인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

소뇌는 균형과 모터 조정의 유지 보수에 중요한 역할을하며, 다른 소뇌 뉴런의 기능적 결함은 소뇌 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 질병 관련 신경 표현형에 대한 현재 지식의 대부분은 질병 진행 및 발달의 이해를 어렵게 하는 사후 조직을 기반으로 합니다. 동물 모델과 불멸의 세포주 또한 신경 퇴행 성 장애에 대 한 모델로 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 완전히 인간의 질병을 되풀이하지 않습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)는 질병 모델링을위한 큰 잠재력을 가지고 있으며 재생 접근에 대한 귀중한 소스를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 환자 유래 iPSC에서 대뇌 오르가노이드의 생성은 신경 퇴행성 질환 모델링에 대한 전망을 향상. 그러나, 많은 수의 오르가노이드를 생성하는 프로토콜과 3D 배양 시스템에서 성숙한 뉴런의 높은 수율은 부족합니다. 제시된 프로토콜은 유기체가 소뇌 정체성을 취득하는 확장 가능한 일회용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의된 조건하에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 재현 가능하고 확장 가능한 생성을 위한 새로운 접근법입니다. 생성된 오르가노이드는 mRNA 와 단백질 수준에서 특정 마커의 발현을 특징으로 한다. 단백질의 특정 단의 분석은 오르가노이드 구조의 평가에 중요 한 다른 소뇌 세포 집단의 검출을 허용. 유기체 극저분과 오르가노이드 슬라이스의 추가 면역 염색은 특정 소뇌 세포 집단과 공간 조직의 존재를 평가하는 데 사용됩니다.

인간 만능 줄기세포(PSC)의 출현은 이러한 세포가^인체의대부분의 세포 계보로 분화될 수 있기 때문에 재생 의학 및 질병 모델링을 위한 우수한 도구를 나타낸다^1,2. 이들의 발견 이후, 다양한 접근법을 이용한 PSC 분화는 신경퇴행성 질환^3,4,,55,6등 다양한 질병을 모델링하는 것으로 보고되었다.^,

최근에는 인간 뇌 구조를 닮은 PSCs로부터 파생된 3D 배양에 대한 보고가 있었습니다. 이들은 뇌 오르가노이드^{3,,7,,8이라고합니다.} 건강하고 참을성 있는 특정 PsCs 둘 다에서 이 구조물의 생성은 인간 발달 및 신경 발달 무질서를 모델링할 귀중한 기회를 제공합니다. 그러나, 이러한 잘 조직된 대뇌 구조를 생성하는 데 사용되는 방법은 대규모 생산을 신청하기 어렵다. 오르가노이드 내부의 괴사 없이 조직 형태 발생을 재구성할 수 있을 만큼 큰 구조를 생성하기 위해 프로토콜은 정적 조건에서 초기 신경 약념에 의존하고, 하이드로겔의 캡슐화 및 동적 시스템^3의후속 배양에 의존한다. 그러나, 이러한 접근은 오르가노이드 생산의 잠재적 인 확장을 제한 할 수있다. 피질, 줄무늬, 중뇌 및 척수 뉴런^{,9,,10,11,,12를}포함한 중추 신경계의 특정 부위에 PSC 분화를 지시하기 위한 노력이 있었지만, 동적 조건에서 특정 뇌 영역의 생성은 여전히 과제입니다. 특히, 3D 구조에서 성숙한 소뇌 뉴런의 생성은 아직 설명되지 않았다. Muguruma 등은 초기 소뇌 발달을 재구성하는 배양 조건의 생성을^{개척하고 최근} 인간 배아 줄기 세포가 제1 삼분기 소뇌^7을연상시키는 편광 구조를 생성할 수 있도록 하는 프로토콜을 보고했다. 그러나, 보고된 연구에서 소뇌뉴런의 성숙은 오르가노이드의 해리, 소뇌선 선조의 분류, 및 단층 배양 시스템에서 피더 세포와 의 공동⁷배양을 필요로^{7,14,,15,,16.} 따라서, 정의된 조건하에서 질병 모델링을 위한 바람직한 소뇌 유기성 의 재현 가능한 생성은 여전히 배양 및 피더 소스 가변성과 관련된 도전이다.

이 프로토콜은 3D 확장을 위한 최적의 배양 조건과 인간 PSC를 일회용 수직 휠 생체 반응기(사양에 대한 재료 표 참조)를 사용하여 소뇌 뉴런으로 효율적으로 분화하는 최적의 배양 조건을 제시합니다( 이후 생물 반응기라고 하는 재료표 참조). 생물 반응기는 U 자형 바닥과 함께 선박 내부에 더 균일한 전단 분포를 제공하는 대형 수직 임펠러가 장착되어 있어 부드럽고 균일한 혼합 및 입자 서스펜션을 허용하여 교반 속도^17을줄입니다. 이 시스템을 사용하면 모양 과 크기 조절 셀 응집체를 얻을 수 있으며, 이는 보다 균일하고 효율적인 분화에 중요합니다. 더욱이, 더 많은 수의 iPSC 유래 오르가노이드가 덜 힘든 방식으로 생성될 수 있다.

일반적으로 줄기 세포에서 형성되는 3D 다세포 구조인 오르가노이드의 주요 특징은 인간 형태 발생^{18,,19,,20에서}볼 수 있는 것과 같은 특정 모양을 형성하는 다른 세포 유형의 자체 조직이다. 따라서, 오르가노이드 형태는 분화 과정에서 평가되는 중요한 기준이다. 유기체의 극저분과 특정 항체 세트를 가진 유기성 슬라이스의 추가 면역 염색은 세포 증식, 분화, 세포 인구 정체성 및 세포 세포 집단 정체성을 분석하기 위해 분자 마커의 공간 시각화를 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면, 면역 염색 유기성 저온 절제에 의해, 초기 효율적인 신경 약념은 분화의 7^일에 의해 관찰된다. 분화 하는 동안, 소뇌 정체성을 가진 여러 세포 인구 관찰. 이 동적 시스템에서 35 일 후, 소뇌 신경 에피텔륨은 증식 선조와 유면에 위치한 후유증 뉴런의 정량층과 함께 양봉 축을 따라 구성됩니다. 성숙 과정에서, 분화의 일 35-90에서, 소뇌 뉴런의 별개의 유형은 Purkinje 세포 (칼빈딘^+),과립 세포 (PAX6⁺/MAP2^+),골기 세포 (신경그라닌^+),단극성 브러시 세포 (TBR2^+),깊은 소뇌 핵 프로젝션 뉴런 (TBR1⁺⁾등 볼 수 있습니다. 또한, 배지에서 90일 후에 생성된 소뇌 기관지에서 세포사멸의 미미한 양이 관찰된다.

이 시스템에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드는 다른 소뇌 뉴런으로 성숙하고 해리와 피더 공동 문화없이 최대 3 개월 동안 생존하여 질병 모델링을위한 인간 소뇌 뉴런의 원천을 제공합니다.

1. 단층 문화에서 인간 iPSC의 패시징 및 유지 보수

1. 플레이트 준비
   1. 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표참조) 4 °C에서 주식을 해동하고 60 μL 알리쿼트를 준비합니다. -20°C에서 알리쿼를 동결합니다.
   2. 6 웰 플레이트의 우물을 코팅하려면 지하 막 매트릭스의 알리쿼트 하나를 얼음 위에 해동하십시오. 해동하면 DMEM-F12의 6mL에 60 μL을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 다시 중단합니다.
   3. 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스 용액 1 mL을 6 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 최대 1 주 동안 4 ° C에서 저장하기 전에 RT에서 적어도 1 시간 동안 배양하십시오.
2. EDTA와 iPSC 식민지의 패싱
   1. 37°C, 습도 95%, CO 2 5% 에서 인큐베이터내 6웰 플레이트에서 단층 배양에서 iPSC를_{유지한다.}
      참고: 이 프로토콜에서는 F002.1A.13^21,인간 상피 iPSC 라인(iPSC6.2)^22,그리고 상업적으로 획득한 iPS-DF6-9-9T.B(재료표 참조)의 세 가지 인간 iPSC 라인이 사용되었습니다. Table of Materials
   2. 패시징하기 전에 실온(RT)에서 저장된 플레이트(1.1단계)를 15분 동안 배양하고 mTesR1배지(표 1)를준비한다.
   3. 혈청 피펫을 사용하여 플레이트에서 용액을 흡인하고 즉시 0.5 mL의 mTeSR1 배지를 각 웰에 추가합니다.
   4. iPSC를 함유하는 우물에서 소비된 배지를 흡인하고 우물당 0.5mMEDTA의 1mL를 사용하여 한 번 세척한다.
   5. 각 웰에 0.5mM EDTA의 1mL을 추가하고 5 분 동안 RT에서 배양하십시오.
   6. EDTA를 흡인시키고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 mTeSR1 배지를 부드럽게 추가하고 콜로니를 피펫팅하여 우물에서 세포를 제거합니다. 원문 튜브에서 세포를 수집합니다.
      참고: 3배 이상 구피 셀을 피펫하지 마십시오.
   7. 각 웰에 세포 현탁액이 1.5 mL를 첨가한 후 배지1.5mL를 포함하도록 각 웰에 1mL의 세포 현탁액(희석 1:4)을 추가합니다. 5% CO_2,37°C에서 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
   8. 75%-80%의 합류가 달성될 때 매일 소비된 매체와 통로를 3일마다 교체하십시오.

2. 생물 반응기에서 인간 iPSC의 파종

1. mTeSR1의 단층으로 자란 인큐베이션 iPSCs는 ROCK 억제제 Y-27632(ROCKi)의 10μM로 보충하였다. 6개의 잘 조직 배양 플레이트에서 각 웰에 1mL의 보충 배지를 추가하고 37°C에서 1시간, 습도 95%, CO₂ 5% 배양합니다.
   참고 : ROCKi는 apoptosis^23에서해리 된 iPSC를 보호하는 데 사용됩니다.
2. 1 h의 인큐베이션 후, 각 우물에서 소비된 배지를 흡인하고 1mL로 1mL로 1mL를 잘 씻는다×.
3. 세포 분리 배지 의 1 mL (재료의 표참조) 6 웰 플레이트의 각 우물에 넣고 세포가 부드러운 흔들림으로 우물에서 쉽게 분리 될 때까지 7 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
4. 세포가 분리되고 단일 세포로 해리될 때까지 P1000 마이크로파이프로 세포 분리 배지를 위아래로 피펫합니다. 각 웰에 완전한 세포 배양 배지 2mL을 추가하여 효소 소화를 비활성화하고 세포를 멸균 원문 튜브에 부드럽게 피펫합니다.
5. 210 g에서 원심분리기는 g 3분 동안 × 상체를 제거합니다.
6. 배양 배지(즉, MTeSR1은 ROCKi의 10μM로 보충)에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 트립판 블루 염료를 사용하여 혈류계로 iPSC를 계산합니다.
7. 종자 15 × 10⁶ 개의 단일 세포는 생물 반응기 (최대 부피 100 mL)와 60 mL의 mTeSR1은 250,000 세포 / mL의 최종 세포 밀도에서 ROCKi의 10 μM로 보충된다.
8. 37°C, 습도 95%, CO 2 5%로 인큐베이터에 배치된 범용 베이스 유닛에 iPSC를 함유한 용기를_{삽입한다.}
   참고: 생체 반응기 교반은 iPSC 응집을 촉진하기 위해 범용 염기 단위 제어를 27 rpm으로 설정하여 24 시간 동안 유지됩니다.

3. 소뇌 유기체에서 인간 iPSC 유래 골재의 분화 및 성숙

1. 단일 셀 시드의 날을 0일로 정의합니다.
2. 첫날, 혈청 피펫을 사용하여 iPSC 골재 샘플 의 1mL를 수집합니다. 시료를 수집하기 전에 멸균 흐름에 골재를 함유하는 생물 반응기로 범용 염기유닛을 배치하여 이전과 같이 동요 하에서 생물 반응기를 유지한다. 초저 부착 24 웰 플레이트에서 셀 서스펜션을 플레이트. iPSC 파생 집계가 형성되어 있는지 확인합니다.
3. 총 40배 또는 100x배율을 사용하여 광학 현미경으로 이미지를 획득하여 총 직경을 측정합니다.
4. FIJI 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 집계 영역을 측정합니다.
   1. "분석 |선택 메뉴 표시줄에서측정 "을 설정하고"영역"과"OK"를 클릭합니다.
   2. "파일 선택 | 메뉴 표시줄에서 "열어저장된 이미지 파일을 엽니다. 도구 표시줄에 제시된 선 선택 도구를 선택하고 이미지에 제시된 배율 막대 위에 직선을 만듭니다. "분석 | 선택 메뉴 표시줄에서 "설정규모"를 설정합니다.
   3. "알려진 거리"에서이미지의 스케일 막대의 광공을 μm에 추가합니다. "길이단위"를μm으로 정의합니다. 설정을 유지하려면"전역"을클릭하고"OK"를 클릭합니다. 도구 표시줄에서 타원형 선택 항목을 선택합니다.
   4. 각 집계에 대해 타원형 도구로 영역을 설명합니다. "분석 | 선택 측정". 골재가 대략 구형이라는 점을 고려하여 측정된 면적을 기준으로 지름을 계산합니다.
      
      골재의 영역으로 A를 가진다.
5. 골재의 평균 직경이 100 μm인 경우, 소비된 매체의 80%를 ROCKi 없이 신선한 mTeSR1로 대체합니다. 응집체가 직경 200-250 μm에 도달하면 소비된 모든 매체를 gfCDM(표1)으로대체하여 유기체가 생물 반응기의 바닥에 정착하게 합니다.
   참고: 평균 골지 직경이 350 μm을 초과하는 경우 분화 프로토콜이 시작되지 않습니다. 단일 셀의 파싱을 반복합니다. 일반적으로, 골재가 평균 직경 100 μm에 도달하는 데 약 1 일이 걸립니다.
6. 37°C, 습도 95%,_CO25%로 인큐베이터에 배치된 범용 기재부에 골재를 함유한 바이오액터를 삽입한다.
7. 생물 반응기 교반을 25 rpm으로 줄입니다.
8. 2일째에는 총 지름을 평가하기 위해 3.2, 3.3 및 3.4단계를 반복합니다. FGF2(최종 농도, 50 ng/mL) 및 60 μL의 SB431542(최종 농도, 10 μM)를 gfCDM 분화 배지의 60mL에 추가합니다(표1). 바이오 반응기에서 소비된 모든 매체를 보충 된 gfCDM으로 대체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
   참고: SB431542는 중자극성 분화를 억제하여 신경^{분화(24)를}유도하는 데 매우 중요합니다. FGF2는^{신경상피조직(25)의}소작을 촉진하는 데 사용된다.
9. 5일째에는 3.2, 3.3, 3.4, 3.8단계를 반복합니다.
   참고: 분화 프로토콜 중에 집계 크기가 증가해야 합니다. 그러나 이 매개 변수가 분화의 효능에 영향을 줄 수 있기 때문에 지름은 분화가 시작될 때만 중요합니다.
10. 7일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 희석 FGF2 및 SB431542 ~ 2/3: GfGF2의 20 μL및 SB431542 ~ 60mL의 40 μL을 gfCDM 분화 배지의 추가합니다. 바이오 반응기에서 소비된 모든 매체를 보충 된 gfCDM으로 교체하십시오. 단계 3.6을 반복하고 생물 반응기 교반을 30 rpm으로 증가시면 됩니다.
11. 14일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 60 μL의 FGF19(최종 농도, 100 ng/mL)를 gfCDM 분화 배지의 60mL에 추가합니다. FGF19로 보충 된 gfCDM으로 생물 반응기에서 소비 된 모든 매체를 교체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: FGF19는 중형 뇌^{구조(26)의}편광을 촉진하는 데 사용된다.
12. 18일째에는 3.2, 3.3, 3.4, 3.11단계를 반복합니다.
13. 21일, 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 생체 반응기에서 소비된 모든 배지를 완전한 신경 물질배지(표 1)로대체합니다. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: 신경분유 배지는 오르가노이드⁷내의 신경 세포 집단을 유지하는 데 사용되는 기저 배지이다.
14. 28일, 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 완전한 신경 물질 매체의 60 mL에 SDF1 (최종 농도, 300 ng /mL)의 180 μL을 추가합니다. SDF1로 보충된 완전한 신경 물질 매체로 생물 반응기에서 보낸 모든 매체를 교체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: SDF1은 뚜렷한 세포^층(27)의조직을 용이하게 하기 위해 사용된다.
15. 35일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 생물 반응기에서 소비된 모든 매체를 완전한 BrainPhys배지(표 1)로대체합니다. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: BrainPhys는 신디사이저 활성^{뉴런(28)을}지원하는 뉴런 배지이다.
16. 3일마다 총 볼륨의 1/3을 완전한 BrainPhys 배지로 교체하여 90일째까지 분화할 수 있습니다.

4. 극저온절제 및 면역조직화학을 위한 오르가노이드 준비

1. 면역 염색을 위한 오르가노이드 컬렉션
   1. 생물 반응기에서 15mL 원문 튜브에 서학적 파이펫을 함유한 유기체를 함유한 배지 샘플 1mL을 수집합니다.
      참고: 오르가노이드는 7일, 14일, 21일, 35일, 56, 70, 80 및 90일을 포함한 분화의 효능을 평가하기 위해 다른 시점에서 수집되어야 한다.
   2. 1× PBS의 1mL로 상체를 제거하고 한 번 씻으시면 하십시오.
      참고: 오르가노이드를 원심분리하지 마십시오. 오르가노이드가 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착하자.
   3. 상체를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 1 mL을 추가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 소비된 PFA를 제거하고 1× PBS의 1mL를 추가합니다.
   4. 1× PBS의 1mL에 1× PBS를 보관하여 극저온 절제를 위해 처리할 때까지 보관하십시오.
      참고: 고정 후 1주일 이상 비건구를 1x PBS에 보관하십시오.
2. 저온절을 위한 오르가노이드 준비
   1. 저장된 오르가노이드에서 상체를 제거합니다. 15% 자당 1mL(1× PBS로 희석됨)을 넣고, 부드러운 소용돌이로 잘 섞고, 하룻밤 사이에 4°C에서 배양합니다.
   2. 15% 자당/7.5% 젤라틴(표2)의용액을 준비하고 젤라틴을 피하기 위해 준비하는 동안 37°C로 유지한다.
   3. 15% 자당 용액을 제거하고, 15% 자당/7.5%의 젤라틴을 가루노이드에 넣고 부드러운 소용돌이로 빠르게 섞습니다. 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션.
   4. 15% 자당/7.5% 젤라틴 용액을 플라스틱 용기에 최대 절반까지 추가합니다. RT에서 응고를 기다립니다.
   5. 1h 인큐베이션 후, 파스퇴르 파이펫으로 고화된 젤라틴에 오르가노이드를 함유한 자당/젤라틴 방울을 조심스럽게 놓습니다. RT에서 약 15분 동안 굳어둡니다. 거품 형성을 피하십시오.
   6. 용기가 채워지을 때까지 15% 자당/7.5%의 젤라틴을 오르가노이드 위에 놓습니다. RT에서 완전한 응고를 기다립니다.
   7. 응고 후 4 °C에서 20 분 인큐베이션하십시오.
   8. 젤라틴을 중앙에 오르가노이드가 들어 있는 큐브로 자르고 O.C.T. 화합물 한 방울로 골판지 조각에 젤라틴 큐브를 고정합니다.
   9. 500mL 컵에 250mL의 이소펜탄을 넣고 액체 질소로 적절한 용기를 채웁니다. 집게와 두꺼운 장갑을 사용하여 액체 질소 표면에 이스펜타네가 함유된 컵을 조심스럽게 놓고 이스펜타네를 -80°C로 냉각시하십시오.
   10. -80°C에 도달하면 젤라틴 큐브를 동결될 때까지 이스펜타네가 함유된 컵에 넣고 온도를 -80°C로 유지합니다. 큐브 크기에 따라 1-2분 정도 걸릴 수 있습니다.
       참고: 큐브가 균열될 수 있으므로 -80°C 이하의 온도 또는 과도한 동결 시간을 피하십시오.
   11. 냉동 시 젤라틴 큐브를 -80°C에 빠르게 보관하고 저온절이 될 때까지 보관하십시오.
3. 오르가노이드의 냉동 절제
   1. 저온을 켜고 -25°C에서 시편(OT) 및 저온챔버(CT) 온도를 모두 정의합니다.
   2. 두 온도가 안정되면 O.C.T. 화합물을 사용하여 시편에 오르가노이드를 함유하는 젤라틴 큐브를 수정합니다.
   3. 12 μm에서 단면 두께를 정의합니다.
   4. 큐브를 자르고 접착 현미경 슬라이드에서 3-4 개의 조각을 수집합니다 (재료 표참조).
   5. 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
4. 오르가노이드 슬라이스의 면역 염색
   1. 최대 10개의 슬라이드를 앞뒤로 유지하면서 50mL의 예온 된 1 x PBS가있는 코클 항아리에 오르가노이드 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
      참고: 모든 오르간성 섹션은 액체와 침수되어야 합니다.
   2. 슬라이드를 해독하기 위해 37 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
   3. RT에서 50mL의 1× PBS로 1x를 세척: 슬라이드를 신선한 1× PBS가 들어있는 코클 링 병으로 옮기.
   4. 새로 준비된 글리신(표2)의50mL를 포함하는 코플 항아리로 슬라이드를 옮기고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
   5. 슬라이드를 0.1% 트리톤(표2)의50mL를 함유한 코플 항아리로 옮기고 RT에서 10분 동안 투과합니다.
   6. 1× PBS로 5 분 2 초 동안 씻으시면 하십시오.
   7. 1× PBS에 담근 3mm 종이로 면역 염색 접시를 준비하십시오. 슬라이스 주위에 티슈가 있는 드라이 슬라이드를 3mm 종이에 놓습니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하면 슬라이드당 ~0.5mL로 블로킹 용액(표2)으로슬라이드의 전체 표면을 덮습니다. RT에서 30분 동안 배양하십시오.
   8. 과도한 차단 용액을 제거하고 슬라이스 주위에 조직으로 슬라이드를 건조시십시오. 1차 항체의 50 μL(표3)을단면 에 걸쳐 차단용으로 희석하고 커버립으로 덮습니다. 이전에 준비된 면역 염색 접시에 슬라이스를 놓습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   9. 슬라이드를 TBST(표2)의50mL로 코플 병으로 옮기고, 커버립이 떨어지게 하고 TBST로 5분 3배 동안 세척합니다.
   10. 이차 항체의 50 μL을 단면 에 걸쳐 차단 용액에 희석시키고 커버입술로 덮습니다. 이전에 준비된 면역 염색 접시에 슬라이스를 놓습니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   11. 슬라이드를 다시 코플 항아리로 옮기고 5분 3배의 TBST50mL로 세척합니다.
   12. 슬라이스 주위에 조직으로 슬라이드를 건조하고 이전에 준비 된 면역 염색 접시에 조각을 배치합니다. 파스퇴르 파이펫으로 슬라이드의 전체 표면에 0.5mL의 DAPI 솔루션을 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양하십시오.
   13. 4.4.9 단계를 반복합니다.
   14. 조심스럽게 조직으로 슬라이드를 건조. 슬라이드를 따라 드롭하여 중간 크기의 장착 량 50 μL을 추가한 다음 각 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 낮추고 거품을 피하기 위해 약간 구부립니다.

프로토콜은 0.1 L 생물 반응기(도1A)를사용하여 세포 응집을 촉진함으로써 시작되었다. iPSC의 단일 세포 접종은 27 rpm의 교반 속도를 가진 매체의 60 mL에서 250,000 세포/mL 시드로 수행되었다. 이는 0일로 정의되었습니다. 24시간 후, 세포는 스페로이드 모양의 골재(1일째, 도 1B)를효율적으로 형성하고, 형태는 5일째까지 잘 유지되었고, 크기가 점진적으로 증가하여 시간이 지남에 따라 골체 형태와 크기에서 높은 수준의 균질성을 입증하였다. (그림1B). 현미경 검사법에 의한 정량적 분석은 또한 1일(도1C)까지의 골재 크기의 정상적인 분포를 드러냈다. 골재 크기는 세포가 서로 다른^{혈통(29,,30)으로}분화하도록 자극할 수 있는 중요한 물리적 매개변수이다. 이러한 이유로, 효율적인^신경31,,32 및 소뇌^{약정(21)을}유도하기 위해 이전 연구에서 보고된 골재 크기에 기초하여, 생성된 골재는 분화를 시작하기 전에 원하는 직경에 도달할 때까지 25rpm에서 mTeSR1 배지에서 유지되었다(~200 μm). 2일째, 평균 직경은 F002 ±.1A.13 세포주용 54.4 μm(평균 ± SD)과 iPSC6.2 세포주에 대한 212.1 ± 42.1 μm이었다. 이와 같이, 두 세포주 모두 이 시점에서 최적의 골재 크기를 달성하였다(도1C).

iPSC의 파종이 0일째로 수행된 날을 정의하고, 원하는 골지름을 달성한 후, 신경 약념은 SB431542, FGF2 및 인슐린을 사용하여 동시에 유도되었으며, 신경 절제술 분화를 촉진하고 중간 힌드뇌 패턴화에 필요한 중간 힌드뇌 패턴화에 필요한 중간 형골화를 촉진했다. 그 후, FGF19와 SDF1은 각각 14일과 28일에 다른 소뇌 선조의 생성을 촉진하기 위해 문화에 첨가되었다. 신경 유도의 첫 날에는 25rpm의 회전 속도가 사용되었으며, 이는 더 큰 골재의 축적 및 응집을 피하기 위해 7 일 후에 30 rpm으로 증가하였다(그림2A). 분화 하는 동안, 오르가노이드는 발광 공간을 가진 신경관 같이 구조물과 유사한 더 뚜렷한 상피화를 보였다(도 2B). 또한, 오르가노이드 직경 분포의 평가는 14일째(도2B)까지초기 소뇌 약정 동안 균일한 크기 분포를 보였다.

면역형광 분석은 FGF2 및 SB431542를 첨가한 후 이미 7일째까지 iPSC 유래 오르가노이드의 효율적인 신경 약정이 달성된다는 것을 뒷받침한다. 오르가노이드의 저온절은 PAX6 및 NESTIN에 대한 신경관 염색을 연상시키는 많은 구조를 드러냈으며, 구도가이성 내대부분의 세포가 7일과 14일에 전구 마커 NESTIN을 발현하는 분화(도2C)를공개했다. 그 후, FGF19 및 SDF1은 지속적으로 증식하는 전구층(PAX6^+)의생성을 촉진하고 효율적인 뉴런 분화가 달성되었으며, TUJ1, 뉴런 특이적 클래스 III 베타-튜룰린의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 21일과 35일(도2C)까지. 또한, 0.1 L 폭스바겐 바이오반응기에서 21일 후에도 효율적인 소뇌 분화가 관찰되었으며, 과립 세포 전구(BARLH1+ 세포, 도 3A)및 퍼킨제 세포 전구(OLIG2+⁺ 세포, 도 3B)의존재에 의해 입증되었다.⁺ 배양에서 35일 후, 오르가노이드 내의 다른 세포 집단은 뚜렷한 층으로 조직되는 것으로 나타났다. 오르가노이드 내의 다양한 평평한 타원형 구조물은 이러한 타원형 구조물의 발광 영역에서 오르가노이드(도3C,D)및 SOX2^+의 피상적 측면에 연속층으로서 BARHL1+ 등쪽 소뇌 전조자로 관찰되었다(도3D).⁺ 또한, TUJ1⁺ 신생아 뉴런은 표면을 향해 이동하는 것으로 나타났으며, 오르가노이드의 바깥면에 방사형 정렬을 재확립하였다(도3E).

소뇌 선조의 생성 후, 추가 성숙은 Neurotrophic 요인 BDNF와 GDNF로 보충BrainPhys 매체^28을 사용하여 승진되었다. 유기성 저온 섹션의 면역 형광 염색은 소뇌 뉴런의 뚜렷한 특수형을 검출하는 데 사용되었습니다. 퍼킨제 세포, 칼슘 결합 단백질 칼빈딘을 발현하는 GABAergic 뉴런(CALB, 도 3F)은성숙 프로토콜 후 소뇌 유기성에서 검출되었다. 또한, 또 다른 주요 소뇌 뉴런 타입인 과립 세포는 PAX6 및 MAP2(도3G)를코발하는 세포의 하위 집합으로 확인되었다. 흥미롭게도, MAP2를 발현하지 않는 PAX6⁺ 선조의 풀은 분화의 80 일까지 유지되었다. 다른 유형의 소뇌 뉴런도 TBR2(도3H)를발현하는 단극성 브러시 세포와 TBR1(도3I)을발현하는 심층 소뇌 핵 프로젝션 뉴런을 포함하여 검출되었다. 효율적인 소뇌 분화 및 성숙 외에도 PBS 0.1 L 폭스바겐 바이오 리액터를 이용한 이 3D 동적 배양 시스템은 장기형이 세포 사멸 및 괴사(그림3J)없이최대 90일 동안 생존할 수 있도록 허용하였다.

그림 1: 확장 가능한 생물 반응기를 사용하여 크기 제어 응집체 생성. (A)생물 반응기의 설계 기능. (B)1일, 2일, 5일에 두 개의 상이한 iPSC 라인에서 골재를 보여주는 브라이트필드 포토마이크로그래프. 스케일 바 = 100 μm. (C)생물 반응기에서 상이한 iPSC 라인에서 부동 응집물의 크기 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 0.1 L 생물 반응기를 사용하여 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 생성. (A)소뇌 유기인에 iPSC의 분화를 유도하는 배양 절차의 회로도 표현. 세포는 250,000개의 세포/mL의 밀도로 시드되었고 27rpm의 교반 속도는 세포 응집을 촉진하는 데 사용되었다. 분화의 첫 날 동안, 골재는 25 rpm의 교반 속도로 유지되었다. 그 후, 더 큰 골재의 축적을 피하기 위해, 교반 속도는 30 rpm으로 증가되었다. (B)오르가노이드 모양과 크기의 특성화. 0.1 L 폭스바겐 바이오리소터에서 소뇌 분화 시 iPSC 유래 오르가노이드를 보여주는 브라이트필드 포토마이크로그래프. 스케일 바 = 100 μm. 오르가노이드 직경의 분포는 배양이 분화 프로토콜을 따라 균일한 오르가노이드 크기를 유지한다는 것을 보여줍니다. (C)iPSC 유래 오르가노이드의 효율적인 신경 유도. 소뇌 분화 시 NESTIN, PAX6 및 TUJ1에 대한 면역 형광. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 효율적인 소뇌 분화 및 성숙. (A-E) 효율적인 소뇌 약속. 소뇌 분화 프로토콜의 표시된 시점에서 BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD 및 TUJ1 마커에 대한 면역 염색 분석. (F-I) 인간 iPSC 유래 소뇌 유기성의 효율적인 성숙. Purkinje 세포 (CALB, F), 과립 세포 (PAX6 및 MAP2, G), 단극성 브러시 세포 (TBR2), 깊은 소뇌 핵 프로젝션 뉴런 (TBR1)을 포함하여 다른 유형의 소뇌 뉴런을 나타내는 면역 불소. (J)소뇌 후 높은 세포 생존. 유기체의 라이브 /죽은 (calcein-AM, 녹색 및 프로피듐 요오드, 빨간색) 유기체의 염색은 높은 세포 생존력과 생물 반응기에서 80 일 후에 괴사 영역의 증거를 보여주지 않았다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 스톡 솔루션 및 미디어 준비. 나열된 iPSC 유지 보수 및 분화 프로토콜뿐만 아니라 성장 인자와 소분자의 재고 솔루션에 대한 미디어를 준비하는 데 사용되는 모든 구성 요소 및 볼륨입니다. 재고 솔루션의 경우 모든 재고 농도 및 재구성 프로토콜이 나열됩니다.

표 2: 저온절제 및 면역염색을 위한 오르가노이드 의 준비를 위한 솔루션. 나열된 모든 구성 요소와 냉동 절제 및 면역 스테인링을위한 오르가노이드의 제조에 사용되는 솔루션을 준비하는 데 사용되는 볼륨입니다.

표 3: 1차 항체. 면역염색에 사용되는 1차 항체, 복제 및 최적화된 희석제가 나열됩니다.

신약 스크리닝 및 재생의학 적용을 위한 특정 세포 유형을 생성하는 정된 배양 조건뿐만 아니라 큰 세포 수의 필요성은 확장 가능한 배양 시스템의 개발을 주도하고 있다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 그룹은 신경 선조 및 기능성^{뉴런32,,33,,34의}확장 가능한 생성을 보고하고, 신경 퇴행성 장애를 위한 새로운 모델의 발달에 있는 중요한 발전을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 배아 발달의 일부 중요한 사건의 회수는 여전히 부족하며, 장기간 현탁액에서 생성된 기능성 뉴런의 유지는 아직^34로달성되지 않았다. 여기에 제시된 동적 3D 배양 시스템은 소뇌 정체성으로 iPSC 유래 신경 오르가노이드를 생성하고, 동적 배양에서 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 기능성 소뇌 뉴런으로 성숙을 더욱 촉진할 수 있습니다.

소뇌 분화를 시작하기 전에 인간의 iPSC의 품질을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서, 차별화를 손상시키지 않으려면, iPSC의 3개 이상의 구절은 해동에서 생물반응기 접종까지 수행되어야 한다. 차별화 프로토콜의 중요한 단계는 집계 크기를 평가하는 것입니다. 골재 크기는 특정 세포^{계보(29)를}향한 분화를 유도하는 데 중요한 역할을 한다. 그 외에, 차별화를 선호하는 것으로 보이는 최소 크기 임계값이^있다(35). 이미 보고된 바와 같이, 효율적인 신경^{약정(31,,32)} 및 소뇌^{분화(21)를} 촉진하는 최적의 iPSC 유래 골체 직경은 ~200 μm 직경이다.

또한 이 동적 프로토콜에서는 배양 첫 날에 사용되는 교반 속도는 골지름과 신경 유도를 제어하는 데 매우 중요합니다. 문화는 iPSC 집계를 촉진하고 더 큰 골재의 형성을 피하기에 충분한 27 rpm에서 시작되었습니다 (350 μm 이상의 직경은 피해야한다). 단 하나 세포 파종 후에 세포 집계를 승진시키기 위하여 이용된 동요는 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않고 30 rpm로 증가할 수 있었습니다; 그러나 교반 속도가 높을수록 집계 속도가 작을 것으로 예상됩니다. iPSC 라인에 따라, 27 rpm을 사용하여 세포 파종 후 24 시간, 두 가지 시나리오가 예상된다 : 형성 된 골재는 더 작은 직경 (&200 μm)을 형성하거나 200-300 μm 사이의 크기의 범위에 도달했다. 체재가 세포 파종 후 24시간에서 350 μm보다 큰 경우 분화가 수행되어서는 안 되며, 세포 파종은 분화의 효율이 매우 낮기 때문에 반복되어야 한다. 골재가 200 μm보다 작은 경우 소비된 매체를 iPSC 유지 보수 매체로 교체하고 교반 속도가 25rpm으로 감소해야 합니다. 이러한 조정을 통해 집계 직경은 교반 속도의 감소에 의해 승격된 개별 골재의 병합으로 인해 1일부터 2일까지 증가할 것으로 예상됩니다. 200~300 μm 사이의 크기의 응집체의 경우, 소비된 배지를 분화 매체로 대체해야 하며, FGF2를 통한 신경 유도는 2일 후에 문화권에서 시작되어야 한다. 이 시점에서, 세포가 분화 매체의 존재시 전단 응력에 더 민감하기 때문에, 동요 속도는 또한 과도한 세포 사멸을 방지하기 위하여 약간 감소되어야 합니다. 또한, 방정식에 따라 표준 편차를 집계 직경의 평균과 상호 연관시킴으로써 가변성을 측정하는 변형 계수(CV)를 사용하여 인구 균질성을 분석할 수 있습니다.

δ 골지름의 표준 편차를 나타내고 μ 평균 직경입니다. 본 동적 시스템에서 관찰된 평균 CV는 F002.1A.13 세포주 대비 12.5± 3.3%(평균 ± SD)였으며, 2일째iPSC6.2 세포주에 대해 19.0± 0.37%였다. 따라서 이 시스템에서는 이력서가 0.2(&20% 변동)인 균일한 크기 집단이 예상됩니다. 7일간의 분화 후, 평균 골지 직경은 300~360μm에서 범위로, 교반 속도는 30rpm으로 증가하여 골재가 0.1 L 폭스바겐 바이오 반응기의 바닥에 정착하는 것을 방지했다.

35일까지 소뇌 유기체의 분화및 정전기 조건에서의 집계 크기의 분석은 최근^21을보고되었다. 저자는 3D 골재가 플레이트(예: 아그레웰)에서 형성되고 유지되어 7일째까지 균일한 크기와^{모양(21)을}보였다. 그러나, 골재를 초저부착 6 웰 배양판으로 옮김한 후, 골재는 크기 및^{형태학(21)의}크기와 형태에 따라 달라지기 시작했다. 35일째에 정전기 조건에서, 일부 3D 골재는 다른 세포주에 대해 1,000 μm에 도달하여 영양소와 산소의 확산을 제한했습니다. 대조적으로, 우리의 동적 조건을 사용하여, 골재는 수직 바퀴에 의해 승진 된 매체의 일정한 동요로 인해 개선 된 질량 전달과 함께, 35 일까지 직경 800 μm 이상에 도달하지 않았다. 또한, 응집크기는 성숙과정이 끝날 때까지 유지되었고, 90일까지 총 직경 646.6± 104.2 μm을 나타내며, 이는 0.1 L 폭스바겐 바이오리액터에서 가장 긴 배양물이었다.

효율적인 소뇌 유도는 이 3D 동적 시스템에 SB431542, FGF2, FGF19 및 SDF1을 순차적으로 첨가함으로써 유도되었다. 프로토콜은 세포피분화를 억제하는 변형성장인자 베타(TGF-ß)-수용체 차단제인 SB431542와 신경피상 조직의 소염에 큰 영향을 미치는 FGF2의 조합으로^{시작한다.} 따라서, 문화의 첫 날 동안 이들 두 분자의 첨가는 중뇌, 소뇌 조직을 초래하는 영역으로 세포 분화를 촉진하는 데 필수적이다. 중뇌 조직에 초기 유도 후, 등대-복부 극성을 가진 중형 뇌 구조의 자발적인 생성을 촉진하기 위한 FGF19를 추가할 필요가 있으며, 다른 소뇌 선조의^{생성(36,,26)이}필요하다. SDF1은 소뇌 신경 발생이^27에서발생하는 발달 단계에서 볼 수 있듯이 소뇌 선조의 뚜렷한 층의 조직을 용이하게한다. 35일째까지, 이 분자는 첫번째 삼보격 소뇌에 해당하는 인간 소뇌 발달을 recapituuulate 수 있는 소뇌 오르간로이드의 조직을 승진시킬 수 있습니다. 다른 층으로 소뇌 선조의 조직 후, 정의 된 신경 매체는 자신의 성숙을 촉진하는 데 사용되었다^28. 신경 세포를 유지 하기 위해 사용 하는 다른 매체또한 테스트 될 수 있습니다., 하지만 낮은 효율성 예상. 따라서, 본 프로토콜에서, BrainPhys는 소뇌 신경으로 소뇌 커밋된 세포의 분화를 촉진하는 데 사용되었으며, 이는 건강한 뉴런 환경을 더 잘 모방하고 생성된^{뉴런(28)의}신경생리활성을 지원하는 것으로 보고되었기 때문이다.

이러한 동적 조건을 사용하여 영양소, 산소 및 성장 인자의 보다 효율적인 확산을 달성할 수 있습니다. 그러나 일부 제한은 분화 프로토콜에 사용되는 교반과 관련이 있습니다. 일부 전단 응력은 세포의 생존, 증식 및 분화에 영향을 미칠 수있는 동요 과정에 의해 도입 될 수 있습니다. 따라서 세포가 더 민감하게 반응하는 성숙 단계 동안 배양을 주의 깊게 모니터링해야합니다.

인간 배아 소뇌 발달을 연상시키는 소뇌 유기성 의 분화는⁷이미 7보고되었다. 그러나, 3D 배양을 사용하여 소뇌 뉴런으로 이러한 배아 소뇌 유기성의 추가 성숙은 도전 남아있다. 기능성 소뇌 뉴런의 생성은 다양한 소스^{,4,7,715로부터}과립 세포와 결합하여 달성되었다. 이 프로토콜은 성공적으로 인간 iPSC의 소뇌 약속을 강화; 또한, 이것은 피더 세포와 교화하지 않고 3D 배양 시스템에서 상이한 소뇌 뉴런의 분화를 위한 첫 번째 프로토콜이다. 구체적으로, 다음 세포 유형은 우리의 동적 배양 시스템에서 생성될 수 있다: Purkinje 세포 (Calbindin^+),과립 세포 (PAX6⁺/MAP2^+),단극성 브러시 세포 (TBR2^+),깊은 소뇌 핵 프로젝션 뉴런 (TBR1^+),3 개월 동안 현탁액에서 유지되었다.

소뇌 유기인의 확장 가능한 생성은 소뇌의 배아 발달과 이 기관의 변성과 관련된 병리학적 경로를 연구하기위한 귀중한 도구를 나타냅니다. 더욱이, 소뇌 기능을 복원하는 분자에 대한 높은 처리량 스크리닝은 이 확장 가능한 시스템으로 얻은 오르가노이드를 사용하여 수행될 수 있다. 전반적으로,이 방법은 다양한 생체 의학 응용 프로그램에 중요 할 수있는 고품질 소뇌 오르가노이드의 생성을위한 확장 가능한 프로토콜에 대한 충족되지 않은 필요성을 만족시화합니다.

저자 YH와 SJ는 PBS 생명 공학의 직원입니다. 저자 BL은 PBS 생명 공학, Inc.의 CEO 겸 공동 설립자입니다. 이 협력 저자는 원고에 사용되는 생물 반응기의 개발에 참여했다. 이것은 데이터와 자료 공유에 대한 저널의 모든 정책을 저자의 준수를 변경하지 않습니다. 다른 모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 작품은 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), 포르투갈 (UIDB/04565/2020 통해 Programa Operacional 지역 드 리스보아 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 년 T.P.S 및 PD/BD/128376/2017 - D.E.S.N.까지, FEDER(POR 리스보아 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa 포르투갈)이 공동 자금을 지원하는 프로젝트 2020) 및 FCT는 C-정밀 LISBOA-01-0145-FEDER-016394 및 CEREBEX 세대의 실조 연구 보조금 LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 기금은 또한 유럽 연합의 호라이즌2020 연구 혁신 프로그램으로부터 보조금 협정 번호 739572-재생 및 정밀 의학 H2020-2016-2017에 따라 수령되었습니다.