털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.

혈관 질환의 혈전 성 합병증은 선진국의 이환율과 사망률의 한 주요 원인이다. 때문에 혈전 형성시 셀룰러 및 비 셀룰러 혈액 성분 간의 복잡한 상호 작용의 생리 학적 및 병태 생리 혈전증의 신뢰성 시험은 생체 내에서 수행 될 수있다. 따라서이 문서는 털이없는 쥐의 귀 모델을 제시하고, 미세, 혈전 형성 및 혈전 진화의 생체 분석에 초점을 맞추고 있습니다. 생체 내에 형광 현미경 및 형광 염료 각각의 정맥 내 (IV) 애플리케이션을 이용함으로써, 귓바퀴의 미세 순환을 반복 분석을 용이하게 수술 준비 할 필요없이 수행 될 수있다. 또한,이 모델은 상처 치유, 재관류 손상, 또는 혈관 신생 등 다양한 문제의 생체 내 연구에 대해 적용 할 수 있습니다. 요약하면, 털이없는 쥐의 귀는에서 비비안을위한 이상적인 모델입니다생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 다른 전신 또는 국소 치료법과의 반응의 평가를 위해 피부의 미세 O 연구.

본 문서의 목적은 직접적인 관찰과 미세 분석, 혈전 형성 및 혈전 진화의 무모 마우스의 귓바퀴에 적용 생체 내에 현미경의 기술을 설명하는 것입니다. 1000 년 1의 발생율로, 정맥 혈전증 여전히 이환율의 일반적인 원인이다. 진단, 예방 전략 및 치료는 최근에 개발되었지만, 정맥 혈전증의 3 분의 1은 폐 색전증 ^1로 나타난다. 동맥 혈전증은 선진국에서 사망의 가장 흔한 원인이되는 심장 혈관 질환에 중요한 역할을한다. 동맥 경화성 플라크의 파열에 따라 동맥 혈전증은 심장 마비, 장간막 경색 및 뇌졸중에 참여하고있다. 모든 수술은, 혈액 성분에 피하 구조를 노출 혈류 역학을 변경하고 환자를 고정시킨다. 낮은 사지, 기관 t의 endoprosthetic 수술에서ransplantation 및 플랩 수술 혈전 합병증의 빈번한 원인입니다. 특히 미세 혈관 혈전증 자주 인해 임상 증상의 부족으로 돌이킬 수없는 손상을 야기한다. 마찬가지로, 미세 혈관 혈전증은 다른 사람의 사이에서 혈전 성 혈소판 감소 성 자반증, 패혈증, 파종 성 혈관 내 응고, 항 인지질 증후군, 만성 정맥 부전, 등 여러 질병에 중요한 규칙을한다.

치료 및 혈전증의 예방을위한 여러 가지 새로운 약물은 최근에 개발되었지만, 항 혈소판 약물과 항 응혈은 여전히 ​​부작용, 부족 길항제가 있고, 장기간 효과가 있습니다. 이 결함은 응급 의료의 문제로 이어집니다. 따라서, 더 많은 연구가 거의 시험 관내에서 모사 될 수 없다 혈전증 동안 발생하는 복잡한 프로세스를 발견 할 필요가있다.

털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스} 런던 동물원에서 1926 발견되었다.때문에 14 번 염색체에 유전자 결함, 동물이이 선박의 생체 내에 현미경에 액세스 잘 혈관 귓바퀴를 만드는 출생 후 하루 10 후 털을 잃는다. 귀의 평균 두께는 300 μm의입니다. 이것은 연골에 의해 분리되어 진피의 두 층으로 구성. 연골의 볼록 등쪽에서 3 개 혈관 번들 귓불을 입력한다. 혀끝 혈관 호 및 기초 션트는 세 개의 번들을 연결합니다. 세정맥 200 μm의 (기부) 10 ㎛의 (정점) 사이의 직경을 갖는다. 근접 메시 모세 혈관 빈 머리 ² 여포 둘러싸고 있습니다. 털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 해부학은 귓바퀴 혈전증 연구를위한 강력하고 비용 효율적인 모델을 만든다.

모든 생체 실험 (7221.3-1-006 / 15) 동물의 보호 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 (실험 동물 자원 연구소, 국립 연구위원회)에 독일 법률에 따라 실시 하였다.

동물의 1. 일반 상태 유지

1. 4 ~ 6 주 세 남성 SKH1 - 시간의 ^시간의 쥐 실험을 수행합니다. (20)와 25g 사이 무게 동물을 사용합니다.
2. 물과 음식을 자유로이에 지속적으로 액세스하는 무균 시설에서 26 ° C 24의 표준화 된 조건 약 60 %의 상대 습도에서 동물을 유지합니다.
3. 하나 개의 새장에 다섯 개 수컷에 계속. 자신의 웰빙을위한 동물의 하우징 동안 침구와 농축 자료를 제공합니다.

동물 2. 사전 약속

1. (예를 들면, 칸 나비 노이드, 5m 마우스 체중과 각 약물로드인슐린 주사기로 g / kg 체중 (BW)). 혈전 유도하기 전에 약 30 분을 관리.
2. 엄지와 집게 손가락과 새끼 손가락으로 마우스의 꼬리와 마우스의 목을 잡고함으로써, 동물 스트레칭과 복부의 왼쪽 하단 사분면에 약 복강 (IP)을 주입. 15 분 동안 케이지로 다시 동물을 넣습니다.
3. 케타민 (90 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (25 ㎎ / ㎏ 체중)로 마취를 준비한다. 혈전 유발 15 분 전에 마우스를 마취. 케이지에 마우스를 넣어 살짝 꼬리를 당겨, 그리고 인슐린 주사기와 마취제의 IP를 주입.
4. 마취의 발병 때까지 다시 케이지에 마우스를 넣습니다. 충분한 마취를 확인하려면 집게로 꼬리를 꼬집어.
5. 인슐린 주사기로 (5 %, 150 kDa의 FITC 덱스 트란)의 제상 형광 염료 - 표지 된 덱스 트란의 0.05 mL의로드. 주사기를 작성하는 동안, 기포가 남아 있지 않도록 아주 작은 intravenousl 때문에Y는 (IV) -administered 기포 동물 용 치명적일 수있다.
6. 의 인쇄면이 밑으로 가도록 위치에 가열 플레이트에 마취 마우스를 놓습니다. 37 ° C로 가열 플레이트를 조정한다.
7. 마우스의 각막에 눈 연고를 넣습니다. 피부를 소독하고 멸균 악기를 사용합니다.
8. 오른쪽 손잡이의 두개골과 꼬리 가장자리에 폴리 프로필렌 7/0 두 봉합 스티치. 가능 (도 1b)와 같은베이스 가장자리에 근위로 스티치를 놓는다.
9. 지느러미의 위치로 마우스를 이동. 접착제 스트립을 사용하여 acrylglass 플랫폼에 대한 모든 다리를 수정합니다. 앞니 아래에서 봉합사를 걸고 접착제 스트립과 acrylglass에 봉합사를 행해서 배굴에 헤드를 위치.
10. 동작 실체 현미경 아래 플랫폼에 동물을 이동시키다. 16X 배율을 사용합니다.

왼쪽 경정맥과 FITC - 덱스 트란 사출 3. 준비

참고 : 마이크를 들어오른쪽 귀 roscopy은, 왼쪽 경정맥을 준비합니다.

1. 메스를 이용하여, 부교감 꼬리 방향의 목의 왼쪽에있는 피부에 5 mm의 절개를 생성한다. microforceps 및 microscissors와 피하 조직을 해부하다. 폴리 에스테르 8/0 봉합 또는 electrocoagulation와 결찰 교차 선박 중 하나.
2. 혈관을 건드리지 않고 microforceps 및 microscissors를 사용하여 외막에서 정맥 무료.
3. 형광 염료의 주입을 위해 제조 된 인슐린 주사기를 사용한다. 조심스럽게 정맥을 관통하지 않고 microforceps와 혈관 벽을 잡아. 주사기로 팽창 된 혈관 벽을 관통하여 FITC 덱스 트란 IV 주입.
4. 면봉을 사용하여 주사기를 철수 후 출혈을 중지합니다. 혈액을 피하고 귀 오염을 염색.

생체 내에 형광 현미경의 오른쪽 귀 4. 위치

1. acrylglass C까지 가열판에 동물을 이동시켜가열판위한 슬롯과 귀 위치하는 0.5 cm 높이의 평면 onstruction.
2. 접착 스트립을 이용하여 가열 플레이트 상에 동물을 고정면. 귀 선단 부분이 평면에서 평면에 위치 될 수 있도록 귀 (도 1b)에 대해 0.5 cm 높이의면 옆에 귀 기지에서 비교적 강한 볼록 연골 놓는다.
3. 귀를 배치하기 위해 acrylglass 평면에 상온 0.9 %의 NaCl 한 방울을 추가합니다. 오목 복부 측 기정 봉합 0.9 % 염화나트륨 드롭에서 아래쪽으로 향하도록 오른쪽 귀를 놓는다. 면봉을 사용하여, 염화나트륨의 드롭을 흡수하고 모세관 힘이 acrylglass에 귀 평면을 첨부 할 수 있습니다.
4. 귀의 위치를 ​​해결하기 위해 acrylglass에 봉합 테이프로.
5. 귀 볼록 등쪽에 0.9 % NaCl을 실온에서 한 방울을 추가한다. 조심 번째 입력 기저 용기를 압축하지 않고 귀에 한 커버 슬립 (0.5 cm 직경)을 넣어전자 귀. 면봉을 이용하여 커버 슬립하고 귀 혈관 대상 사이의 거리를 최소화하기 위해 커버 슬립 아래에서 최대한의 NaCl을 제거한다.

오른쪽 귀 5. 생체 내에 형광 현미경 및 혈전 유도

1. (-; 510; LP : 520 FT 490 내지 450) FITC 덱스 트란 시각화를위한 생체 내에 형광 현미경을 조정한다. 광원으로 가변 100 W 수은 램프를 사용한다. DVD 레코더에 고해상도 흑백 CCD 카메라를 연결합니다.
2. 생체 내에 형광 현미경의 책상에 고정 납치 귀 가열 플레이트를 포함하는 acrylglass에 동물을 전송합니다.
3. 직경 400의 선행 성 혈류에 60 μm의 - - 600 μm의 / s 20X 배율 (20X / 0.95 개구 수) 20 % 광량을 사용하여 정맥 용기 50를 검색.
4. 63X magnificatio의 수침위한 커버 슬립을 실온에서 물을 적하 추가n 개의 목표 (63X / 0.95 개구 수). 1 mm 직경 정맥 주사기를 사용하여 현미경의 목적의 드롭 놓습니다. 물 방울과 커버 슬립과 목적에 문의 충분한 물을 추가합니다.
5. 즉시 물방울의인가 후, 직경 및 혈액 흐름의 오프라인 측정 20 % 광 강도로 20 초 동안 기록을 시작 용기.
6. FITC 덱스 트란의 주사 후 혈전 유도 5 분 시작. 이러한 목적을 위해, 100 %의 발광 강도를 올릴.
7. 혈전 유도시 혈액 흐름을 체크 30 초의 기간 내에 2 초 동안 현미경의 개구부를 닫는다. 혈액 흐름을 지속하는 경우, 다시 조리개를 연다. 정지 혈류량의 경우, 30 초 동안 혈관을 관찰한다.
   참고 : 흐름이 30 초 이상이나 피가 역행 흐르는 경우 여전히 유효하면 혈관이 폐색으로 분류됩니다. orthograde 혈액의 흐름이 다시 시작되면 완전히 조리개와 CONTIN을 엽니 다 상술 한 바와 같이 UE 혈관 폐색까지 혈전 유도가 발생한다. 조기 혈전 유도시, 상기 개구는 혈류를 확인하는 폐쇄 된 시간은 거의 연속적인 에피 조명을 유지하기 위해 가능한 한 짧은 것을 보장한다. 나중에, 혈전 성장 동안, 용기가 적은 형광 염료 관류이므로 계속 관찰 할 수있다.
8. 선택과 귀 당 5 개 혈관을 폐색. FITC 덱스 트란의 주사 후 약 1 시간에 현미경 혈전 유도 시간을 제한한다.

6. 후속 활동

1. 경피 폴리 프로필렌을 6/0 봉합사를 사용하여 목의 상처 봉합을 수행합니다.
2. 마취에서 회복하는 동안, 케이지에 다시 마우스를 놓고 적외선을 사용하여 동물을 따뜻하게.
3. 혈관과 혈류 속도의 직경의 측정을 가능하게 소프트웨어로 DVD 레코더에서 기록 된 데이터를 전송합니다.

1. 동물 복구하고 48 시간 동안 모든 주입 FITC-덱스 트란을 제거 할 수 있습니다.
2. 상술과 같이, 우측 경정맥 및 좌측 귀를 제조 이번에 재실행.

8. 조직 Asservation

1. 왼쪽 귀의 생체 내에 형광 현미경 후 샘플 0.5 ㎖를 눈 구후 정맥 얼기 혈액의 유리 모세관을 이용. 정맥 혈액이 모세관를 통과 할 때까지 조심스럽게 속이 움직임 내측 눈꺼풀 각 관통. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 혈액 튜브 프로브를 수집.
2. 채혈 후에 꼬리 정맥 내로 500 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 주입하여 동물을 희생.
3. 백혈구, 적혈구, 혈소판, 헤모글로빈 및 적혈구 용적률의 정량적 평가에 대한 혈액 분석기를 사용하여 혈액 세포를 계산합니다.
4. 10m 2,500 XG하고 실온에서 나머지 EDTA 혈액을 원심에. 피펫 및 추가 조사에 대한 혈장을 동결.
5. 가위를 사용하여 귓바퀴을 절감하고 조직 학적 검사에 대한 4 %의 포름 알데히드에 오류를 수정.

혈전의 치료 효과 카나비노이드

FITC 덱스 트란 0.05 mL를 주입하면, 광독성 혈전 유도는 (도 2 및도 3). 내피 병변 및 정수리 혈소판 플러그의 형성을 유도 본 연구에있어서, 칸 나비 노이드의 IP 주입 (5 ㎎ / ㎏ 체중) 또는 비히클 후의 혈전 유도는 모든 세정맥에서 혈전 혈관 폐색 (도 4) 결과. 비히클 - 처리 된 동물에서의 혈전 형성 시간 (430 개) S (:, 637의 75 ^{번째 백분위} 수 (330)의 25 ^{번째 백분위} 수)이었다. 어느 칸 나비 디올 (CBD)도 WIN55,212-2 (WIN) 관리는 혈관 폐색 시간에 관련된 영향을 보여 주었다. 240 : 그러나, 내인성 카나비노이드 아난다 상당히 270 s의 혈전 형성과 혈전 혈관 폐색에 필요한 시간 (25 ^번째 백분위 수를 감소에스; 75 ^백분위 360 S, P <0.05 대 비히클).

아난다 미드의 가수 분해 및 제품의 후속 사이클로 옥 시게나 제 - 의존 변환, 아라키돈 산, 아난다 미드 의한 혈전 형성에 관여하는지 여부를 테스트하기 위해, 불특정 시클로 옥 시게나 제 억제제 인 인도 메타 신 (indomethacin)은 다른 세트의 실험에서 아난다 마이드 (도 5)와 결합시켰다. 다시, FITC 덱스 트란, 아난다 미드 (10 밀리그램 / kg BW)를 0.1 mL의 주입시에 차량 (P <0.05 대 비히클)에 비해, 혈전 형성 시간을 감소시켰다. 인도 메타 신 처리만으로는 세정맥 가림 시간에 영향을 미치지 아니하는 동안 (300 개) S (25 개 ^{번째 백분위} 240의 75 ^{번째 백분위} 수 : 420 개 (S))에, 아난다 처리 동물에서 사이클로 옥 시게나 제 억제에 상당히 연장 혈전 형성, 160 개 (S)의 평균에 비해 (25 개 ^{번째 백분위} 100의 75 개 ^{번째 백분위} 200 S) 아난다 정화용 후 atment 만 (P <0.05 대 아난다 미드). 차량 처리 및 인도 메타 신 / 아난다 공동 투여 후 혈관 폐색 시간은 크게 ² 차이가 없었다.

도 생체 내에 현미경 용 귀 경정맥 (A) 및 배치 (B)의 제조 (1). 조작 실체를 사용하여 (A)의 우측 경정맥을 준비한다. 왼쪽 귀의 위치에 대한 봉합 FITC-덱스 트란의 주입 전에 봉합된다. 좌측 경정맥의 사전 절개에서 상처 봉합 경피 (B)로 폐쇄된다. 왼쪽 귀는 폴리 프로필렌 7/0 봉합사로 고정되어 있습니다. 커버 슬립은주의 깊게 귀 기저 혈관을 압축하지 않고 배치됩니다. 가열판은 전체 실험 동안 동물들의 체온을 유지한다.톰 / 파일 / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 생체 내에 현미경 및 혈전 유도. 동일한 세정맥은 10X, 20X의 (A) 및 후 (B) 혈전 유도하고 (왼쪽에서 오른쪽) 63X 배율 전에 도시된다. 혈장은 형광 염료 - 표지 덱스 트란 (FITC-덱스 트란, 5 %) 0.05 mL로 염색된다. 혈전은 *로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 세정맥 혈전 유도 그림. 동일한 세정맥는 befor를 나타낸다이자형 100의 (B) 이후, 에피 조명 300의 (C) 후 생체 내에 형광 현미경에 의해 (A). 반응성 산소 종은 청색광 에피 조명에 의해 생성 된 - FITC의 덱스 트란 (450 내지 490) 및 내피 손상. 따라서, 혈소판 활성화 및 혈전 완전한 혈관 폐색 (C)에이어서, 주요 정수리 혈전 형성 (B)와, 그 결과, 노출 된 피하 구조에 부착. 이 수치는 Grambow ^3에서 수정되었습니다. 혈전은 *로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험 프로토콜을 표시 그림 4. 플로우 차트. </ 각 카나비노이드 (5/10 밀리그램 / kg BW) 복강 주사에 의해 강한> 카나비노이드 처리 30 IVM 전에 최소 및 IVM을 1 시간으로 제한 하였다 일 0의 오른쪽 귀에서 혈전 형성의 유도를 실시 하였다. 47 시간 후, 2 일에, 같은 프로토콜은 혈액을 샘플링하기 전에 마우스의 왼쪽 귀에 적용되었다. 이 수치는 Grambow ^3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단일 칸 나비 노이드 치료 및 사이클로 옥 시게나 제 억제 후 5 세정맥 혈전 형성을 그림. 광 / 염료 혈전 유도을받은 생쥐의 정맥 폐색 시간. (A) 동물이 함유 DMSO 비히클 (VEH)으로 처리 된 또는 칸 나비 노이드와 아난다 마이드 (AEA), WIN55,212-2 (WIN), 또는 칸 나비 디올 (CBD) (5 ㎎ / ㎏ 체중, N = 5). 5 % 덱스 트란 FITC 0.05 mL를 앞서 혈전 유도로 정맥 주사 하였다. 다른 환경에서, 0.1 mL의 5 % FITC 덱스 트란 (B) 아난다 마이드 (10 밀리그램 / kg BW)를하여 혈전 형성에 대한 사이클로 옥 시게나 따라 제품의 영향을 평가하는 인도 메타 신 (인도) (5 ㎎ / ㎏ 체중)과 결합시켰다 아난다 미드 (N = 5). 계급에 대한 크루스 칼 - 월리스 편도 ANOVA는 던의 사후 분석 (A와 B)으로 이어졌습니다. 값은 평균 및 IQR (5 ^번째, 25 ^번째, 75 ^번째, 95 ^{번째 백분위} 수)로 주어진다. * P <0.05 대 비히클, # P <0.05 대 아난다 미드, P <0.05 대 인도 메타 신 §. 이 수치는 Grambow ^3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귓불에서 성공적인 혈전 유도에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 문제 해결을 위해 프로토콜의 각 단계는 괄호 안에 표시됩니다.

육주와 표피의 낮은 각화로 - 시험 조건은 4 세의 나이에 젊은 동물에 이상적입니다. 이전 동물에서 혈관의 시각화 품질로 인해 피부 표면과 타겟 용기 (단계 1.1) 사이의 거리보다 더 적은 대등하다.

검사 지역에 FITC 덱스 트란의 혈관 외 유출을 방지하기 위해, 고정 봉합 가능한 한 가장자리에 배치되어야한다. 스티치에 근접하여, 형광 염료 extravasate 및 혈관 외 공간과 용기 사이의 콘트라스트를 감소시킬 수있다. 염료의이 넘쳐 천천히 진행. 종래 FITC 덱스 트란의 주입 좋은을 15 분 이상 한 바와 같이 봉합 스티치되면생체 내에 현미경 검사 조건 (단계 2.8)을 보장한다.

FITC 덱스 트란 renally 서서히 제거된다. 고 분자량 덱스 트란 (150 kDa의)와 형광 색소의 조합은 혈관 외 유출 및 배설을 지연시킨다. 본 연구에서, 현미경 및 혈전 유도 시간은 혈전 형성 시간에 배설하고 낮은 형광 염료 혈장 농도의 영향을 방지하기 위해 1 시간으로 제한 하였다.

주사기를 충전하는 동안 주사기 심지어 작은 IV 투여 기포 동물 (단계 2.5)에 대한 치사 수 있기 때문에, 기포는 주입 남아 있지 않을 것이다. IV를 주입 후에 경정맥에서 주사기를 당길 때, 일정한 출혈 (단계 2.6)를 발생한다. 혈액이나 FITC-덱스 트란과 이후 검토 귀 오염은 실질적으로 어렵거나 불가능한 생체 내에 현미경을합니다. 따라서, 반대측 귀 경정맥의 준비를하는 것이 좋습니다.

커버 슬립은 신중 추가적인 압력 (단계 4.5)없이 적용되어야한다. 그렇지 않으면, 귀 전체에 혈액의 흐름으로 인해 혈전 유도하는 동안 폐쇄 시간을 줄일 수있는 기저 혈관의 압축 둔화된다. 의 정확한 위치커버 슬립은 실체가 확인 될 수있다. 정맥 특히 커버 슬립의 가장자리에 지속적으로 작성해야합니다. 커버 슬립은 생체 내에 형광 현미경의 목적과 물방울의 접촉을 보장하기 위해 사용되어야합니다. 침지는 100 %의 광 강도와 용기의 에피 조명을 보장하기 위해 전체 혈전 유도시 획득되어야한다. 물 드롭의 안정적 위치를 달성하는 가장 좋은 방법은 커버 슬립을 사용하는 것입니다. 가습 반투명 플라스틱 랩 또는 직접 피부에 드롭 퍼팅 물과 변덕 침지 드레인시킨다.

의의 및 마우스를 가져 사나이 SKH1 - 시간의 ^시간의 귓불의 한계

SKH1 인사 관리 ^HR 털 ^마우스, 생체 내에 현미경 ^{2, 4를} 이용하여 혈관의 귓불 직접 촬상 기능을 허용 5까지. 귀에의 조직학은 인간의 피부 ^2의 해부학 유사합니다. 전체 미세 혈관 망 직경 100 μm의 최대 세정맥, 세동맥, 모세 혈관으로 이루어진 시각을 실시간으로 검사 할 수있다. 이는 털이 쥐의 귀 상처 치유 ^{6, 7,} 축 패턴 플랩 ^{2, 5,} 고분자 누설 ⁵ 및 미세 혈관 혈전 형성 ^{8, 9, 10의} 연구에 적절한 모델을 만든다. 직경 100 μm의 최대 용기의 유용성이 모델에 제한된다. 전단 응력, 혈액의 흐름, 그리고 선박 아키텍처는 크고 작은 혈관에 차이가 있습니다. 따라서, 경동맥 또는 대퇴 혈관과 같은 모델은 혈관 혈전 형성에 초점을 맞춘 연구에 더 적합 할 수있다.

예컨대 햄스터 ^(11)의 볼과 같은 미세 혈관의 생체 내에 가시화 모든 대체 모델은 마우스 ^{12, 13,} 또는 래트 ⁹ cremaster 근육의 등쪽 피하 지방 챔버 ^(10)는 수술 준비를 필요로한다. 털이없는 마우스의 귀 선박은 수술에 의한 조직 손상의 위험없이 액세스 할 수 있습니다, 그래서 털이 마우스 ^(14)의 귓불에 염증, 혈관 수축과 지혈의 활성화에 의해 측정 파라미터에 영향이 없다. 어떤 수술 준비가 필요하지 않다하더라도, 이미지 해상도 및 선명도는 다른 모델 (예를 들어, 등쪽 피하 지방 챔버와 cremaster 준비)에 필적한다. 높은 영상 품질을 달성하기 위해, 프로토콜은 t의 적은 각화 젊은 쥐를 철저하게 이어되어야합니다그는 사용할 수 있습니다 진피.

때문에 자신의 피상적 현지화, 귀의 혈관은 쉽게 생체 내에 형광 현미경으로 공부하실 수 있습니다. 그들은 혈관 직경의 자신의 조정을 통해 동물의 체온 조절을 할 수 있습니다. 따라서, 실내 및 체온 모두 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 표준화되어야한다. 모든 귓불 혈관은 피부 조직의 말초 혈관을 나타냅니다. 중앙 용기에 비해 말초 혈관 및 다른 조직 학적 구조 수용체 발현을 특징으로한다. 따라서, 다른 모델 (예를 들어, 장간막 정맥 및 소동맥의 준비는) 중앙 혈관와 관련된 특정 문제의 시험에 대한 더 합리적 일 수 있습니다.

전술 한 모델의 또 다른 제약은 다른 마우스 균주로 공통 털이없는 SKH1 인사 ^인사 마우스를 사용과 관련된 제한된다. 따라서, 유전자 변형 털이없는 쥐를 사육하는 것은 노동이 될 수 있습니다빚을내는 비싼. 화학 및 기계 머리 제거 지역 염증을 일으킬 수 있으며 시각화 품질이 떨어질 수 모근을 제거하지 않습니다. 표면 및 타겟 용기 사이 좋은 시각화 품질과 낮은 거리 신뢰성 혈전 유도 중요하다; 다른 모델 (예를 들어, 등쪽 피하 지방 챔버) 마우스의 모피와 특정 마우스 변종을 필요로 연구에 더 적합 할 수있다. 한편, 귓불 모델은 다양한 병적 인 상태의 시뮬레이션을 할 수 있습니다. 예를 들어, 매우 조직 관류의 미세 세 신경 혈관 다발 ^(15)의 두개의 결찰 후에 검사 할 수있다. 상처 치유하는 동안 미세 분석은 털이없는 마우스 모델 ^(16)의 귀 사용하기에 적합한 다른 예이다.

일부 실험적인 질문의 경우, ASSE 서로 다른 시점에 같은 동물을 검사하는 것이 중요하다SS 처리의 시계열. 최근에 게시 된 실험 연구에서, 왼쪽 귀에서 혈전 유도는 오른쪽 귀 ^3의 사전 처리에 의해 변경되지 않았습니다. 따라서, 모델의 또 다른 장점은 두 개의 서로 다른 시점에 같은 마우스의 각 귀에 혈전 유도의 가능성이다. 동물 보호에 관하여, 실험 절차는 동물에 대한 최소 침습적이고, 마우스는 수술에서 회복 또는 실험 사이의 등쪽 피하 지방 챔버를 수행 할 필요가 없습니다. 모든 동물에서, 귀 당 최소 5 개 해당 선박은 광독성 혈전 유도에 의해 폐색 될 수있다, 너무 많은 데이터가 동물의 소수 수집 할 수 있습니다.

의의 및 생체 내에 현미경 및 혈전 유도의 제한

생체 내에 형광 현미경 실시간 ⁵ 미세 시각화 할 수 있습니다. 정맥 투여 후 FITC-dextran은 혈장 얼룩. 그것은 완전한 혈관 폐색까지 유도의 시작부터 혈전 성장의 관찰을 가능하게한다. 흰색과 붉은 혈액 세포는 조영제의 차이로 식별 할 수 있습니다. 추가 조사 (예를 들면, 과립구 - 내피 세포 상호 작용)의 경우, 백혈구는 rhodamin-6G로 염색 할 수 있습니다.

실험 기록 및 오프라인 분석 적혈구 속도, 혈관 운동 세동맥, 모세 혈관의 밀도, 미세 혈관 직경의 생체 측정을 가능하게한다. 이러한 매개 변수는 혈전 형성, 플랩 관류 및 상처 치유에 중요한 역할을한다. 생체 내에 현미경으로 관찰 직접 지속적으로 실험 ⁵ 동안 이러한 동적 관류 매개 변수와 변화를 정량화 할 수 있습니다. 크세논 세척, 조직 산소 수준, 레이저 도플러 또는 염료 확산과 같은 다른 기술이 또한 최소 침습하지만 이들은 t로 제한혈액의 흐름의 그는 간접 측정. 이 실험 결과의 유효성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 직접 방식이 바람직하다.

형광 염료의 반응 및 국소 내피 ^(17)를 손상 활성 산소의 방출의 특정 파장 결과의 빛. 내피 세포에 비해 유동성 혈액 입자의 폭발 시간은 1000 배 이하이다. 따라서, 혈전 효과 인해 광독성 내피 병변 기본이고 직접 광독성 혈소판 활성화 ^(18)에 기인하지. 혈소판은 노출 피하 매트릭스에 접촉하여 활성화 혈소판 플러그 ⁽¹⁹⁾ (도 3)을 형성한다. 혈전이 메커니즘은 불안정 협심증 및 혈관 문합 많은 상황에서 뛰어난 역할을한다.

라이트 / 염료 혈전 유도는 ALT보다 덜 침습적 인풍선 카테터 ^(20), 전류 ^(21), 레이저 ^{(22), (19)을} 통해 염증 병변의 내피를 생성 ernative 방법. 광 / 염료 혈전 유도는 대물의 광속 엄격 국부적으로 작용한다. 따라서, 인접하는 용기에 직접 영향을받지 않으며 후속 혈전 유도에 사용될 수있다. 라이트 / 염료 혈전 유도 세정맥 및 세동맥 모두에서 수행 될 수있다. 소동맥의 에피 조명이 폐쇄 시간 ^{(19)에 영향을} 미칠 수있는, 혈관 경련을 일으킬 수 있기 때문에 본 연구에서는 정맥 독점적으로 처리 하였다.

마취 동물 실험 의학 확립 자일 라진 및 케타민의 조합을 이용하여 수행 하였다. 마약은 IP를 주입 하였다. 상기의 용량으로, 1.5 30 분 및 수면 수술의 허용 오차 충분한 마취 - 2 시간은 달성되었다.

털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귀는 물론 상처 치유 및 플랩 연구에 설립된다. 여러 연구 혈전 유도 및 혈전 용해 ^{3, 23, 24, 25, 26} 성공적 모델을 사용했다. 프로토콜이 제대로 수행하는 경우 털이 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귓불에서 생체 내에 현미경 미세 순환 및 혈전 형성의 연구에 대한 신뢰할 수있는 쉽고 효율적인 도구입니다. 모델이 생체 내에서 미세 순환의 중요한 매개 변수를 평가하는 훌륭한 실험 설정을 제공하면서는, 다양한 병리학 적 조건을 시뮬레이션하기 간단합니다.

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