis l’automne précédent, mais par l’année post-récolte 2 seulement 17,3 ± 3,3 kg FDN ha^-1 a encore été trouvé dans le système de maïs-sol(figure 5). Cette étude indique qu’à la fin de la première et de la deuxième année, seulement 41 et 29 %, respectivement de FDN de première année, étaient comptabilisés dans le système de maïs-sol (y compris le FDN exporté dans le grain) tandis que le reste était soit perdu dans l’environnement, soit lessivé en dessous de la profondeur d’échantillonnage du sol de 90 cm.

Des résultats fallacieux peuvent être obtenus lorsque des échantillons sont contaminés par des contaminations croisées affectant les calculs de N_f,FDN et SDN. Par exemple, supposons qu’un échantillon de plantes enrichies de ¹⁵N avec un enrichissement réel de 3.000 atomes % ¹⁵N soit contaminé par un matériau non enrichi diluant la concentration ^{de 15}N à 2.500 atome % ¹⁵N. En outre, supposons que_l’usine Total N est de 100 kg N ha^-1, l’atome % ¹⁵N d’enrichissement de l’engrais était de 5.000, et l’atome % ¹⁵N enrichissement de l’échantillon de plante non enrichi était de 0,366. L’échantillon de plantes enrichies de ¹⁵N N_f serait réduit de 0,568 (réel) à 0,461 (échantillon contaminé) sous-estimant le FDN réel de 10,7 kg N ha^-1. Des surestimations du FDN peuvent se produire lorsque des échantillons à faible teneur en ¹⁵N sont contaminés par ¹⁵N supplémentaires. Ainsi, il convient de faire l’objet d’une extrême prudence dans toutes les étapes de la collecte et du traitement des échantillons afin de réduire au minimum la contamination par les échantillons, mais surtout lorsque les masses d’échantillons sont réduites (p. ex., les procédures de broyage et de pesage).

Figure 1 : Conception de la parcelle de terrain pour la parcelle de traitement et le microplot. La figure illustre les dimensions et les placements relatifs des zones frontalières, de la zone d’échantillonnage non enrichie, de la zone de récolte et de la zone de microplot dans la parcelle de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Diagramme d’échantillonnage des plantes et des sols par microplote. La figure illustre les positions relatives d’échantillonnage des plantes et du sol à chaque étape de l’échantillonnage qui évite de modifier les habitudes d’absorption de n de maïs du maïs échantillonnés ultérieurement. Les événements d’échantillonnage se sont produits 8 jours après l’application d’engrais enrichi ^{de 15}N, aux stades de développement physiologique du maïs V8 et R1, à maturité physiologique au cours de l’année de ¹⁵N d’engrais enrichis (PMY1) et l’année suivante (PMY2),et avant la plantation de la deuxième année (PPY2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Représentation chronologique de la gestion des microplots. (A) Dissoudre ¹⁵N d’urée enrichie en 2 L d’eau déionisée et pulvériser sur le microplot lors de la plantation. (B) Recueillir et hacher un échantillon composite de six plantes de maïs hors-sol à l’intérieur de la zone d’échantillonnage⁽¹⁵N non enrichi) et un échantillon composite de plante de maïs six-dessus-sol du microplot enrichi ^{de 15}N aux heures d’échantillonnage prédéterminées. (C) Après la collecte de l’échantillon à maturité physiologique, retirer toute la biomasse hors sol restante de l’intérieur du microplot. (D) Après la récolte, râteau non enrichi de biomasse de maïs hors sol de la zone microplot. Copeaux et réappliquez la biomasse hors sol du maïs microplot à la zone microplot. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Exemple de biomasse hors sol N divisée en fractions N (FDN) dérivées d’engrais et N (SDN) dérivées du sol. La biomasse totale hors sol N a été séparée en ses sources individuelles de FDN (couleur solide) et de SDN (couleur haché) dans (A) et (B). Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. (A) La biomasse hors sol N a été mesurée aux stades de développement physiologique du maïs V8 et R1 et à maturité physiologique au cours de l’année de l’application d’engrais ¹⁵N (PMY1) et l’année suivant l’application ^{d’engrais 15}N (PMY2). La valeur au-dessus de chaque colonne représente le pourcentage du N total qui était FDN. (B) La biomasse hors sol N mesurée à PMY1 et PMY2 est indiquée dans ses parties individuelles de l’épi (seulement l’année 1), le stover (tige et feuilles; comprend l’épi pour PMY2) et le grain pour FDN et SDN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Exemple du budget de l’engrais de maïs-maïs dérivé du N (FDN). La masse de FDN récupérée dans la biomasse de maïs en surface(Abvgd)et à diverses profondeurs d’échantillonnage du sol est signalée pour six événements d’échantillonnage sur deux saisons de croissance. Les événements d’échantillonnage se sont produits 8 jours après l’application d’engrais ^{enrichis de 15}N (PA), aux stades physiologiques de développement physiologique du maïs V8 et R1, à maturité physiologique au cours de l’année de ¹⁵N d’application d’engrais enrichis (PMY1) et l’année suivante (PMY2), et avant la plantation de la deuxième année (PPY2). La différence entre le taux d’engrais appliqué (135 kg N ha^-1)et la masse de FDN récupérée dans les portions de maïs-sol est la fraction FDN non comptabilisée. La masse totale de FDN pour PPY2 et PMY2 était de 113 kg FDN ha^-1 parce que 22 kg FDN ha^-1 a été exporté hors du système de maïs-sol comme grain de première année. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La recherche sur les isotopes stables est un outil utile pour le suivi et la quantification du FDN par l’entremise du système de culture du sol. Cependant, il y a trois hypothèses principales associées aux études de traceur de N qui, si elle est violée, peuvent invalider les conclusions tirées de l’utilisation de cette méthodologie. Ils sont 1) le traceur est uniformément réparti dans tout le système, 2) les processus dans le cadre de l’étude se produisent aux mêmes taux, et 3) N laissant la piscine enrichie ¹⁵N ne retourne pas³. Étant donné que cette étude s’intéresse à la distribution du FDN total dans l’ensemble du système de culture des sols, les hypothèses 2 et 3 sont peu préoccupantes²¹.

Le coût élevé de ¹⁵N matériel enrichi limite généralement la taille des études de ^{traçage de 15}N. Par conséquent, avant de lancer une étude sur les traceurs N, le chercheur devrait soigneusement planifier les objectifs du projet de recherche en tenant compte : le nombre d’échantillonnages, la durée de l’étude (jours à années), le taux d’épandage des engrais N et la concentration d’enrichissement de ¹⁵N requise pour mesurer les différences par rapport à l’abondance naturelle (0,366 atome %) après ¹⁵N de dilution des engrais enrichis par sol en vrac². Les niveaux d’enrichissement et les taux d’application de ¹⁵N couramment utilisés sont signalés pour différents types de recherche agronomique dans l’réf. 2. Après avoir déterminé les objectifs de l’étude, le microplot doit être suffisamment grand pour tenir compte de l’échantillonnage du sol et des plantes et éviter les effets de bord. La conception de l’intrigue décrite dans ce protocole utilise une parcelle non confinée exigeant que les zones frontalières non échantillonnées soient utilisées⁶. La concentration ^{de 15}N dans les zones frontalières est diluée par le flux de masse à travers la limite des microplots et l’absorption de N de l’extérieur du microplot par des racines latérales de maïs qui poussent dans les rangées 1 et 6. Les parcelles confinées, où les barrières physiques sont entraînées dans le sol, ne nécessitent pas de zones frontalières, mais nécessitent des travaux supplémentaires pendant l’établissement de microplots et peuvent limiter les opérations de routine sur le terrain⁶. Les références 3, 6, 22-25 fournissent des indications supplémentaires sur la sélection des tailles de microlots, des largeurs de bordure et, lorsqu’il s’agit de parcelles confinées ou non confinées, les parcelles peuvent être les plus appropriées.

Le schéma d’échantillonnage des plantes et des sols de cette étude est conçu pour permettre de multiples échantillonnages sur deux saisons de croissance consécutives. Des échantillons de plantes et de sol de début de saison sont prélevés près des bords extérieurs du microplot. Chaque échantillonnage successif se rapproche du centre du microplot pour éviter l’échantillonnage des zones précédemment échantillonnées. Au moins deux plants de maïs séparent chaque plante échantillonnée pour minimiser les changements dans le développement physiologique du maïs. L’un des défis de la technique d’échantillonnage du sol de cette étude est que la méthode d’échantillonnage des carottes du sol peut ne pas intercepter avec précision la distribution hétérogène de ¹⁵N dans le profil du sol³. La variabilité spatiale du N total du sol est élevée avec un coefficient de variation estimé à 15 %³. L’excavation complète de microplots améliorerait la précision de quantification de ¹⁵N, mais nécessite le traitement de volumes importants de sol et limiterait l’échantillonnage à un seul événement³ qui n’est pas conforme aux objectifs de la présente étude. La subdivision de la microplot en unités d’échantillonnage plus petites permet de subir de multiples fouilles, mais peut augmenter la taille requise des microplots pour s’assurer que les unités non échantillonnées ne sont pas affectées par les modifications apportées à la canopée des cultures et à la dynamique de l’eau du sol. Malgré la réduction potentielle de la précision, de nombreuses études utilisent la technique du noyau du sol pour les microplots ≥1 m^{29,22,26,27,28}. La précision de l’échantillon peut être augmentée en augmentant le nombre de carottes de sol recueillies et composites par microplot à l’aide de la formule¹³suivante :

n = (Z²)(CV²)/(d²)

où n est le nombre de noyaux de sol, Z est le variable normal normalisé pour le niveau alpha correspondant (1,96 pour 0,05 et 1,65 pour 0,10), cv est le coefficient de variation, et d est la marge d’erreur dans la moyenne de parcelle (comme décimale). Sur la base de cette formule, les auteurs s’attendent à ce que 15 noyaux par microplot estiment le total N à ±7,6 % sur 95 % des parcelles (n = 15; Z = 1,96; CV = 15%; d = 0,076). La référence 25 a utilisé un nombre similaire de carottes, mais a subdivisé le microplot en 32 unités d’échantillonnage qui ont recueilli des échantillons d’usines et de sols à partir de quatre unités à chaque échantillonnage.

D’autres ont montré que les données microplot peuvent être extrapolées à l’ensemble de la parcelle²⁹. Toutefois, pour que cette hypothèse soit valide, la parcelle de traitement et le microplot doivent être gérés de la même façon. Si possible, l’engrais N doit être appliqué sous les mêmes formes chimiques et physiques (p. ex., l’urée dissoute dans l’eau) que ces propriétés ont un impact sur la dynamique engrais-sol, y compris les mécanismes de perte de N, l’immobilisation et la disponibilité des microbes du sol et des plantes³.

La méthode de broyage des pots à rouleaux décrite dans ce protocole est capable de pulvériser de grands volumes d’échantillons de plantes et de sol, idéal pour assurer un échantillon représentatif et homogénéisé. Cependant, la technique exige le travail manuel significatif et le temps de charger, décharger, rouler, et nettoyer les pots à rouleaux. Le traitement des échantillons est limité par le nombre disponible de pots à rouleaux, la capacité de l’unité de bande transporteuse et la taille du bain acide. Les flacons de broyage commerciaux peuvent être une alternative aux pots à rouleaux, mais peuvent limiter le volume d’échantillons de plantes et de sols traités. Des flacons de broyage à usage unique fabriqués en laboratoire peuvent être construits qui pourraient servir de récipient de broyage et de stockage d’échantillons. L’une ou l’autre de ces méthodes de broyage est de réduire au minimum la contamination croisée entre les échantillons.

Enfin, comme 15 engrais enrichis ^{de 15}N sont coûteux, ¹⁵N de biomasse hors sol enrichie et d’échantillons de sol peuvent être conservés et homogénéisés pour être utilisés dans de futures études. Ces produits peuvent être particulièrement utiles lors de l’étude de la décomposition des résidus, du potentiel de minéralisation ou d’autres processus de cycle des éléments nutritifs²¹.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les auteurs reconnaissent le soutien du Minnesota Corn Research & Promotion Council, de la Hueg-Harrison Fellowship et de la Bourse Discovery, Research and InnoVation Economy (MnDRIVE) du Minnesota.