Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

Il cervelletto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio e della coordinazione motoria, e un difetto funzionale in diversi neuroni cerebellari può innescare disfunzione cerebellare. La maggior parte delle conoscenze attuali sui fenotipi neuronali correlati alla malattia si basa sui tessuti post-mortem, il che rende difficile la comprensione della progressione e dello sviluppo della malattia. I modelli animali e le linee cellulari immortalate sono stati utilizzati anche come modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, non ricapitolano completamente la malattia umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) hanno un grande potenziale per la modellazione della malattia e forniscono una fonte preziosa per gli approcci rigenerativi. Negli ultimi anni, la generazione di organoidi cerebrali da iPSC derivati dal paziente ha migliorato le prospettive per la modellazione delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, mancano protocolli che producono un gran numero di organoidi e un'elevata resa di neuroni maturi nei sistemi di coltura 3D. Il protocollo presentato è un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile di organoidi umani derivati da iPSC in condizioni chimicamente definite utilizzando bioreattori mono uso scalabili, in cui gli organoidi acquisiscono l'identità cerebellare. Gli organoidi generati sono caratterizzati dall'espressione di marcatori specifici sia a livello di mRNA che di proteine. L'analisi di specifici gruppi di proteine consente di rilevare diverse popolazioni di cellule cerebellari, la cui localizzazione è importante per la valutazione della struttura organoide. La criosezione organoide e l'ulteriore immunosostenimento delle fette organoidi vengono utilizzate per valutare la presenza di specifiche popolazioni di cellule cerebellari e della loro organizzazione spaziale.

L'emergere di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) rappresenta un ottimo strumento per la medicina rigenerativa e la modellazione della malattia, perché queste cellule possono essere differenziate nella maggior parte delle linee cellulari del corpo^{umano 1,2}. Dalla loro scoperta, la differenziazione PSC utilizzando approcci diversi è stata segnalata per modellare diverse malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi^3,4,5,6.

Recentemente, ci sono state segnalazioni di colture 3D derivate da PSC simili a strutture cerebrali umane; questi sono chiamati organoidi cerebrali^3,7,8. La generazione di queste strutture da PSC sani e specifici per il paziente offre una preziosa opportunità per modellare lo sviluppo umano e i disturbi del neurosviluppo. Tuttavia, i metodi utilizzati per generare queste strutture cerebrali ben organizzate sono difficili da applicare per la loro produzione su larga scala. Per produrre strutture sufficientemente grandi da ricapitolare la morfogenesi dei tessuti senza necrosi all'interno degli organoidi, i protocolli si basano sull'impegno neurale iniziale in condizioni statiche, seguito dall'incapsulamento negli idrogel e dalla successiva coltura nei sistemi^{dinamici 3}. Tuttavia, tali approcci possono limitare il potenziale aumento della produzione di organoidi. Anche se sono stati fatti sforzi per dirigere la differenziazione PSC a specifiche regioni del sistema nervoso centrale, tra cui corticale, striatale, midbrain, e neuroni del midollo spinale^9,10,11,12, la generazione di regioni cerebrali specifiche in condizioni dinamiche è ancora una sfida. In particolare, la generazione di neuroni cerebellari maturi in strutture 3D deve ancora essere descritta. Muguruma et al. ha aperto la strada alla generazione di condizioni di coltura che ricapitolano lo sviluppo cerebellare^{precoce 13} e ha recentemente riportato un protocollo che consente alle cellule staminali embrionali umane di generare una struttura polarizzata che ricorda il primo cervelletto^{del trimestre 7}. Tuttavia, la maturazione dei neuroni cerebellari negli studi riportati richiede la dissociazione degli organoidi, lo smistamento dei progenitori cerebellari e la coculazione con cellule di alimentazione in un sistema di coltura monostrato^7,14,15,16. Pertanto, la generazione riproducibile degli organoidi cerebellari desiderati per la modellazione della malattia in condizioni definite è ancora una sfida associata alla variabilità della coltura e dell'alimentazione.

Questo protocollo presenta condizioni di coltura ottimali per l'espansione 3D e la differenziazione efficiente dei PSC umani nei neuroni cerebellari utilizzando bioreattori a ruota verticale monoiose (vedi Tabella dei materiali per le specifiche), in seguito chiamati bioreattori. I bioreattori sono dotati di un grande impeller verticale, che in combinazione con un fondo a forma di U, fornisce una distribuzione di taglio più omogenea all'interno del vaso, consentendo una miscelazione delicata e uniforme e sospensioni di particelle con velocità di agitazione^{ridotte 17}. Con questo sistema, è possibile ottenere aggregati cellulari controllati da forma e dimensioni, che è importante per una differenziazione più omogenea ed efficiente. Inoltre, un maggior numero di organoidi derivati da iPSC può essere generato in modo meno laborioso.

La caratteristica principale degli organoidi, che sono strutture multicellulari 3D di solito formate da cellule staminali, è l'auto-organizzazione di diversi tipi di cellule che forma forme specifiche come quelle osservate nella morfogenesi^{umana 18,19,20}. Pertanto, la morfologia organoide è un criterio importante da valutare durante il processo di differenziazione. La criosezione degli organoidi e l'ulteriore immunosostenimento delle fette di organoidi con un insieme specifico di anticorpi consentono la visualizzazione spaziale dei marcatori molecolari per analizzare la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'identità della popolazione cellulare e l'apoptosi. Con questo protocollo, immunostaining criosezioni organoidi, un impegno neurale efficiente iniziale è osservato^{dal 7 esimo} giorno di differenziazione. Durante la differenziazione, vengono osservate diverse popolazioni di cellule con identità cerebellare. Dopo 35 giorni in questo sistema dinamico, il neuroepithelium cerebellare si organizza lungo un asse apicobasale, con uno strato apico di progenitori proliferanti e neuroni postmitotici situati in modo basalmente. Durante il processo di maturazione, dai giorni 35-90 di differenziazione, si possono vedere tipi distinti di⁺neuroni cerebellari, tra cui le cellule Purkinje (Calbindin , , le cellule di granulo (PAX6⁺- /^MAP2, le cellule di Golgi (Neurogranin⁺), le cellule del pennello unipolare (TBR2⁺) e i neuroni di proiezione nuclei cerebellari profondi (TBR1 ) .⁺ Inoltre, una quantità non significativa di morte cellulare è osservata negli organoidi cerebellari generati dopo 90 giorni in coltura.

In questo sistema, gli organoidi umani derivati da iPSC maturano in diversi neuroni cerebellari e sopravvivono fino a 3 mesi senza la necessità di dissociazione e coculazione di alimentatori, fornendo una fonte di neuroni cerebellari umani per la modellazione della malattia.

1. Passare e il mantenimento degli iPSC umani nella cultura monostrato

1. Preparazione delle piastre
   1. Scongelare la matrice della membrana delseminterrato (vedi Tabella dei Materiali ) stock a 4 gradi centigradi e preparare 60 aliquots di 60 L. Congelare gli aliquots a -20 gradi centigradi.
   2. Per rivestire i pozzi di una piastra di 6 pozzi, scongelare un aliquot della matrice di membrana seminterrato sul ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 60 L a 6 mL di DMEM-F12. Rispendere delicatamente pipettando su e giù.
   3. Aggiungere 1 mL di soluzione di matrice di membrana diluita a ciascun pozzo di una piastra di 6 pozza bene e incubare a RT per almeno 1 h prima di passare o conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
2. Passaggio di colonie iPSC con EDTA
   1. Mantenere gli iPSC nella coltura monostrato in 6 piastre di pozzo nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO_2.
      NOTA: in questo protocollo sono state utilizzate tre distinte linee iPSC umane: F002.1A.13²¹, linea iPSC episomale umana (iPSC6.2)²²e iPS-DF6-9-9T.B (vedere Tabella dei materiali).
   2. Prima di passare, incubare le piastre conservate (punto 1.1) a temperatura ambiente (RT) per 15 min e preparare il mezzo mTesR1(tabella 1).
   3. Aspirare la soluzione dalla piastra utilizzando una pipetta sierologica e aggiungere immediatamente 0,5 mL di mTeSR1 media ad ogni pozzo.
   4. Aspirare il mezzo speso dal pozzo contenente iPSC e lavare una volta utilizzando 1 mL di 0,5 mM EDTA per pozzo.
   5. Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA ad ogni pozzo e incubare a RT per 5 min.
   6. Aspirare EDTA e rimuovere le cellule dai pozzetti aggiungendo delicatamente mTeSR1 medio e pipettando le colonie utilizzando una micropipetta P1000. Raccogliere le cellule in un tubo conico.
      NOTA: non pipettare celle su e giù più di 3x.
   7. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (diluito 1:4) ad ogni pozzo in modo che ogni pozzo contenga 1,5 mL di media dopo l'aggiunta della sospensione cellulare. Restituire le cellule all'incubatrice al 5% di CO₂, 37 gradi centigradi.
   8. Sostituire il mezzo speso ogni giorno e il passaggio ogni 3 giorni quando si ottiene la confluenza del 75%-80%.

2. Semina di iPSC umani nel bioreactor

1. iPSC incubati coltivati come monostrati in mTeSR1 integrati con 10 M di inibitore ROCK Y-27632 (ROCKi). Aggiungere 1 mL di mezzo integrato per ogni pozzo da una piastra di coltura del tessuto 6 e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO_2.
   NOTA: ROCKi viene utilizzato per proteggere gli iPSC dissociati dall'apoptosi²³.
2. Dopo 1 h di incubazione, aspirare il mezzo speso da ogni pozzo e lavare 1x con 1 mL di 1× PBS per pozzo.
3. Aggiungere 1 mL del mezzo di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) ad ogni pozzo di una piastra di 6 pozzi e incubare a 37 gradi centigradi per 7 min fino a quando le cellule si staccano facilmente dai pozzetti con agitazione delicata.
4. Pipetta il distaccamento cellulare medio su e giù con una micropipetta P1000 fino a quando le cellule si staccano e si dissociano in singole cellule. Aggiungere 2 mL di coltura cellulare completa media ad ogni pozzo per inattivare la digestione ezimatica e pipette le cellule delicatamente in un tubo conico sterile.
5. Centrifuga a 210 × g per 3 min e rimuovere il supernante.
6. Risundere il pellet cellulare in media coltura (cioè, mTeSR1 integrato con 10 M di ROCKi) e contare gli iPSC con un emocitometro utilizzando il colorante blu trypan.
7. Seme 15 × 10⁶ cellule singole nel bioretettore (volume massimo di 100 mL) con 60 mL di mTeSR1 integrato con 10 M di ROCKi ad una densità cellulare finale di 250.000 cellule/mL.
8. Inserire il recipiente contenente gli iPSC nell'unità di base universale collocata nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO_2.
   NOTA: l'agitazione del bioreactor viene mantenuta per 24 h impostando il controllo universale dell'unità di base su 27 rpm per promuovere l'aggregazione iPSC.

3. Differenziazione e maturazione degli aggregati umani derivati da iPSC negli organoidi cerebellari

1. Definire il giorno del seeding a singola cella come giorno 0.
2. Il primo giorno, raccogliere 1 mL del campione di aggregazione iPSC utilizzando una pipetta sierologica. Mantenere il bioreactor in agitazione come prima, posizionando l'unità di base universale con il bioreactor contenente gli aggregati in un flusso sterile prima di raccogliere il campione. Piastra la sospensione cellulare in una piastra di fissamento 24 ultra-bassa. Verificare che siano formate aggregazioni derivate da iPSC.
3. Acquisire immagini con un microscopio ottico utilizzando un ingrandimento totale di 40x o 100x per misurare il diametro aggregato.
4. Misurare l'area degli aggregati in ogni immagine utilizzando il software FIJI.
   1. Selezionare "Analizza Impostare Misure "dalla barra dei menu e fare clic su "Area" e "OK".
   2. Selezionare "File Aprire" dalla barra dei menu per aprire un file di immagine memorizzato. Selezionate lo strumento di selezione delle linee presentato nella barra degli strumenti e create una linea retta sopra la barra della scala presentata nell'immagine. Selezionare "Analizza Impostare la scala" dalla barra dei menu.
   3. In "Distanza nota"aggiungere la distesa della barra della scala dell'immagine in m. Definirel'" Unità di lunghezza" come m. Fare clic su "Globale" per mantenere le impostazioni e "OK". Selezionate Selezione ovale nella barra degli strumenti.
   4. Per ogni aggregato delineare l'area con lo strumento ovale. Selezionare "Analizza Misura". Calcolare il diametro in base all'area misurata, considerando che gli aggregati sono approssimativamente sferici
      
      con A come area dell'aggregato.
5. Quando il diametro medio degli aggregati è di 100 m, sostituire l'80% del mezzo speso con mTeSR1 fresco senza ROCKi. Quando gli aggregati raggiungono i 200-250 m di diametro, sostituire tutto il mezzo speso con gfCDM(Tabella 1), lasciando che gli organoidi si stabiliscano nella parte inferiore del bioreactor.
   NOTA: se il diametro aggregato medio supera i 350 m, non avviare il protocollo di differenziazione. Ripetere il seeding di singole celle. Generalmente, l'aggregato impiega circa 1 giorno per raggiungere un diametro medio di 100 m.
6. Inserire il bioreactor contenente gli aggregati nell'unità di base universale collocati nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO₂.
7. Diminuire l'agitazione del bioreattore a 25 giri/min.
8. Nel giorno 2 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4 per valutare il diametro aggregato. Aggiungere 30 L di FGF2 (concentrazione finale, 50 ng/mL) e 60 L di SB431542 (concentrazione finale, 10 M) a 60 mL del mezzo di differenziazione gfCDM(Tabella 1). Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con il gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 3.6.
   NOTA: SB431542 è fondamentale per inibire la differenziazione mesendodermica, inducendo la differenziazione neurale²⁴. FGF2 viene utilizzato per promuovere la caudalizzazione del tessuto neuroepithelial²⁵.
9. Nel giorno 5 ripetere i passaggi 3.2, 3.3, 3.4 e 3.8.
   NOTA: le dimensioni di aggregazione dovrebbero aumentare durante il protocollo di differenziazione. Tuttavia, il diametro è critico solo quando inizia la differenziazione, perché questo parametro potrebbe influenzare l'efficacia della differenziazione.
10. Nel giorno 7 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Diluire FGF2 e SB431542 a 2/3: Aggiungere 20 L di FGF2 e 40 L di SB431542 a 60 mL di media di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 3.6 e aumentare l'agitazione del bioreattore a 30 rpm.
11. Nel giorno 14 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Aggiungere 60 L di FGF19 (concentrazione finale, 100 ng/mL) a 60 mL di media di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con gfCDM integrato con FGF19. Ripetere il passaggio 3.6.
    NOTA: FGF19 viene utilizzato per promuovere la polarizzazione delle strutture mid-hindbrain²⁶.
12. Nel giorno 18 ripetere i passaggi 3.2, 3.3, 3.4 e 3.11.
13. Nel giorno 21 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con un mezzo neurobasale completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 3.6.
    NOTA: Il mezzo neurobasale è un mezzo basale utilizzato per mantenere la popolazione di cellule neuronali all'interno dell'organoide⁷.
14. Nel giorno 28 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Aggiungere 180 L di SDF1 (concentrazione finale, 300 ng/mL) a 60 mL di mezzo neurobasale completo. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con un mezzo neurobasale completo integrato con SDF1. Ripetere il passaggio 3.6.
    NOTA: SDF1 viene utilizzato per facilitare l'organizzazione di layer di celle distinte²⁷.
15. Nel giorno 35 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con il mezzo BrainPhys completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 3.6.
    NOTA: BrainPhys è un mezzo neuronale che supporta i neuroni sinapticamente attivi²⁸.
16. Sostituire 1/3 del volume totale ogni 3 giorni con il mezzo BrainPhys completo fino al giorno 90 di differenziazione.

4. Preparazione degli organoidi per la criosezione e l'immunostochimica

1. Raccolta di organoidi per l'immunosostenimento
   1. Raccogliere 1 mL di campione di mezzo contenente organoidi con una pipetta sierologica dal bioretettore a un tubo conico da 15 mL.
      NOTA: Gli organoidi devono essere raccolti in diversi punti di tempo per valutare l'efficacia della differenziazione, compresi i giorni 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 e 90.
   2. Togliere il supernatant e lavare una volta con 1 mL di 1× PBS.
      NOTA: Non centrifugare gli organoidi. Lasciate che gli organoidi si stabiliscano sul fondo del tubo per gravità.
   3. Rimuovere il supernatant e aggiungere 1 mL del 4% di paraformaldeide (PFA). Incubate a 4 gradi centigradi per 30 min. Rimuovere il PFA speso e aggiungere 1 mL di 1× PBS.
   4. Conservare gli organoidi in 1 mL di 1× PBS a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione per la criosezione.
      NOTA: Conservare gli organoidi in 1x PBS per non più di 1 settimana dopo la fissazione.
2. Preparazione degli organoidi per la criosezione
   1. Rimuovere il supernatant dagli organoidi immagazzinati. Aggiungere 1 mL di 15% di saccarosio (w/v, diluito in 1× PBS), mescolare bene con un leggero vortice e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.
   2. Preparare una soluzione di gelatina al 15% di saccarosio/7,5%(tabella 2) e mantenerla a 37 gradi centigradi durante la preparazione per evitare la gelatina da solidificare.
   3. Rimuovere la soluzione di saccarosio al 15%, aggiungere 1 mL di saccarosio 15%/7,5% di gelatina agli organoidi e mescolare rapidamente con un leggero vortice. Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.
   4. Aggiungere la soluzione di gelatina 15% di saccarosio/7,5% a un contenitore di plastica fino alla metà del suo volume. Attendere la solidificazione a RT.
   5. Dopo un'incubazione di 1 h, mettere con cura una goccia di saccarosio/gelatina contenente gli organoidi sulla gelatina solidificata con una pipetta Pasteur. Lasciare solidificare a RT per circa 15 min. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle.
   6. Mettere il 15% di saccarosio/7,5% di gelatina sopra gli organoidi fino a riempire il contenitore. Attendere la solidificazione completa a RT.
   7. Dopo la solidificazione, incubare 20 min a 4 gradi centigradi.
   8. Tagliare la gelatina in un cubo contenente gli organoidi al centro e fissare il cubo di gelatina su un pezzo di cartone con una goccia di composto O.C.T.
   9. Mettere 250 mL di isopentane in una tazza da 500 mL e riempire un contenitore appropriato con azoto liquido. Utilizzando le forpe e i guanti spessi, posizionare con attenzione la tazza contenente isopentane sulla superficie dell'azoto liquido e raffreddare l'isopentane a -80 gradi centigradi.
   10. Quando si raggiunge -80 gradi centigradi, inserire il cubo di gelatina nella tazza contenente isopentane fino a congelare, mantenendo la temperatura a -80 gradi centigradi. A seconda delle dimensioni del cubo, potrebbe richiedere 1-2 min.
       NOTA: Evitare temperature inferiori a -80 gradi centigradi o un tempo di congelamento eccessivo, perché potrebbe causare la rottura del cubo.
   11. Una volta congelato, conservare rapidamente il cubo di gelatina a -80 gradi centigradi e conservarsi fino alla criosezione.
3. Criosezione degli organoidi
   1. Accendere il criostat e definire sia le temperature campione (OT) e criocamera (CT) a -25 gradi centigradi.
   2. Quando entrambe le temperature si stabilizzano, fissare il cubo di gelatina contenente gli organoidi sul campione utilizzando .C O.T.
   3. Definite lo spessore della sezione a 12 m.
   4. Tagliare il cubo e raccogliere 3-4 fette sui vetrini del microscopio ad adesione (vedi Tabella dei materiali).
   5. Conservare a -20 gradi centigradi fino all'uso.
4. Immunostaining delle fette di organoidi
   1. Posizionare i vetrini al microscopio contenenti sezioni organoidi in un barattolo di copling con 50 mL di 1x PBS preriguero, tenendo fino a 10 diapositive back-to-back.
      NOTA: tutte le sezioni organoidi devono essere sommerse con liquido.
   2. Incubare per 45 minuti a 37 gradi centigradi per degelatinizzare le diapositive.
   3. Lavare 1x con 50 mL di 1× PBS per 5 min a RT: Trasferire le diapositive in un barattolo di copling contenente 1× PBS.
   4. Trasferire i vetrini in un barattolo di cova contenente 50 mL di glicina appena preparata(tabella 2) e incubare per 10 min a RT.
   5. Trasferire le diapositive in un barattolo di copling contenente 50 mL di tritone dello 0,1%(tabella 2) e permeabilizzare per 10 min a RT.
   6. Lavare con 1× PBS per 5 min 2x.
   7. Preparare il piatto immunostaining con carta da 3 mm imbevuta di 1× PBS. Asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette e posizionarli su carta da 3 mm. Con una pipetta Pasteur, coprire l'intera superficie dei vetrini con soluzione di blocco (Tabella 2) con 0,5 mL per diapositiva. Incubare per 30 min a RT.
   8. Rimuovere la soluzione di blocco in eccesso e asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette. Posizionare 50 L dell'anticorpo primario (Tabella 3) diluito nella soluzione di bloccaggio sopra le sezioni e coprire con le coperture. Mettere le fette in un piatto immunostaining preparato in precedenza. Incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.
   9. Trasferire i vetrini in un barattolo di copling con 50 mL di TBST (Tabella 2), lasciare cadere le coperture e lavare con TBST per 5 min 3x.
   10. Posizionare 50 L dell'anticorpo secondario diluito nella soluzione di bloccaggio sulle sezioni e coprire con le coperture. Mettere le fette nel piatto immunostaining preparato in precedenza. Incubare per 30 minuti a RT, protetto dalla luce.
   11. Trasferire nuovamente i vetrini in un barattolo di copling e lavare con 50 mL di TBST per 5 min 3x.
   12. Asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette e posizionare le fette in un piatto immunostaining preparato in precedenza. Aggiungere 0,5 mL di soluzione DAPI su tutta la superficie dei vetrini con una pipetta Pasteur. Incubare per 5 minuti a RT.
   13. Ripetere il passaggio 4.4.9.
   14. Asciugare con cura i vetrini con un tessuto. Aggiungere 50 L di montaggio medio goccia a goccia lungo il scivolo e quindi abbassare con attenzione un coperture su ogni diapositiva, piegando leggermente per evitare bolle.

Il protocollo è stato avviato promuovendo l'aggregazione cellulare utilizzando i bioreattori 0,1 L (Figura 1A). È stata eseguita l'inoculazione a singola cellula degli iPSC, con 250.000 cellule/mL semitesse in 60 mL di media con una velocità di agitazione di 27 rpm. Questo è stato definito come giorno 0. Dopo 24 h, le cellule formavano in modo efficiente aggregati a forma di sferoide (giorno 1, Figura 1B), e la morfologia era ben mantenuta fino al giorno 5, con un graduale aumento delle dimensioni, dimostrando un alto grado di omogeneità nella morfologia aggregata e nelle dimensioni nel tempo. (Figura 1B). Un'analisi quantitativa per microscopia ha inoltre rivelato la normale distribuzione delle dimensioni aggregate entro il giorno 1 (Figura 1C). La dimensione aggregata è un importante parametro fisico in grado di richiedere alle celle di differenziarsi verso linee^{diverse 29,30}. Per questo motivo, in base alle dimensioni aggregate riportate negli studi precedenti per indurre un impegno neurale^{efficiente 31,32} e cerebellare²¹, gli aggregati generati sono stati mantenuti in media mTeSR1 a 25 rpm fino a raggiungere il diametro desiderato prima di iniziare la differenziazione (200 m). Al giorno 2, il diametro medio era di 221,0 ± 54,4 m (media ± SD) per la linea cellulare F002.1A.13 e 212,1 ± 42,1 m per la linea cellulare iPSC6.2. Di conseguenza, entrambe le linee di cella hanno raggiunto la dimensione di aggregazione ottimale in questo punto di tempo (Figura 1C).

Definendo il giorno in cui il seeding di iPSC è stato eseguito come giorno 0, al giorno 2, dopo aver raggiunto il diametro aggregato desiderato, l'impegno neurale è stato indotto utilizzando contemporaneamente SB431542, FGF2, e insulina, promuovendo la differenziazione neuroectodermica, così come una moderata caudalizzazione necessaria per il pattern mid-hindbrain. Successivamente, FGF19 e SDF1 sono stati aggiunti alla cultura nei giorni 14 e 28, rispettivamente, per promuovere la generazione di diversi progenitori cerebellari. Per i primi giorni di induzione neurale, è stata utilizzata una velocità di rotazione di 25 rpm, che è stata aumentata a 30 rpm dopo 7 giorni per evitare l'accumulo e l'aggregazione di aggregati più grandi (Figura 2A). Durante la differenziazione, gli organoidi hanno mostrato un'epitelizzazione più pronunciata simile alle strutture simili a tubi neurali con spazio luminale (Figura 2B). Inoltre, la valutazione della distribuzione del diametro organoide ha dimostrato una distribuzione omogenea delle dimensioni durante l'impegno cerebellare iniziale fino al giorno 14 (Figura 2B).

L'analisi dell'immunofluorescenza supporta che un impegno neurale efficiente degli organoidi derivati da iPSC è già raggiunto entro il giorno 7 di differenziazione dopo l'aggiunta di FGF2 e SB431542. Le criosezioni degli organoidi hanno rivelato molte strutture che ricordano la colorazione del tubo neurale per PAX6 e NESTIN, con la maggior parte delle cellule all'interno degli organoidi che esprimono il marcatore progenitore NESTIN nei giorni 7 e 14 di differenziazione (Figura 2C). In seguito, FGF19 e SDF1 hanno promosso la generazione di⁺strati progenitori a proliferare continuamente (PAX6 ) ed è stata raggiunta un'efficiente differenziazione neuronale, come dimostra l'espressione di TUJ1, beta-tubulina di classe III, di classe 21 e 35(Figura 2C). Inoltre, è stata osservata anche un'efficiente differenziazione cerebellare dopo 21 giorni nei bioreattori di 0,1 L VW, dimostrata dalla⁺ presenza di due diverse popolazioni cellulari: i progenitori di cellule granuli (BARLH1 - cellule, Figura 3A) e i progenitori cellulari Purkinje (OLIG2⁺ - cellule, Figura 3B). Dopo 35 giorni in coltura, diverse popolazioni di cellule all'interno degli organoidi sembravano essere organizzate in strati distinti. Diverse strutture ovali piatte all'interno degli organoidi sono state osservate con BARHL1^- progenitori cerebellari dorsali come strato continuo sul lato superficiale dell'organoide (Figura 3C,D) e SOX2^- nella regione luminale di queste strutture ovali (Figura 3D). Inoltre, i neuroni⁺ neonati TUJ1 - sembravano migrare verso la superficie, ristabilindo l'allineamento radiale sulla superficie esterna dell'organoide (Figura 3E).

Dopo la generazione di progenitori cerebellari, ulteriore maturazione è stata promossa utilizzando BrainPhys medio²⁸ integrato con fattori neurotrofici BDNF e GDNF. La colorazione dell'immunofluorescenza delle criosezioni organoidi è stata utilizzata per rilevare sottotipi distinti di neuroni cerebellari. Le cellule di Purkinje, neuroni GABAergic che esprimono la proteina calbindina legante di calcio (CALB, Figura 3F), sono stati rilevati negli organoidi cerebellari dopo il protocollo di maturazione. Inoltre, un altro importante tipo neuronale cerebellare, le cellule di granulo, è stato identificato come un sottoinsieme di cellule che coesistono PAX6 e MAP2 (Figura 3G). È interessante notare che, un pool di PAX6^- progenitori non esprimendo MAP2 è stato mantenuto fino a 80 giorni di differenziazione. Sono stati rilevati anche altri tipi di neuroni cerebellari, tra cui le cellule del pennello unipolari che esprimono TBR2 (Figura 3H) e i neuroni di proiezione dei nuclei cerebellari profondi che esprimono TBR1 (Figura 3I). Oltre all'efficiente differenziazione e maturazione cerebellare, questo sistema di coltura dinamica 3D che utilizza i bioreattori PBS 0.1 L VW ha permesso agli organoidi di rimanere vitali fino a 90 giorni, senza morte cellulare significativa e necrosi (Figura 3J).

Figura 1: Generazione di aggregati controllati dalle dimensioni mediante bioreattori scalabili. (A) Caratteristiche di progettazione del bioreactor. (B) Fotomicrografo Dio-Campo luminoso che mostra aggregati da due diverse linee iPSC nei giorni 1, 2 e 5. Barra della scala di 100 m. (C) La distribuzione delle dimensioni degli aggregati mobili da diverse linee iPSC nei bioreattori. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Generazione di organoidi umani derivati da iPSC utilizzando bioreattori da 0,1 L. (A) Rappresentazione schematica della procedura di coltura per indurre la differenziazione di iPSC a organoidi cerebellari. Le cellule sono state testate ad una densità di 250.000 cellule/mL e una velocità di agitazione di 27 rpm è stata utilizzata per promuovere l'aggregazione cellulare. Durante i primi giorni di differenziazione, gli aggregati sono stati mantenuti ad una velocità di agitazione di 25 rpm. Successivamente, per evitare l'accumulo di aggregati più grandi, la velocità di agitazione è stata aumentata a 30 rpm. (B) Caratterizzazione della forma e delle dimensioni dell'organo. Fotomicrografie di Brightfield che mostrano organoidi derivati da iPSC durante la differenziazione cerebellare nei bioreattori VW da 0,1 L. Barra della scala di 100 m. La distribuzione dei diametri organoidi dimostra che la coltura ha mantenuto dimensioni organoidi omogenee lungo il protocollo di differenziazione. (C) Induzione neurale efficiente in organoidi derivati da iPSC. Immunofluorescenza per NESTIN, PAX6 e TUJ1 durante la differenziazione cerebellare. Barra della scala di 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Differenziazione e maturazione cerebellare efficiente negli organoidi umani derivati da iPSC. (A-E) Impegno cerebellare efficiente. Analisi immunostaining per i marcatori BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD e TUJ1 nei punti di tempo indicati del protocollo di differenziazione cerebellare. (F-I) Maturazione efficiente degli organoidi cerebellari umani derivati da iPSC. Immunofluorescenza che mostra diversi tipi di neuroni cerebellari, tra cui cellule Purkinje (CALB, F), celle di granulo (PAX6 e MAP2, G), cellule pennello unipolari (TBR2) e neuroni a proiezioni di nuclei cerebellari profondi (TBR1). (J) Alta vitalità cellulare dopo la maturazione cerebellare. La colorazione live/morta (calceina-AM, verde e propidio iodide, rosso) degli organoidi ha mostrato un'elevata vitalità cellulare e nessuna prova di aree necrotiche dopo 80 giorni nei bioreattori. Barra della scala di 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Soluzioni di stock e preparazione dei supporti. Sono elencati tutti i componenti e i volumi utilizzati per preparare i supporti per il protocollo di manutenzione e differenziazione degli iPSC, nonché soluzioni stock di fattori di crescita e piccole molecole. Per le soluzioni stock, sono elencati tutti i protocolli di concentrazione e protocolli di ricostituzione delle scorte.

Tabella 2: Soluzioni per la preparazione degli organoidi per la criosezione e l'immunosostenimento. Sono elencati tutti i componenti e i volumi utilizzati per preparare le soluzioni utilizzate nella preparazione degli organoidi per la criosezione e l'immunosostenimento.

Tabella 3: Anticorpi primari. Sono elencati gli anticorpi primari, i cloni e le diluizioni ottimizzate utilizzate per l'immunostaining.

La necessità di grandi numeri di cellulare e di condizioni di coltura definite per generare tipi di cellule specifiche per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa ha guidato lo sviluppo di sistemi di coltura scalabili. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno segnalato la generazione scalabile di progenitori neurali e neuroni funzionali^32,33,34, fornendo progressi significativi nello sviluppo di nuovi modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, la ricapitolazione di alcuni eventi critici di sviluppo embrionale è ancora carente, e il mantenimento dei neuroni funzionali generati in sospensione per lunghi periodi di tempo non è ancora stato raggiunto³⁴. Qui è presentato un sistema di coltura 3D dinamico in grado di generare organoidi neurali derivati da iPSC con identità cerebellare, e di promuovere ulteriormente la maturazione in neuroni cerebellari funzionali in condizioni di definiti chimicamente e senza alimentatori nella coltura dinamica.

Prima di iniziare la differenziazione cerebellare, è fondamentale mantenere la qualità degli iPSC umani. Pertanto, al fine di non compromettere la differenziazione, non più di tre passaggi di iPSC dovrebbero essere eseguiti dallo scongelamento all'inoculazione del bioreactor. Un passaggio importante nel protocollo di differenziazione consiste nel valutare la dimensione aggregata. La dimensione aggregata ha un ruolo fondamentale nell'indurre la differenziazione verso una specifica derivazione cellulare²⁹. Oltre a questo, c'è una soglia di dimensione minima che sembra favorire la differenziazione³⁵. Come già riportato, il diametro aggregato ottimale derivato da iPSC per promuovere un impegno neurale^{efficiente 31,32} e differenziazione cerebellare²¹ è un diametro di 200 m.

Inoltre, in questo protocollo dinamico, la velocità di agitazione utilizzata nei primi giorni di coltura è fondamentale per controllare il diametro aggregato e l'induzione neurale. La coltura è iniziata alle 27 rpm, che è sufficiente per promuovere l'aggregazione di iPSC ed evitare la formazione di aggregati più grandi (si dovrebbero evitare diametri superiori a 350 m). L'agitazione utilizzata per promuovere l'aggregazione cellulare dopo il seeding di singole cellule potrebbe essere aumentata a 30 rpm senza influire sulla vitalità cellulare; tuttavia, si prevede che velocità di agitazione più elevate produrranno aggregati più piccoli. A seconda della linea iPSC, 24 h dopo il seeding delle cellule con 27 giri/min, sono previsti due scenari diversi: gli aggregati formati presentano diametri più piccoli (<200 m) o hanno raggiunto un intervallo di dimensioni tra 200 e 300 m. Se gli aggregati sono maggiori di 350 m a 24 h dopo la semina cellulare, la differenziazione non deve essere eseguita e la semina cellulare deve essere ripetuta, perché l'efficienza della differenziazione sarà molto bassa. Se gli aggregati sono inferiori a 200 m, il mezzo di spesa deve essere sostituito con il supporto di manutenzione iPSC e la velocità di agitazione ridotta a 25 rpm. Con questa regolazione, il diametro aggregato dovrebbe aumentare dal giorno 1 al giorno 2, probabilmente a causa della fusione di singoli aggregati promossa dalla diminuzione della velocità di agitazione. In caso di aggregati con dimensioni compresa tra 200 e 300 m, il mezzo speso deve essere sostituito con mezzo di differenziazione e l'induzione neurale con FGF2 dovrebbe essere avviata dopo 2 giorni in coltura. A questo punto, la velocità di agitazione dovrebbe anche essere leggermente ridotta per prevenire la morte eccessiva delle cellule, perché le cellule sono più sensibili allo stress di taglio in presenza di mezzo di differenziazione. Inoltre, l'omogeneità della popolazione potrebbe essere analizzata utilizzando il coefficiente di variazione (CV), che misura la variabilità correlando la deviazione standard con la media dei diametri aggregati, secondo l'equazione

in cui δ rappresenta la deviazione standard del diametro aggregato e μ è il diametro medio. In questo sistema dinamico, il CV medio osservato è stato di 12,5 ± 3,3% (media ± SD) per la linea cellulare F002.1A.13 e 19,0 ± 0,37% per la linea cellulare iPSC6.2 al giorno 2. Pertanto, in questo sistema, dovrebbe essere prevista una popolazione di dimensioni omogenee con un CV inferiore a 0,2 (< 20% di variazione). Dopo 7 giorni di differenziazione, il diametro aggregato medio variava da 300 a 360 m, e la velocità di agitazione è stata aumentata a 30 rpm per evitare che gli aggregati si stabilizzino nella parte inferiore del bioreaettore VW da 0,1 L.

La differenziazione degli organoidi cerebellari fino al giorno 35 e l'analisi delle dimensioni aggregate in condizioni statiche sono state recentemente segnalate²¹. Gli autori hanno mostrato che gli aggregati 3D formati e mantenuti in piastre (ad esempio, Aggrewell) fino al giorno 7 di differenziazione erano omogenei per dimensioni e forma²¹. Tuttavia, dopo aver trasferito gli aggregati a piastre di coltura di pozzo di fissaggio ultra-basso 6, gli aggregati hanno iniziato a variare in termini di dimensioni e morfologia²¹. Il giorno 35 in condizioni statiche, alcuni degli aggregati 3D hanno raggiunto 1.000 m per diverse linee cellulari, che limitavano la diffusione di sostanze nutritive e ossigeno. Al contrario, utilizzando le nostre condizioni dinamiche, gli aggregati non hanno raggiunto più di 800 m di diametro entro il giorno 35, con un migliore trasferimento di massa a causa della costante agitazione del mezzo promosso dalla ruota verticale. Inoltre, le dimensioni aggregate sono state mantenute fino alla fine del processo di maturazione, mostrando un diametro aggregato di 646,6 ± 104,2 m al giorno 90, la coltura più lunga eseguita in bioreattori VW da 0,1 L.

Un'induzione cerebellare efficiente è stata indotta dall'aggiunta sequenziale di SB431542, FGF2, FGF19 e SDF1 in questo sistema dinamico 3D. Il protocollo inizia con la combinazione di SB431542, che è un blocco di recettore del fattore di crescita trasformante (TGF-z) che inibisce la differenziazione mesendodermica, e FGF2, che ha un effetto importante nella caudalizzazione del tessuto neuroepithelial²⁵. Pertanto, l'aggiunta di queste due molecole durante i primi giorni di coltura è essenziale per promuovere la differenziazione cellulare al mid-hindbrain, il territorio che dà origine al tessuto cerebellare. Dopo l'induzione iniziale al tessuto mid-hindbrain, è necessario aggiungere FGF19 per promuovere la generazione spontanea di strutture mid-hindbrain con polarità dorsal-ventrale, così come la generazione di diversi progenitori cerebellari^36,26. SDF1 facilita l'organizzazione di strati distinti di progenitori cerebellari, come si vede nella fase di sviluppo in cui si verifica la neurogenesi cerebellare²⁷. Fino al giorno 35, queste molecole possono promuovere l'organizzazione di organoidi cerebellari che possono ricapitolare lo sviluppo cerebellare umano, che corrisponde al primo cervelletto del primo trimestre. Dopo l'organizzazione di progenitori cerebellari in diversi strati, un mezzo neuronale definito è stato utilizzato per promuovere la loro maturazione²⁸. Altri supporti utilizzati per mantenere le cellule neuronali potrebbero anche essere testati, ma sono previste efficienze inferiori. Così, in questo protocollo, BrainPhys è stato utilizzato per promuovere la differenziazione delle cellule cerebellari-impegnati in neuroni cerebellari, perché è stato segnalato per imitare meglio l'ambiente neuronale sano e per sostenere l'attività neurofisiologica dei neuroni^{generati 28}.

Utilizzando queste condizioni dinamiche, si può ottenere una diffusione più efficiente di sostanze nutritive, ossigeno e fattori di crescita. Tuttavia, alcune limitazioni sono associate all'agitazione utilizzata nel protocollo di differenziazione. Alcuni stress di taglio possono essere introdotti dal processo di agitazione, che può influenzare la sopravvivenza, proliferazione, e differenziazione delle cellule. Pertanto, durante la fase di maturazione, in cui le cellule sono più sensibili, la coltura deve essere attentamente monitorata.

La differenziazione degli organoidi cerebellari che ricordano lo sviluppo cerebellare embrionale umano è già stata riportata⁷. Tuttavia, un'ulteriore maturazione di questi organoidi cerebellari embrionali in neuroni cerebellari utilizzando colture 3D rimane una sfida. La generazione di neuroni cerebellari funzionali è stata ottenuta solo coculturing con cellule di granulo da varie^{fonti 4,7,15}. Questo protocollo ha superato con successo l'impegno cerebellare degli iPSC umani; inoltre, questo è il primo protocollo per la differenziazione di diversi neuroni cerebellari in un sistema di coltura 3D senza coculturing con le cellule dell'alimentatore. In particolare, i seguenti tipi di cellule possono essere prodotti nel⁺nostro sistema di coltura dinamica: cellule Purkinje (Calbindin , celle di granulo (PAX6⁺, /^MAP2), celle pennello unipolare (TBR2⁺) e neuroni di proiezione nuclei cerebellari profondi (TBR1 , che sono stati mantenuti in sospensione per tutto il tempo di 3 mesi.⁺

La generazione scalabile di organoidi cerebellari rappresenta uno strumento prezioso per studiare lo sviluppo embrionale del cervelletto e le vie patologiche coinvolte nella degenerazione di questo organo. Inoltre, lo screening ad alto rendimento per le molecole che ripristinano la funzione cerebellare può essere eseguito utilizzando organoidi ottenuti con questo sistema scalabile. Nel complesso, questo metodo soddisfa un bisogno insoddisfatto di un protocollo scalabile per la generazione di organoidi cerebellari di alta qualità che possono essere importanti per una varietà di applicazioni biomediche.

Gli autori YH e SJ sono dipendenti di PBS Biotech. L'autore BL è CEO e co-fondatore di PBS Biotech, Inc. Questi autori che collaborarono hanno partecipato allo sviluppo dei bioreattori utilizzati nel manoscritto. Ciò non altera l'adesione degli autori a tutte le politiche della rivista sulla condivisione di dati e materiali. Tutti gli altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Questo lavoro è stato sostenuto da Fundao para a Ciància e a Tecnologia (FCT), Portogallo (UIDB/04565/2020 attraverso Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Progetto N. 007317, DA PD/BD/105773/2014 a T.P.S e da PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), progetti cofinanziati da FEDER (POR Lisboa 2020 -Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT attraverso sovvenzione PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Generazione di Organoidi Cerebellar per Ataxia Research sovvenzione LISBOA-01-0145-FEDER-029298. I finanziamenti sono stati ricevuti anche dal programma orizzonte 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione, nell'ambito dell'accordo di sovvenzione numero 739572: il Centro di scoperta per la medicina rigenerativa e di precisione H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.