דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

המוח הקטן ממלא תפקיד קריטי בתחזוקה של איזון וקואורדינציה מוטורית, פגם תפקודי בנוירונים המוח שונים יכול לעורר תפקוד המוח הקטן. רוב הידע הנוכחי על פנוטיפים עצביים הקשורים למחלות מבוסס על רקמות שלאחר המוות, מה שהופך את ההבנה של התקדמות המחלה ופיתוח קשה. מודלים של בעלי חיים וקווי תאים מונצחים שימשו גם כמודלים להפרעות ניווניות. עם זאת, הם אינם לגמרי לסיכום מחלות אנושיות. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs) יש פוטנציאל גדול עבור מידול מחלות ולספק מקור יקר ערך עבור גישות רגנרטיביות. בשנים האחרונות, הדור של אורגנואידים מוחיים מ-iPSCs הנגזרים ממטופל שיפר את הסיכויים למודלים של מחלות ניווניות. עם זאת, פרוטוקולים המייצרים מספר גדול של אורגנואידים ותשואה גבוהה של נוירונים בוגרים במערכות תרבות 3D חסרים. הפרוטוקול שהוצג הוא גישה חדשה לדור רפרודוק ומדרגי של אורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC בתנאים המוגדרים כימית באמצעות ביו-כוערים חד-פעמיות מדרגיים, שבהם אורגנואידים רוכשים זהות מוחית. האורבנואידים שנוצרו מאופיינים בביטוי של סמנים ספציפיים הן ברמת mRNA והן ברמת החלבון. הניתוח של קבוצות ספציפיות של חלבונים מאפשר זיהוי של אוכלוסיות שונות של תאים המוח הקטן, אשר התיור חשוב להערכת מבנה אורגנואיד. cryosectioning אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד משמשים כדי להעריך את הנוכחות של אוכלוסיות ספציפיות של תאים המוח הקטן והארגון המרחבי שלהם.

הופעתם של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (PSCs) מייצגת כלי מצוין לרפואה רגנרטיבית ומידול מחלות, כי תאים אלה יכולים להיות מובדילים לתוך רוב תוחוני התא של גוף^{האדם 1,,2}. מאז הגילוי שלהם, פידול PSC באמצעות גישות מגוונות דווח המודל מחלות שונות, כולל הפרעות ניווניות^3,,4,,5,6.

לאחרונה, היו דיווחים על תרבויות 3D נגזר PSCs דומה מבנים מוחיים אנושיים; אלה נקראים אורגנואידים במוח^3,,7,,8. הדור של מבנים אלה הן PSCs בריא וסבלני מספק הזדמנות רבת ערך כדי מודל התפתחות אנושית והפרעות נוירו-התפתחותיות. עם זאת, השיטות המשמשות ליצירת מבנים מוחיים מאורגנים היטב אלה קשה להגיש בקשה לייצור בקנה מידה גדול שלהם. כדי לייצר מבנים גדולים מספיק כדי לתמצת מורפוגנזה רקמה ללא נמק בתוך organoids, פרוטוקולים להסתמך על המחויבות העצבית הראשונית בתנאים סטטיים, ואחריו אנקפולציה הידרוג'לים ותרבות עוקבות^{במערכות דינמיות 3}. עם זאת, גישות כאלה עשויות להגביל את קנה המידה הפוטנציאלי של ייצור אורגנואידים. למרות נעשו מאמצים לכוון את בידול PSC לאזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, סטריאטל, המוח האמצעי, ונוירונים חוט השדרה^9,10,11,12, הדור של אזורי מוח ספציפיים בתנאים דינמיים הוא עדיין אתגר. בפרט, הדור של נוירונים המוח הקטן בוגר במבנים 3D עדיין לא תואר. Muguruma ואח '. חלוץ הדור של תנאי תרבות כי סיכום^{מוקדם המוח הקטן פיתוח 13} ולאחרונה דיווח פרוטוקול המאפשר לתאי גזע עובריים אנושיים ליצור מבנה מקוטב המזכיר את המוח הקטן של השליש^{הראשון 7}. עם זאת, התבגרות של נוירונים המוח הקטן במחקרים שדווחו דורש תנתק של אורגנואידים, מיון של נבונות המוח הקטן, וcoculture עם תאי ההזנה^{במערכת תרבות מונו-שכבתית 7,14,15,16}. לכן, הדור הניתן לשחזור של אורגנואידים המוח הקטן הרצוי עבור מידול מחלות בתנאים מוגדרים הוא עדיין אתגר הקשורים תרבות ושונות מקור מאכיל.

פרוטוקול זה מציג תנאי תרבות אופטימליים להרחבת תלת-מיתד ובידול יעיל של PSCs אנושיים לנוירונים המוחליים באמצעות ביו-סיבה של גלגל אנכי חד-ספרתי (ראה טבלת חומרים למפרטים), הנקראים להלן ביו-כואבי החיים. ביו-גורם מצוידים במדחף אנכי גדול, אשר בשילוב עם תחתית בצורת U, לספק התפלגות גייה הומוגנית יותר בתוך כלי השיט, המאפשר עדין, ערבוב אחיד ומתלי חלקיקים עם מהירויות תסיסה^{מופחתת 17}. עם מערכת זו, ניתן להשיג אגרגטים של תאים הנשלטים על-ידי צורה וגודל, דבר שחשוב להבדיל הומוגני ויעיל יותר. יתר על כן, מספר גדול יותר של אורגנואידים נגזר iPSC ניתן ליצור באופן פחות מייגע.

התכונה העיקרית של organoids, שהם מבנים רב תאיים 3D בדרך כלל נוצר מתאי גזע, הוא ארגון עצמי של סוגי תאים שונים שיוצרים צורות ספציפיות כמו אלה לראות מורפוגנזה^{אנושית 18,,19,20}. לכן, מורפולוגיה אורגנואידית היא קריטריון חשוב שיש להעריך במהלך תהליך ההבחנה. Cryosectioning של אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד עם קבוצה ספציפית של נוגדנים לאפשר הדמיה מרחבית של סמנים מולקולריים לנתח התפשטות תאים, בידול, זהות אוכלוסיית התא, אפופטוזיס. עם פרוטוקול זה, על ידי קריוסות אורגנואידים חיסוניות, מחויבות עצבית יעילה ראשונית נצפתה על ידי היום^ה-7 של בידול. במהלך בידול, מספר אוכלוסיות תאים עם זהות המוח הקטן נצפו. לאחר 35 ימים במערכת דינמית זו, neuroepithelium המוח הקטן מארגן לאורך ציר apicobasal, עם שכבה apical של פרוגניטורים משגשגים ונוירונים פוסט מיתוטיים הממוקמים בהתבססות. במהלך תהליך ההתבגרות, מימים 35-90 של בידול, ניתן לראות סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן, כולל תאי Purkinje (קלבינדין⁺), תאי גרגר (PAX6⁺/ MAP2⁺), תאי גולגי (Neurogranin^{+ ),}תאי מברשת חד קוטביים (TBR2⁺), ונוירונים הקרנת גרעין המוח הקטן עמוק (TBR1⁺). כמו כן, כמות לא משמעותית של מוות תאים נצפתה באורגנואידים המוח הקטן שנוצר לאחר 90 ימים בתרבות.

במערכת זו, אורגנואידים הנגזרים על-ידי IPSC אנושיים מתבגרים לנוירונים המוח שונים ושורדים עד 3 חודשים ללא צורך בתחוך ומזון coculture, מתן מקור של נוירונים המוח הקטן האנושי עבור מידול מחלות.

1. מעבר ותחזוקה של iPSCs אנושיים בתרבות חד שכבתית

1. הכנת צלחות
   1. להפשיר את מטריצת קרום המרתף (ראה טבלת חומרים)מניות ב 4 מעלות צלזיוס ולהכין 60 μL aliquots. הקפא את האליציטוטים ב-20 מעלות צלזיוס.
   2. כדי לכסות את בארות של צלחת 6 באר, להפשיר aliquot אחד של מטריצת קרום המרתף על קרח. לאחר הפשרת להוסיף 60 μL כדי 6 מ"ל של DMEM-F12. בעדינות מחדש על ידי התקפלות למעלה ומטה.
   3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון מטריצת קרום מרתף מדולל לכל באר של 6 צלחת באר דגירה ב RT לפחות 1 שעה לפני מעבר או לאחסן ב 4 ° C עד שבוע.
2. מעבר מושבות IPSC עם EDTA
   1. שמור על iPSCs בתרבות המונו-שכבתית ב-6 לוחות באר באינקובטור ב-37°C, 95% לחות ו-5% CO_2.
      הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשלושה קווי iPSC אנושיים נפרדים: F002.1A.13²¹, קו iPSC אפיזומלי אנושי (iPSC6.2)²², ו-iPS-DF6-9-9T שהושגו באופן מסחרי.B (ראה טבלת חומרים).
   2. לפני המעבר, דגירה את הצלחות המאוחסנות (שלב 1.1) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות והכנו את המדיום mTesR1(טבלה 1).
   3. שאף את הפתרון מהצלחת באמצעות פיפטה סרולוגית ומיד להוסיף 0.5 מ"ל של mTeSR1 בינוני לכל באר.
   4. לשאוף את המדיום בילה מן הבאר המכילה iPSCs ולשטוף פעם אחת באמצעות 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA לכל באר.
   5. הוסף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA לכל באר ותדגם ב- RT במשך 5 דקות.
   6. שאפף EDTA ולהסיר את התאים מהבארות על ידי הוספת בעדינות mTeSR1 בינוני ו pipetting המושבות באמצעות micropipette P1000. לאסוף את התאים בצינור חסונים.
      הערה: אין לתאי פיפטה למעלה ומטה יותר מ- 3x.
   7. הוסף 1 מ"ל של מתלה תא (מדולל 1:4) לכל באר כך שכל באר מכילה 1.5 מ"ל של בינוני לאחר הוספת מתלי התא. החזר תאים לאקובטור ב- 5% CO₂, 37 °C.
   8. החלף את המדיום היומי והמעבר שהושקע כל 3 ימים כאשר 75%-80% התכנסות מושגת.

2. זריעת IPSCs אנושיים ביו-סיבה

1. iPSCs דגירה גדל כמו monolayers ב mTeSR1 בתוספת עם 10 μM של מעכבי רוק Y-27632 (ROCKi). מוסיפים 1 מ"ל של תוספת בינונית לכל באר מצלחת של 6 בארות של תרבות רקמות ותדגירה לשעה אחת ב-37°C, 95% לחות ו-5% CO_2.
   הערה: ROCKi משמש להגנה על iPSCs דיסוציאציה מפני אפופטוזיס²³.
2. לאחר 1 שעה של דגירה, לשאוף את המדיום בילה מכל באר ולשטוף 1x עם 1 מ"ל של 1× PBS לכל באר.
3. הוסף 1 מ"ל של תא ניתוק בינוני (ראה טבלת חומרים)לכל באר של צלחת 6 באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות עד תאים להתנתק בקלות מן הבארים עם רעד עדין.
4. פיפטה ניתוק התא בינוני למעלה ומטה עם micropipette P1000 עד התאים לנתק ולנתק לתאים בודדים. להוסיף 2 מ"ל של תא שלם תרבות בינונית לכל באר כדי להשבית עיכול אנזימטי פיפטה התאים בעדינות לתוך צינור חרלי סטרילי.
5. צנטריפוגה ב 210 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
6. להשתמש מחדש את גלולת התא במדיום תרבות (כלומר, mTeSR1 בתוספת 10 μM של ROCKi) ולספור את iPSCs עם hemocytometer באמצעות צבע כחול trypan.
7. זרע 15 × 10^{6 תאים} בודדים ביו-סיבה (נפח מרבי של 100 מ"ל) עם 60 מ"ל של mTeSR1 בתוספת 10 μM של ROCKi בצפיפות תא סופית של 250,000 תאים/ מ"ל.
8. הכנס את כלי המכיל את האיי.פי.אס ביחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב- 37°C, 95% לחות ו-5% CO_2.
   הערה: ההמולה של היצר הביולוגי נשמרת במשך 24 שעות על-ידי הגדרת בקרת יחידת הבסיס האוניברסלית ל- 27 סל"ד כדי לקדם את צבירת iPSC.

3. בידול והתבגרות של אגרגטים אנושיים הנגזרים על-ידי IPSC באורגנואידים מוחיים

1. הגדר את היום של זריעת תא יחיד כייום 0.
2. ביום הראשון, לאסוף 1 מ"ל של מדגם אגרגט iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית. שמור על הסיבה הביולוגית תחת עצבנות כמו בעבר על ידי הצבת יחידת הבסיס האוניברסלית עם bioreactor המכיל את הצבירות בזרימה סטרילית לפני איסוף הדגימה. לוח מתלה התא בחיבור אולטרה נמוך 24 צלחת גם. ודא שנוצרים אגרגטים הנגזרים מ- iPSC.
3. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אופטי באמצעות הגדלה כוללת של 40x או 100x כדי למדוד קוטר מצטבר.
4. מדוד את אזור הצבירות בכל תמונה באמצעות תוכנת FIJI.
   1. בחר "נתח | הגדר מדידות" משורת התפריטים ולחץ על "אזור" ו "אישור".
   2. בחר "קובץ | פתחאת " משורת התפריטים כדי לפתוח קובץ תמונה מאוחסן. בחרו בכלי בחירת הקו המוצג בשורת הכלים וצור קו ישר מעל סרגל קנה המידה המוצג בתמונה. בחר "נתח | הגדר קנה מידה" משורת התפריטים.
   3. ב- "מרחק ידוע"הוסף את המרחב של סרגל קנה המידה של התמונה ב- μm. הגדר את "יחידת אורך" כμm. לחץ על "כללי" כדי לשמור על ההגדרות "אישור". בחרו 'בחירה סגלגלה' בשורת הכלים.
   4. עבור כל צבירה, תכלית את האזור בעזרת הכלי הסגלגל. בחר "נתח | "למדוד". חשב את הקוטר שלהם בהתבסס על שטח נמדד, בהתחשב בכך שאצרגטים הם כדוריים בערך באמצעות
      
      עם A כאזור הצבירה.
5. כאשר הקוטר הממוצע של הצבירות הוא 100 μm, להחליף 80% של המדיום בילה עם mTeSR1 טרי ללא ROCKi. כאשר אגרגטים מגיעים 200-250 μm קוטר, להחליף את כל המדיום בילה עם gfCDM (טבלה 1), לתת אורגנואידים להתיישב בתחתית bioreactor.
   הערה: אם קוטר הצבירה הממוצע עולה על 350 μm אל תתחיל את פרוטוקול ההבידול. חזור על זריעת תאים בודדים. בדרך כלל, זה לוקח סביב 1 יום עבור הצבירה להגיע קוטר ממוצע של 100 μm.
6. הכנס את הסיבה הביולוגית המכילה את הצבירות ביחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב- 37°C, 95% לחות ו- 5% CO₂.
7. הפחת את התסיסה של הסיבה הביולוגית ל- 25 סל"ד.
8. ביום השני, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4 כדי להעריך את הקוטר הצבור. להוסיף 30 μL של FGF2 (ריכוז סופי, 50 ng/mL) ו 60 μL של SB431542 (ריכוז סופי, 10 μM) כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני(טבלה 1). החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM תוסף. חזור על שלב 3.6.
   הערה: SB431542 הוא חיוני כדי לעכב בידול mesendodermal, גורם בידול עצבי²⁴. FGF2 משמש כדי לקדם את הקוודליזציה של רקמת neuroepithelial²⁵.
9. ביום 5, חזור על שלבים 3.2, 3.3, 3.4 ו- 3.8.
   הערה: גודל צבירה אמור לגדול במהלך פרוטוקול ההבידול. עם זאת, הקוטר הוא קריטי רק כאשר ההבידול מתחיל, מכיוון פרמטר זה יכול להשפיע על יעילות הבידול.
10. ביום 7, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. דילול FGF2 ו SB431542 כדי 2/3: להוסיף 20 μL של FGF2 ו 40 μL של SB431542 כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני. החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM תוסף. חזור על שלב 3.6 והגביר את התסיסה ביו-סיבה ל-30 סל"ד.
11. ביום 14, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. להוסיף 60 μL של FGF19 (ריכוז סופי, 100 ng/mL) כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני. החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM בתוספת FGF19. חזור על שלב 3.6.
    הערה: FGF19 משמש לקידום קיטוב של מבנים באמצע ההינדי²⁶.
12. ביום 18, חזור על שלבים 3.2, 3.3, 3.4 ו- 3.11.
13. ביום 21, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. החלף את כל הכסף שהוצא מהביו-קטור במדיום נוירו-בסל מלא(טבלה 1). חזור על שלב 3.6.
    הערה: מדיום Neurobasal הוא מדיום בסיס המשמש לשמירה על אוכלוסיית התאים העצביים בתוך אורגנואיד⁷.
14. ביום 28, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. להוסיף 180 μL של SDF1 (ריכוז סופי, 300 ng/mL) כדי 60 מ"ל של מדיום neurobasal מלא. החלף את כל הכסף שהוצא מהביו-קטור עם מדיום נוירו-בסל מלא בתוספת SDF1. חזור על שלב 3.6.
    הערה: SDF1 משמש כדי להקל על הארגון של שכבות תא נפרדות²⁷.
15. ביום 35, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. החלף את כל החברה הנוכלת מהביו-קטור במדיום BrainPhys שלם(טבלה 1). חזור על שלב 3.6.
    הערה: BrainPhys הוא מדיום עצבי התומך נוירונים פעילים מבחינה סינאפטית²⁸.
16. החלף 1/3 של הנפח הכולל כל 3 ימים עם מלא BrainPhys בינוני עד היום 90 של בידול.

4. הכנת אורגנואידים להקפאה וחיסונים

1. אוסף אורגנואידים לחיסונים
   1. לאסוף 1 מ"ל של מדגם של אורגנואידים בינוניים המכילים עם פיפטה סרולוגית מהביו-קטור לצינור חרוכי של 15 מ"ל.
      הערה: יש לאסוף אורגנואידים בנקודות זמן שונות כדי להעריך את יעילות ההבידול, כולל ימים 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 ו- 90.
   2. הסר את הסופרנטנט ושטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של 1× PBS.
      הערה: אין צנטריפוגה באורגנואידים. תן לאוגן להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח המשיכה.
   3. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). דגירה ב 4 °C במשך 30 דקות. הסר את PFA שהוצא והוסף 1 מ"ל של PBS × 1.
   4. לאחסן את האורבנואידים ב-1 מ"ל של 1× PBS ב-4°C עד לעיבוד לצורך cryosectioning.
      הערה: אחסן את האורבנואידים ב- PBS 1x למשך לא יותר משבוע לאחר קיבעון.
2. הכנת אורגנואידים להקפאה
   1. הסר את הסופרנטנט מהמאוברנואידים המאוחסנים. הוסף 1 מ"ל של 15% סוכרוז (w /v, מדולל ב 1× PBS), לערבב היטב על ידי מערבולת עדינה, ומדגם לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. הכינו פתרון של 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין(טבלה 2) ושמרועל 37°C במהלך ההכנה כדי להימנע מכך שג'לטין יתגבש.
   3. הסר את תמיסת ה-15% סוכרוז, הוסף 1 מ"ל של 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין לאוברנואידים, ומערבבים במהירות על ידי מערבולות עדינות. דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
   4. הוסף 15% תמיסת ג'לטין סוכרוז/7.5% למכל פלסטיק עד מחצית מנפחו. חכה לגבשות בRT.
   5. לאחר דגירה של שעה אחת, מניחים בזהירות טיפת סוכרוז/ג'לטין המכילה את האורבנואידים על הג'לטין המוצק עם פיפטת פסטר. השאר להתגבש ב RT במשך כ 15 דקות. הקפד להימנע היווצרות בועה.
   6. מניחים 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין מעל האורבנואידים עד שהמיכל מתמלא. המתן לגבשות מלאה ב-RT.
   7. לאחר ההתגבשות, דגירה 20 דקות ב 4 ° C.
   8. חותכים את הג'לטין לקוביה המכילה את האורבנואידים במרכז ולתקן את קוביית הג'לטין על חתיכת קרטון עם טיפה של תרכובת O.C.T.
   9. מניחים 250 מל של isopentane ב 500 מל ולמלא מיכל מתאים עם חנקן נוזלי. בעזרת מרטבים וכפפות עבות, מניחים בזהירות את הספל המכיל איזופטן על פני השטח של חנקן נוזלי ומצננים את האפסופנטן ל-80 מעלות צלזיוס.
   10. כאשר מגיעים ל-80°C, מניחים את קוביית הג'לטין בספל המכילה איזופטן עד שהיא קופאת, תוך שמירה על הטמפרטורה ב-80 מעלות צלזיוס. בהתאם לגודל הקוביה, ייתכן שאקח 1-2 דקות.
       הערה: הימנע מטמפרטורות מתחת ל-80°C או מזמן הקפאה מוגזם, מכיוון שהוא עלול לגרום לפיצוח הקוביה.
   11. כאשר קפוא, לאחסן במהירות את קוביית הג'לטין ב -80 °C ולאחסן עד cryosectioning.
3. קריוסה של אורגנואידים
   1. הפעל את ההקפאה והגדר הן את טמפרטורות הדגימה (OT) והן את טמפרטורות ההקפאה (CT) ב-25°C.
   2. כאשר שתי הטמפרטורות מתייצבות, לתקן את קוביית הג'לטין המכילה את האורבנואידים על הדגימה באמצעות תרכובת O.C.T.
   3. הגדר עובי מקטע ב- 12 μm.
   4. חותכים את הקוביה ואספו 3-4 פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה (ראה טבלת חומרים).
   5. לאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
4. חיסון של פרוסות אורגנואידים
   1. מקם את שקופיות המיקרוסקופ המכילות מקטעים אורגנואידים בצנצנת התדידות עם 50 מ"ל של PBS 1x חמם מראש, מחזיק עד 10 שקופיות גב אל גב.
      הערה: כל מקטעי האורגונואידים צריכים להיות שקועים בנוזל.
   2. דגירה במשך 45 דקות ב 37 ° C כדי degelatinize שקופיות.
   3. לשטוף 1x עם 50 מ"ל של 1× PBS במשך 5 דקות ב RT: להעביר את השקופיות לצנצנת היתד המכילה PBS 1× טרי.
   4. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד המכילה 50 מ"ל של גלצין טרי (שולחן 2) ותדגירה למשך 10 דקות ב-RT.
   5. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד המכילה 50 מ"ל של טריטון 0.1%(טבלה 2)וחומלים למשך 10 דקות ב-RT.
   6. לשטוף עם 1× PBS במשך 5 דקות 2x.
   7. מכינים את המנה החיסונית עם נייר 3 מ"מ ספוג ב-1× PBS. שקופיות יבשות עם רקמה מסביב לפרוסות ומים אותן על נייר 3 מ"מ. עם פיפטה פסטר, לכסות את כל פני השטח של השקופיות עםפתרון חסימה ( טבלה 2) עם ~ 0.5 מ"ל לכל שקופית. דגירה במשך 30 דקות בRT.
   8. הסר פתרון חסימה עודף וייבש את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות. מקום 50 μL של הנוגדן הראשי(טבלה 3)מדולל בחסימת פתרון על המקטעים ולכסות עם כיסויים. מניחים את הפרוסות בצלחת חיסונית שהוכנה קודם לכן. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   9. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד עם 50 מ"ל TBST (טבלה 2), תנו לכיסויים ליפול, ושטפו עם TBST למשך 5 דקות ו-3x.
   10. מקום 50 μL של הנוגדן המשני מדולל בחסימת פתרון על המקטעים ולכסות עם כיסויים. מניחים את הפרוסות בצלחת החיסונית שהוכנה קודם לכן. דגירה במשך 30 דקות ב RT, מוגן מפני אור.
   11. מעבירים את השקופיות שוב לצנצנת היתדות ושטפו עם 50 מ"ל TBST למשך 5 דקות ו-3x.
   12. מייבשים את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות ומנחים את הפרוסות בצלחת חיסונית שהוכנה בעבר. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון DAPI על פני כל פני השטח של השקופיות עם פיפטה פסטר. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
   13. חזור על שלב 4.4.9.
   14. לייבש בזהירות את השקופיות עם טישו. להוסיף 50 μL של הרכבה בינונית טיפה אחר טיפה לאורך השקופית ולאחר מכן בזהירות להוריד כיסוי על כל שקופית, מעט כיפוף אותו כדי למנוע בועות.

הפרוטוקול החל על ידי קידום צבירת תאים באמצעות 0.1 L bioreactors (איור 1A). חסון תא יחיד של iPSCs בוצע, עם 250,000 תאים / מ"ל זרעו ב 60 מ"ל של בינוני עם מהירות תסיסה של 27 סל"ד. זה הוגדר כיהי 0. לאחר 24 שעות, התאים יצרו ביעילות אגרגטים בצורת ספרואיד (יום 1, איור 1B),והמורפולוגיה נשמרה היטב עד היום 5, עם עלייה הדרגתית בגודל, המדגימה רמה גבוהה של הומוגניות במורפולוגיה וגודל מצטברים לאורך זמן. (איור1B). ניתוח כמותי של מיקרוסקופיה גילה גם התפלגות נורמלית של גדלים מצטברים לפי יום 1 (איור 1C). גודל הצבירה הוא פרמטר פיזי חשוב המסוגל לבקש מהתאים להבדיל לכיוון יחסים^{שונים 29,30}. מסיבה זו, בהתבסס על הגודל המצטבר שדווח במחקרים^{קודמים כדי לגרום למחויבות עצבית יעילה 31,32} ומחויבות המוח²¹, אגרגטים שנוצרו נשמרו mTeSR1 בינוני ב 25 סל"ד עד שהם הגיעו לקוטר הרצוי לפני תחילת בידול (~ 200 μm). ביום 2, הקוטר הממוצע היה 221.0 ± 54.4 μm (ממוצע ± SD) עבור קו התא F002.1A.13 ו 212.1 ± 42.1 μm עבור קו התא iPSC6.2. ככזה, שני קווי התאים הגיעו לגודל הצבירה האופטימלי בנקודת זמן זו (איור 1C).

הגדרת היום שבו זריעת iPSCs בוצעה כיום 0, ביום 2, לאחר השגת קוטר צבירה רצוי, מחויבות עצבית הושרה על ידי בו זמנית באמצעות SB431542, FGF2, ואינסולין, קידום בידול נוירוקטודרמלי, כמו גם caudalization מתון הדרוש עבור דפוס באמצע הינדס. לאחר מכן, FGF19 ו SDF1 נוספו לתרבות בימים 14 ו 28, בהתאמה, כדי לקדם את הדור של קדמויים המוח שונים. בימים הראשונים של האינדוקציה העצבית, נעשה שימוש במהירות סיבוב של 25 סל"ד, אשר הוגדלה ל-30 סל"ד לאחר 7 ימים כדי למנוע הצטברות וגדילה של אגרגטים גדוליםיותר (איור 2א). במהלך בידול, אורגנואידים הראו אפיתל בולט יותר דומה למבנים דמויי צינור עצבי עם מרחב זוהר(איור 2B). בנוסף, ההערכה של התפלגות קוטר אורגנואיד הדגימה התפלגות גודל הומוגנית במהלך ההתחייבות המוחית הראשונית עד היום 14(איור 2B).

ניתוח Immunofluorescence תומך כי מחויבות עצבית יעילה של אורגנואידים נגזר iPSC כבר מושגת על ידי היום 7 של בידול לאחר הוספת FGF2 ו SB431542. cryosections של אורגנואידים חשפו מבנים רבים המזכירים את כתמי הצינור העצבי עבור PAX6 ו NESTIN, עם רוב התאים בתוך organoids המביעים סמן אב אדם NESTIN בימים 7 ו 14 של ביפרדול (איור 2C). לאחר מכן, FGF19 ו SDF1 קידמו את הדור של שכבות אב חסות המתפשטות ללא הרף (PAX6⁺) והושגה בידול עצבי יעיל, כפי שהוכח על ידי הביטוי של TUJ1, בטא-טובלין ברמה III ספציפית לנוירון, על ידי ימים 21 ו 35 (איור 2C). בנוסף, בידול מוחי-בלארי יעיל נצפתה גם לאחר 21 ימים ב-0.1 L VW bioreactors, שהוכח על ידי הנוכחות של שתי אוכלוסיות תאים שונות: אבותניטורים של תאי גרגיר (BARLH1⁺ תאים, איור 3A), וצירי תאPurkinje (OLIG2⁺ תאים, איור 3B). לאחר 35 ימים בתרבות, אוכלוסיות תאים שונות בתוך האורגנואידים נראו מאורגנות לשכבות נפרדות. מבנים שטוחים-סגלגלים שונים בתוך אורגנואידים נצפו עם BARHL1⁺ אבותיים המוח הקטן גב כשכבה רציפה בצד השטחי של האורגנואיד (איור 3C, D )וSOX2⁺ באזור הזוהר של מבנים סגלגלים אלה (איור 3D). בנוסף, TUJ1⁺ נוירונים שזה עתה נולדו הופיעו לנדוד לכיוון פני השטח, מחדש את היישור רדיאלי על פני השטח החלקהההחוצה של organoid (איור 3E).

לאחר הדור של קב"ה המוח הקטן, התבגרות נוספת קודמה באמצעות BrainPhys בינוני^{28 בתוספת} עם גורמים נוירוטרופיים BDNF ו GDNF. כתם חיסוני של קריוסות אורגנואידים שימש לזיהוי תת-סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן. תאי Purkinje, נוירונים GABAergic לבטא את קלבינדין חלבון מחייב סידן (CALB, איור 3F),זוהו באורגניואידים המוח הקטן לאחר פרוטוקול ההתבגרות. בנוסף, סוג עצבי ראשי נוסף, תאי גרגיר, זוהה כתת קבוצה של תאים המדכאים PAX6 ו- MAP2(איור 3G). מעניין, בריכה של PAX6⁺ האבות לא לבטא MAP2 נשמר עד 80 ימים של בידול. סוגים אחרים של נוירונים המוח הקטן זוהו גם, כולל תאי מברשת חד קוטביים המביעים TBR2(איור 3H), ונוירוניםהקרנת גרעין המוח הקטן עמוק המביעים TBR1(איור 3I). בנוסף הבידול המוחלי יעיל והתבגרות, מערכת תרבות דינמית 3D זו באמצעות PBS 0.1 L פולקסווגן bioreactors אפשר אורגנואידים להישאר קיימא עד 90 ימים, ללא מוות ונמק משמעותיים של תאים (איור 3J).

איור 1: יצירת אגרגטים הנשלטים על-ידי גודל באמצעות תורמים ביולוגיים מדרגיים. (א)תכונות עיצוב של ביו-יאה. (ב)פוטומיקרוגרף ברייטפילד המציג אגרגטים משתי שורות iPSC שונות בימים 1, 2 ו- 5. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ג)התפלגות הגודל של אגרגטים צפים מקווי iPSC שונים ב-bioreactors. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: יצירת אורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות 0.1 L bioreactors. (א)ייצוג סכמטי של הליך התרבות כדי לגרום בידול של iPSCs לאוגניואידים המוחליים. תאים נזרעו בצפיפות של 250,000 תאים / מ"ל ומהירות תסיסה של 27 סל"ד שימש לקידום צבירת תאים. בימים הראשונים של בידול, אגרגטים נשמרו במהירות תסיסה של 25 סל"ד. לאחר מכן, כדי למנוע הצטברות של אגרגטים גדולים יותר, מהירות התסיסה הוגדלה ל-30 סל"ד. (ב)אפיון של צורה וגודל אורגנואידים. פוטומיקרוגרפים ברייטפילד המציגים אורגנואידים שמקורם ב-iPSC במהלך בידול המוח הקטן ב-0.1 L פולקסווגן bioreactors. סרגל קנה מידה = 100 μm. התפלגות קוטרים אורגנואידים מדגימה כי התרבות שמרה על גדלים הומוגניים אורגנואידים לאורך פרוטוקול ההבידול. (ג)אינדוקציה עצבית יעילה באורגניואידים הנגזרים מ-iPSC. אימונו-השפלה עבור NESTIN, PAX6 ו- TUJ1 במהלך בידול המוח הקטן. סרגל קנה מידה = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: בידול והתבגרות מוחית יעילה באורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC. (א-E) מחויבות מוחית יעילה. ניתוח חיסוני עבור סמנים BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD ו- TUJ1 בנקודות זמן שצוינו של פרוטוקול הבידול המוחלי. אנילא יודע מהלעשות. התבגרות יעילה של אורגנואידים מוחיים נגזרים על-ידי IPSC. Immunofluorescence מראה סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן, כולל תאי Purkinje (CALB, F), תאי גרגר (PAX6 ו MAP2, G), תאי מברשת חד קוטבית (TBR2), ו עמוק neuroclei המוח הקטן מקרין נוירונים (TBR1). (J)קיימות תא גבוהה לאחר התבגרות המוח הקטן. חי / מת (calcein-AM, ירוק, פרודיד פרופידיום, אדום) הכתמה של אורגנואידים הראה קיום תא גבוה ואין עדות של אזורים נמקים לאחר 80 ימים ביו-כוא. סרגל קנה מידה = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: פתרונות מלאי והכנת מדיה. המפורטים הם כל הרכיבים ונפחים המשמשים להכנת מדיה עבור פרוטוקול תחזוקה ובידול iPSCs, כמו גם פתרונות מלאי של גורמי גדילה ומולקולות קטנות. עבור פתרונות מניות, כל ריכוז המניות והפרוטוקולים להשבתה מפורטים.

טבלה 2: פתרונות להכנת אורגנואידים להקפאה וחיסונים. המפורטים הם כל הרכיבים ונפחים המשמשים להכנת הפתרונות המשמשים בהכנת אורגנואידים עבור cryosectioning וחיסונים.

טבלה 3: נוגדנים עיקריים. הנוגדנים, המשובטים והדילולים הממוטבים העיקריים המשמשים לחיסונים מפורטים.

הצורך במספרי תאים גדולים, כמו גם תנאי תרבות מוגדרים כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים עבור סינון תרופות ויישומי רפואה רגנרטיבית כבר נהיגה בפיתוח של מערכות תרבות מדרגית. בשנים האחרונות דיווחו מספר קבוצות על הדור המדרגי של תובנים עצביים^{ונוירונים פונקציונליים 32,33,34}, המספקים התקדמות משמעותית בפיתוח מודלים חדשים להפרעות ניווניות. עם זאת, היוון של כמה אירועים קריטיים של התפתחות עוברית עדיין חסר, ואת התחזוקה של נוירונים פונקציונליים שנוצר בהשעיה לפרקי זמן ארוכים עדיין לא הושג³⁴. מוצג כאן היא מערכת תרבות 3D דינמי מסוגל ליצור iPSC נגזר אורגנואידים עצביים עם זהות המוח הקטן, ולקדם עוד יותר התבגרות לתוך נוירונים המוח הקטן פונקציונלי תחת תנאים מוגדרים כימית ללא מאכיל בתרבות דינמית.

לפני תחילת בידול המוח הקטן, זה קריטי כדי לשמור על האיכות של iPSCs האנושי. לפיכך, כדי לא להתפשר על הבידול, יש לבצע לא יותר משלושה קטעים של iPSCs מהפשרה ועד חיסונים ביו-יים. שלב חשוב בפרוטוקול ההבידול הוא להעריך את גודל הצבירה. לגודל הצבירה יש תפקיד קריטי בגרימת בידול לכיוון תחוחה ספציפית של תא²⁹. חוץ מזה, יש סף גודל מינימלי שנראה לטובת בידול³⁵. כפי שכבר דווח, קוטר צבירה אופטימלי הנגזר מ-iPSC^{לקידום מחויבות עצבית יעילה 31,32 ובידול מוחי 21} הוא קוטר של כ-200 μm.

בנוסף, בפרוטוקול דינמי זה, מהירות התסיסה המשמשת בימים הראשונים של התרבות היא קריטית כדי לשלוט בקוטר המצטבר והשראה עצבית. התרבות החלה ב 27 סל"ד, אשר מספיק כדי לקדם צבירת iPSCs ולהימנע היווצרות של אגרגטים גדולים יותר (קוטרים מעל 350 μm יש להימנע). התסיסה המשמשת לקידום צבירת תאים לאחר זריעת תאים בודדים יכולה להיות מוגברת ל-30 סל"ד מבלי להשפיע על הכדאיות של התאים; עם זאת, מהירויות עצבנות גבוהות יותר צפויות לייצר אגרגטים קטנים יותר. בהתאם לקו iPSC, 24 שעות לאחר זריעת תאים באמצעות 27 סל"ד, צפויים שני תרחישים שונים: הצבירות שנוצרו מציגות קוטרים קטנים יותר (<200 μm) או הגיעו לטווח גדלים בין 200-300 μm. אם אגרגטים גדולים מ 350 μm ב 24 שעות לאחר זריעת תאים, בידול לא צריך להתבצע, ואת זריעת התא צריך לחזור, כי היעילות של ההבידול יהיה נמוך מאוד. אם הצבירה קטנה מ- 200 μm, יש להחליף את המדיום שהושקע במדיום תחזוקת iPSC, ואת מהירות התסיסה מופחתת ל- 25 סל"ד. עם התאמה זו, קוטר צבירה צפוי לגדול מהיום הראשון ליום 2, ככל הנראה בשל מיזוג של אגרגטים בודדים המקודמים על ידי הירידה במהירות התסיסה. במקרה של אגרגטים עם גדלים בין 200-300 μm, המדיום בילה צריך להיות מוחלף עם מדיום בידול, אינדוקציה עצבית עם FGF2 צריך להתחיל לאחר 2 ימים בתרבות. בשלב זה, מהירות התסיסה צריך גם להיות מופחת במקצת כדי למנוע מוות מוגזם של תאים, כי תאים רגישים יותר ללחץ גהה בנוכחות של דיום בידול. בנוסף, ניתן לנתח את ההומוגניות של האוכלוסייה באמצעות מקדם הווריאציה (CV), המודד את השונות על-ידי התאמת סטיית תקן עם האמצעים של קוטר מצטבר, על פי המשוואה

שבו δ מייצג את סטיית התקן של הקוטר הצבור μ הוא הקוטר הממוצע. במערכת דינמית זו, קורות החיים הממוצעים שנצפו היו 12.5 ± 3.3% (ממוצע ± SD) עבור קו התא F002.1A.13 ו 19.0 ± 0.37% עבור iPSC6.2 קו התא ביום 2. לכן, במערכת זו, יש לצפות לאוכלוסיית גודל הומוגני עם קורות חיים מתחת ל- 0.2 (< 20% מהווריאציה). לאחר 7 ימים של בידול, הקוטר הצבורי הממוצע נע בין 300-360 μm, ומהירות התסיסה הוגדלה ל 30 סל"ד כדי למנוע אגרגטים להתיישב בתחתית 0.1 L פולקסווגן bioreactor.

ההבידול של אורגנואידים המוח הקטן עד היום 35 וניתוח של גודל מצטבר בתנאים סטטיים דווחו לאחרונה²¹. המחברים הראו כי אגרגטים תלת-מית-מית-מית-יים נוצרו ומתוחזקים בצלחת (לדוגמה, Aggrewell) עד היום ה-7 של בידול היו הומוגניים בגודלם^{ובצורה 21}. עם זאת, לאחר העברת הצבירות לקובץ מצורף אולטרה-נמוך 6 צלחות תרבות באר, הצבירות החלו להשתנות בגודל ומורפולוגיה²¹. ביום 35 בתנאים סטטיים, חלק מהצרגטים 3D הגיע 1,000 μm עבור קווי תא שונים, אשר הגביל את דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן. לעומת זאת, באמצעות התנאים הדינמיים שלנו, אגרגטים לא הגיעו לקוטר של יותר מ-800 μm ביום ה-35, עם העברת מסה משופרת בשל התסיסה המתמדת של המדיום שקודם על ידי הגלגל האנכי. יתר על כן, הגדלים המצרפיים נשמרו עד סוף תהליך ההתבגרות, מראה קוטר מצטבר של 646.6 ± 104.2 μm ביום 90, התרבות הארוכה ביותר שבוצעה 0.1 L פולקסווגן bioreactors.

אינדוקציה מוחית יעילה הושרה על ידי תוספת רציפה של SB431542, FGF2, FGF19, ו SDF1 במערכת דינמית 3D זה. הפרוטוקול מתחיל עם השילוב של SB431542, שהוא בטא גורם גדילה משתנה (TGF-ß)-חוסם קולטן המעכב בידול mesendodermal, ו FGF2, אשר יש השפעה עיקרית בcaudalization של רקמת נוירו-פיתלאלי²⁵. לכן, התוספת של שתי מולקולות אלה בימים הראשונים של התרבות היא חיונית כדי לקדם את בידול התא לאמצע ההינדי, הטריטוריה שמורימת את רקמת המוח הקטן. לאחר אינדוקציה ראשונית לרקמות המוח האמצעי, יש צורך להוסיף FGF19 לקידום הדור הספונטני של מבנים באמצע המוח האחורי עם קוטביות גב-גחוני, כמו גם את הדור של קדמות^{המוח שונים 36,26}. SDF1 מקל על הארגון של שכבות נפרדות של דבק המוח, כפי שניתן לראות בשלב ההתפתחותי שבו neurogenesis המוח הקטן^{מתרחשת 27}. עד היום ה-35, מולקולות אלה יכולות לקדם את הארגון של אורגנואידים המוח הקטן שיכול לתוות מחדש את התפתחות המוח הקטן האנושי, אשר מתאים המוח הקטן של השליש הראשון. לאחר הארגון של אבות המוח לתוך שכבות שונות, מדיום עצבי מוגדר שימש כדי לקדם את ההתבגרות שלהם²⁸. מדיה אחרת המשמשת לשמירה על תאים עצביים יכולה גם להיבדק, אבל יעילות נמוכה יותר צפויים. לכן, בפרוטוקול זה, BrainPhys שימש כדי לקדם את ההבידול של תאים המוח ים מחויבים לתוך נוירונים המוח הקטן, כי זה דווח כדי לחקות טוב יותר את הסביבה העצבית בריאה ולתמוך בפעילות נוירופיזיולוגית של נוירונים^{שנוצרו 28}.

באמצעות תנאים דינמיים אלה, ניתן להשיג דיפוזיה יעילה יותר של חומרים מזינים, חמצן, וגדילה. עם זאת, מגבלות מסוימות משויכות לתסיסה המשמשת בפרוטוקול ההבידול. כמה מתח גייה יכול להיות הציג על ידי תהליך התסיסה, אשר יכול להשפיע על ההישרדות, התפשטות, בידול של תאים. לכן, במהלך שלב ההתבגרות, שבו התאים רגישים יותר, יש לפקח בזהירות על התרבות.

הבידול של אורגנואידים המוח הקטן המזכירים התפתחות המוח הקטן האנושי כבר דווח^7. עם זאת, התבגרות נוספת של אורגנואידים המוח צלולים אלה לתוך נוירונים המוח הקטן באמצעות תרביות 3D נשאר אתגר. הדור של נוירונים המוח הקטן פונקציונלי הושג רק על ידי coculturing עם תאי גרגיר ממקורות^{שונים 4,,7,,15}. פרוטוקול זה שידרג בהצלחה את המחויבות המוחית-הקטן של IPSCs אנושיים; בנוסף, זהו הפרוטוקול הראשון עבור בידול של נוירונים מוח שונים במערכת תרבות 3D מבלי לשתף פעולה עם תאי ההזנה. באופן ספציפי, סוגי התאים הבאים יכולים להיות מיוצרים במערכת התרבות הדינמית שלנו: תאי Purkinje (Calbindin⁺), תאי גרגיר (PAX6⁺/MAP2⁺), תאי מברשת חד קוטביים (TBR2⁺), ונוירונים הקרנת גרעינים המוח הקטן עמוק (TBR1⁺), אשר נשמרו בהשעיה במשך זמן רב ככל 3 חודשים.

הדור המדרגי של אורגנואידים המוח הקטן מייצג כלי רב ערך לחקר ההתפתחות העוברית של המוח הקטן ואת המסלולים הפתולוגיים המעורבים בניוון של איבר זה. יתר על כן, הקרנה בתפוקה גבוהה עבור מולקולות לשחזר את תפקוד המוח הקטן עשוי להתבצע באמצעות אורגנואידים שהושגו עם מערכת מדרגית זו. בסך הכל, שיטה זו עונה על צורך שלא נענה בפרוטוקול מדרגי לדור אורגנואידים מוחיים באיכות גבוהה שעשויים להיות חשובים עבור מגוון יישומים ביו-רפואיים.

המחברים YH ו-SJ הם עובדים של PBS ביוטכנולוגיה. המחבר BL הוא מנכ"ל ומייסד שותף של PBS ביוטכנולוגיה, Inc. מחברים משתפי פעולה אלה השתתפו בפיתוח התורמים הביולוגיים המשמשים בכתב היד. כך אינו משנה את דבקות המחברים בכל המדיניות של היומן על שיתוף נתונים וחומרים. כל שאר המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל (UIDB/04565/2020 באמצעות Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, פרויקט N. 007317, PD/BD/105773/2014 ל-T.P.S ו-PD/BD/128376/2017 ל-D.E.S.N), פרויקטים במימון שיתוף של FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa פורטוגל 2020) ו-FCT באמצעות מענק PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ו-CEREBEX Generation של אורגנואידים המוח הקטן למענק מחקר אטקסיה LISBOA-01-0145-FEDER-029298. המימון התקבל גם מתכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, במסגרת הסכם המענק מספר 739572 – מרכז התגליות לרפואה רגנרטיבית ודיוקה H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.