관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

우리는 뉴런의 CA1-CA3 배열을 유지 체외 펼쳐진 해마를 개발했다. 관통 마이크로 전극 배열과 결합하여 신경 활동 모두 종 방향 및 횡 방향으로 모니터링 할 수있다. 전체 해마 전파를 동시에 기록 할 수 있으므로이 방법은 해마 슬라이스 제제에 비해 많은 장점을 제공한다.

이 프로토콜은 해마 신경 활동에 매핑하는 마이크로 머신 어레이와 결합 체외 플랫 해마 준비 새로운 제조 방법을 설명한다. 가로 해마 슬라이스 준비는 해마의 전기 생리학을 연구하는 가장 일반적인 조직의 준비입니다. 길이 해마 슬라이스는 해마 연결 길이를 조사하기 위하여 개발되었다. 그 두께가 충분한 산소 확산을 허용하기 때문에 본래 마우스 해마는 시험관 내에서 유지 될 수있다. 조직의 일부가 누락되거나 접혀 하나이기 때문에, 이러한 세 가지 제제는 신경 전달에 대한 직접 액세스를 제공하지 않는다. 펼쳐진 그대로 해마는 가로와 체외에서 해마의 신호 전파의 전체 범위를 분석 할 수있는 조직에 직접 액세스를위한 평면 구성의 종 방향 연결을 모두 제공합니다. 효과적으로 t에서 신경 활동을 모니터하기 위해서그 세포층, 정의를 제조 하였다 마이크로 전극 어레이 (PMEA)을 만들어 관통 펼친 해마인가. 높이 200 μm의 64 전극 PMEA 깊은 마우스 해마 내부의 신경 활동을 기록 할 수있다. 펼친 해마 준비 및 PMEA의 독특한 조합 잡음비 높은 신호 해마의 이차원 CA1-CA3 영역의 속도 및 신경 활동의 전파 방향을 연구하는 새로운 시험관 도구를 제공한다.

신경 신호의 신경 전도 또는 전파를 이해하는 것은 뇌 ^1-3의 정상적인 기능 및 병리학 적 조건 모두에서 신경 통신의기구의 결정에 매우 중요하다. 해마는 메모리, 및 공간 추적 같은 몇몇 뇌 기능에 중요한 역할을 극적 행동뿐만 아니라 ^{1,6- 영향} 여러 병리학 적 변화에 관여하기 때문에 뇌에서 가장 광범위하게 연구 한 구조이다. 해마가 복잡한 조직을 나타내고 있지만, 그 구조의 다른 요소가 용이하게 식별되고 슬라이스 제조 ^4-6에 액세스 할 수있다. 해마의 횡단 방향으로, 신경 활동은 치아 이랑 (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5-를 포함 트라이 시냅스 경로를 통해 전파하는 것으로 알려져있다. 이 시냅스 전달 축삭 전도의 대화를 위해 중요한 역할 것으로 여겨진다이 가로 회로 ^4,6에에. 그러나, 신경 신호의 전달 종횡 ^4,6 모두에서 발생한다. 이 해마가 완전히 전파 ^(4)의 특정 방향으로의 관찰을 제한 조각 제제를 사용하여 조사 할 수 없다는 것을 의미한다. 세로 슬라이스 종축을 따라 ⁵ 축삭 경로를 조사하기 위해 개발되었다. 연구자들은 주로 가로 및 세로 축에 각각 ⁶ 함께 행동 별 감마 세타 진동을 관찰했다. 이러한 동작은 개별적으로 연구되고있다, 아직 두 방향에 대한 동시 접근이 이러한 행동을 이해하는 것이 중요하다. 심지어 그대로 해마 제제의 발달로 인한 해마 ^(4)의 절첩 구조로 조직 전체에 걸쳐 전파를 모니터하는 것은 곤란하다. 펼쳐진 해마는 포장 뉴런에 대한 액세스를 제공합니다이차원 평면 셀 ^7,8 층의 형태 일 수있다.

치아 이랑 (DG) (도 1)을 전개함으로써, 해마, 종횡 연결 모두 CA3 및 CA1이 모두 함유 이차원 시트에 배치 된 피라미드 전지 층으로 그대로 유지되는 직사각형 구성으로 편평한 형상을 채용 신경 전달을 조사하기 위해 이용 될 수 신경 조직의 평평한 부분을 이탈 (도 2) ^8. 신경 활동이어서 개별 유리 피펫, 미세 전극 배열, 자극 전극뿐만 아니라, 전압 감응 염료 (VSD) ^{-3,7,8-으로} 모니터링 할 수있다. 또한, 트랜스 제닉 마우스에서 유전자 부호화 전압 표시기 전파 패턴 ^(9)을 추적하는 데 사용될 수있다.

펼친 해마 네트워크의 평면 구성은 광 기록 방법뿐만 아니라 미세 전극 배열에 매우 적합하다. M시중에서 판매하는 배열의 OST는 평면 또는 로우 프로파일 전극을 제조하고 조직 슬라이스 배양 신경 세포 ^10-12 모두에서 신경 활동을 기록 할 수 있습니다. 뉴런의 소마가 조직으로 깊은 위치 보낸 신호가 그대로 조직으로부터 수득되는 경우에는, 신호 대 잡음비 (SNR)가 감소한다. 고 종횡비 미세 전극 배열은 SNR을 향상시키기 위해 필요하다.

이러한 취지, 관통 미세 전극 배열 (PMEA)은 실험실에서 개발되었으며, 펼친 해마 ^7,13으로 20 ㎛, 직경 200 ㎛, 높이 64 스파이크를 삽입하여 조직으로 조사 할 수있는 기능을 제공한다 . 미세 전극이 배열은 전압 감응 염료 촬상에 비해 더 높은 SNR을 가지고 있으며, SNR은 실험 ^7,13 동안 안정적으로 유지. 해마 펼친 준비 및 PMEA의 조합은 투자 할 수있는 새로운 방법을 제공한다2 차원 평면 위에 신경 전달을 igate. 이 기술을 사용하는 실험들은 이미 신경 활동 독립적 시냅스 또는 전기 시냅스 ^(7)의 전파 될 수있다 해마에서 신경 신호 전달 기전에 대한 의미있는 결과를 수득했다.

참고 : 동물 실험 프로토콜을 검토하고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. P20에 P10의 나이에 하나의 섹스 CD1 마우스는이 연구에 사용됩니다.

수술 및 실험 녹화 1. 솔루션

1. 염화나트륨 (124)의 KCl 3.75, KH ₂ PO4 1.25, _황산 2의 _NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 _CaCl2를 2 : (MM)를 포함하는 일반 인공 뇌척수액 (ACSF) 버퍼를 준비합니다. 실험의 처음에 세척 시스템뿐만 아니라, 박리 후의 조직이 정상 복구 ACSF 사용.
2. 해마 해부하는 동안 사용 과달 자당 ACSF 준비 (MM) : 자당 (220)의 KCl 2.95,의 NaH ₂ PO 4 1.3, _황산 2의 _NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 염화칼슘 _{2 2.} 그대로 해마 조직 준비 간질 활성을 유도하기 위해, 정상인 ACSF에 4- 아미노 피리딘 (4-AP)를 추가100 μM의 농도.

본래 해마 준비 2. 수술

1. 건조기 유리 항아리 (특정 재료 및 장비 1 위)의 하단에있는 챔버로 이소 플루 란 (1 ml)에 드롭하고 동물과 접촉하지 않도록 하단부의 표면을 커버하기 위해 정기적 종이 타월을 사용하여 액체. 그런 다음, 항아리에 CD1 마우스를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 약 1 분 ~ 2 분 동안 닫힌 항아리에 동물을 유지합니다. 숨 주파수가 약 1 초 당을 때, 항아리에서 마우스를 제거합니다.
2. 수술 단계에 마우스를 올려 놓고 적절한 가위로 목을 베다. 즉시 참수 한 후, 약 30 초 동안 얼음처럼 차가운 (3-4 ° C에서)로 머리, 산소 자당 ACSF을 배치합니다.
3. 두개골의 상단에있는 피부를 제거하고 템포에 가까운 두 끝에서뿐만 아니라 머리의 중간 선을 따라 두개골을 잘라 미세 가위 (특정 재료 및 장비에 5 호)를 사용하여RAL 로브. 사용 포셉 (특정 재료 및 장비에 번호 6) 뇌를 노출하기 위해 머리의 양쪽으로 절단 된 두개골을 벗겨합니다.
4. 조심스럽게 두개골의 바닥에서 머리를 떼어 다음에 그것을 드롭 뇌와 두개골의 두정엽 사이의 간격에 마이크로 랩 주걱 (특정 재료 및 장비에 8 번)를 삽입 준비된 얼음처럼 차가운 (3 특정 재료 및 장비)에 젖은 종이 필터 (2 번으로 덮여 -4 ° C) 수술 단계. 얼음 냉각 블레이드와 소뇌를 제거하고 뇌의 중간 선을 절단하여 두 개의 반구를 분리합니다. 그런 다음, 95 %, _O2 / 5 % CO _2와 버블 얼음처럼 차가운 자당 ACSF 가득 비커에 분리 된 2 개의 반구를 배치합니다.
5. 얼음처럼 차가운 필터 종이 무대에 반구과 장소의 절반을 가져 가라. 추가 솔루션을 빨아 뇌 주위가 일반 종이 타월이나 종이 필터를 놓습니다. 재료에 두 화재 연마 유리 피펫 도구 (제 10 호를 사용하여장비) 뇌의 중앙 부분의 나머지 부분에서 피질을 분리한다.
6. 해마는 대뇌 피질의 내부에서 노출과 얼음처럼 차가운 무대에 배치 된 후, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 위치하게 한 후, 해마 주변에 여분의 용액을 제거. 해마의 두 끝에서 대뇌 피질로 연결을 잘라. 그런 다음, 불을 연마 유리 도구를 사용하여 뇌에서 해마를 해부 뇌의 나머지 부분을 제거합니다.
7. 그 alveus면이 위를 향하게하고 해마 고랑이 아래로 향하도록하여 전체 해마를 분리합니다. 신속하게 다시 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 떨어 뜨리고 종이 타월의 조각을 사용하여 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 고랑 (그림 1B, C)를 노출 전체 해마를 넘겨 화재 연마 유리 도구를 사용합니다.
8. 일반 광학 현미경, 특정 Materi에서 사용자 지정으로 만든 유리 바늘 (11 호를 삽입루게릭 병 및 고랑의 한쪽 끝으로 장비)과 고랑의 방향 (그림 1C)을 따라, 치아 subiculum 할 이랑 (DG) 또는 CA1 필드에서 광섬유 연결을 잘라. 필요한 경우 해마의 중격 및 시간 끝 트림 얼음처럼 차가운 칼날을 적용합니다. 절단 고랑에 (특정 재료 및 장비에 번호 12) 사용자 정의 만든 금속 와이어 루프를 삽입하고 화재 광택 유리 도구에 의해 해마의 subiculum / CA1 끝을 잡고 조직에서 떨어져 DG 세워 (그림 1D) .
9. 위의 전개 과정에 따라, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 또 다른 두 세 방울을 추가하고 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 그리고, 에지 (도 1E)에 빙냉 블레이드 펼친 해마 트림 및 약 (RT에서 정상 ACSF 채운 95 %, _O2 / 5 % CO _2로 버블 회수 챔버로 주걱 의해 제제를 배치 25 ° C). 휴가펼친 해마 조직은 기록 챔버로 배치하기 전에 약 1 시간을 복구한다.
10. 다른 뇌 반구를 타고 2.5-2.9 단계를 진행하는 데 사용. 일반적으로, 하나의 해마를 전개하고 산소와 수화 조직을 유지하기 위해 지속적으로 얼음처럼 차가운 자당 ACSF을 드롭 모든 절차를 완료하는 데 약 1 ~ 2 분을.

3. 실험 시스템 설치

1. 핀 그리드 어레이 (PGA) 패키지에 맞춤 제작 PMEA 접착제 및 패키지 (도 3B)에 대한 핀의 패드로 단일 미세 전극으로부터 각 패드를 연결하는 마이크로 와이어 본딩을 사용한다. 그런 다음, 사용자 정의 - 만든 회로 기판 ^(13)의 소켓에 패키지를 삽입합니다.
2. 개별적으로 맞춤 제작 한 회로 기판 ^(13)에 100의 이득과 4 kHz와 앰프에 1 Hz에서에서 대역 통과 차단 주파수와의 필터에 각각의 미세 전극을 연결합니다. A / D 전환 수에 의해 회로 보드로부터의 아날로그 출력을 디지털화erting 시스템을 포함하고, 컴퓨터에 데이터를 수집 및 저장한다.
3. 용액의 흐름 (도 4A)에 대한 입구 및 출구 튜브 어레이와 주변 주문품 플라스틱 기록 챔버를 붙인다. 시스템에서 다른 솔루션을 유지하고, 결합하고 트라이 밸브에 의해 병의 출력 튜브를 제어하기 위해 적어도 두 병을 사용. 기록 챔버로 안내되는 용액 IV 드립 챔버와 배관 시스템 트라이 밸브의 출력을 연결한다.
4. 트라이 - 밸브 및 기록 챔버의 입구 사이에, 용액 기록 챔버로 안내되기 전에 제어 된 온도 (35 ° C)의 해결책을 가열하는 전기 히터를 추가한다. 진공관 접속 플라스크에 용액을 수집 진공관에 기록 챔버의 출구를 연결. 이 연구에서 어떤 실험에서 모든 솔루션을 재활용하지 마십시오.

4. PMEA에 펼친 해마를 배치하면 신경 활동을 기록합니다

1. 실험 장치를 준비하려면, 하나의 정상 ACSF 병, 4-AP ACSF 또 다른 병을 채 웁니다. 두 병, 거품, 95 % O, 각 실험의 처음 ₂ / 5 % CO _2. 실험 기간 동안 선택 될 솔루션을 제어하는​​ 트라이 밸브 커넥터를 사용합니다. 먼지통으로 용액을 펌핑 챔버의 출구에 진공 튜브를 연결한다. 상기 기록 챔버로 전달하기 전에 파이프 라인을 가열하고 조절 된 온도 레벨 (35 ° C)에서 용액을 유지한다.
2. 기록 챔버의 입구 및 출구가 폐쇄되는 경우, 상기 기록 챔버로 펼친 해마 옮기고 배치 주문품 유리 피펫 드롭퍼를 사용한다. 현미경, 조직이 솔루션에 떠있는 동안 정기적 작은 페인트 붓을 사용하여 전개 된 해마를 놓습니다. 그 alveus 측이 멀리 가리키는, CA3 영역을 아래로 향하게하고, CA1 필드가 연구자를 가리키는 펼친 해마를 놓습니다.
3. 조심스럽게 건조 챔버 및 조직이 배열 될 때까지 하강하여 액면을 낮출 기록 챔버의 에지로부터 진공 피펫을 이용하여 챔버 내의 용액을 얻어 빨아. 그런 다음, 조심스럽게 배열에 펼쳐진 해마를 개최 조직의 상단에 사용자 정의 만든 조직 앵커 (그림 4) (특정 재료 및 장비의 제 14 호)를 배치합니다. IV 드립 챔버에서 초당 약 2 방울로 유량을 조정하는 입구 및 출구를 리필하고 서서히 열고 기록 챔버 내로 용액 몇 방울을 넣어.
4. 복구하기 위해 약 1 분 동안 정상으로 기록 ACSF 챔버 내의 조직을 인큐베이션 한 후 4-AP ACSF에 용해 액 공급 전환 적절히 유량을 조정한다. 약 5 내지 10 분 동안 용해 된 ACSF 4-AP의 조직을 인큐베이션 한 후 연구원 운동량이 나타나면 신호를 기록하는 소프트웨어를 시작할 수있다.

5. 제거실험 후 PMEA에서 조직

1. 미세 조작기에 의해 조직을 제어하고 앵커 서서히 기록 챔버로부터 조직을 들어 올려. 녹화 실의 흐름을 중지 입구와 출구를 모두 종료합니다. 기록 액 챔버는 가득이거나 기록 챔버는 가득 차지 않은 경우에 챔버를 채우기 위해 용액의 몇 방울을 추가한다.
2. 조직의 각 모서리를 들어 올리려면 작은 페인트 브러시를 사용합니다. 조직이 용액에 떠 있지 않으면, 조직은 여전히​​ 어레이에 앉아 신중 챔버 건조 진공관을 채용한다. 그런 다음 조심스럽게 점진적으로 챔버를 채우고 기록 챔버가 가득 차면 흐름을 중지 입구를 종료 입구를 엽니 다. 다시 조직의 각 모서리를 들어 올려 작은 페인트 브러시를 적용합니다.
3. 조직까지 단계를 반복 5.2 배열에서 분리하고, 용액에 떠있다. 조직이 용액에 떠있는 경우, 거리 티슈 빨아 진공 튜브를 사용한다. 열기 t그는 입구에 흘러 출구에서 진공을 엽니 다. 증류수로 시스템을 세척하고 건조.

여기서 도면에 도시 된 데이터는 4-AP (100 μM) RT에서 기록 챔버 내의 조직 배양 동안 첨가 ACSF (25 ° C)로 펼친 해마 제제에 기록 하였다. 일반적으로 활동은 5 분 이내에 시작되지만 나이가 동물에서 일부 해마 조직에서 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다. 이전에보고 된 ^14,15 PMEA 관찰 4-AP 유도 된 신경 소성 동일하다. 전극이 200 ㎛의 높이를 가지기 때문에, 전극 팁은 단지 밖으로 전지 층 (도 3c) 전지 층은 보통 250 해마 alveus 상술 내지 300㎛이기 때문에 (도 2), 녹화 (57 아래에 위치되고 다른 채널에서 샘플 실험)에서 64 주로 긍정적 인 편향이있다. 그러나, 이러한 양의 녹화뿐만 아니라 일부 (도 5b), 기록 전극의 끝은 셀 층에 충분히 가까이있는 경우에는 작은 음의 굴절을 표시 할 수있다.전극의 끝이 세포 층의 수준에서 오른쪽에 있으면 기록은 긍정적 인 변화하거나 부정적인 스파이크 (그림 5C) ^(16)와 매우 날카로운 부정적인 스파이크를해야합니다. 여기에 표시된 데이터 샘플에서 57 녹음 중 5 채널은 부정적인 스파이크가 있습니다. 모든 채널 (64)로부터 데이터를 획득 한 후, 개개의 정규화 방법 (도 6B)는 기록 ^(7)의 시간축에서 2-D 평면에서 신경 전달을 매핑하도록 적용된다. PMEA 및 펼친 해마의 조합으로, 신경 전달 맵핑하고 (도 6) 해마의 전체 영역을 넘어, CA3의 일측에 주로 개시하고 파면 대각선 길이 방향으로 이동하는 것으로 관찰된다.

펼쳐진 해마 그림 1. 수술 . (A) 두 해마 중 하나가 마우스 뇌 측두엽 해부된다. (B) 해마가 고랑을 노출 화재 광택 유리 피펫으로 뒤집히고 중격 및 종축을 따라 시간적 터미네이션. (C). 해마의 양단을 트림하고 유리 바늘 DG 및 종축을 따라 CA1 또는 subiculum 사이의 연결을 차단하기 위해 사용된다. (D) 해마가 주문품 금속 와이어 루프에 의해 전개된다. (E)와 펼친 해마 subiculum 및 DG 트리밍. (F) 펼쳐진 해마의 최종 조직 준비. 이 실험에서 어레이에 배치 될 때이 위치 해마의 방향을 나타낸다. 펼쳐진 해마 해부학에 대한 자세한 내용은 이전에 발행 된 원고 ^(7)의 실험 방법을 참조하십시오.g1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

펼친 해마의도 2. 조직학 횡단면. 크리스탈 바이올렛 염색하여 오른쪽 세포층 아래 미소 전극을 위치 alveus 상기 250 내지 300 ㎛의 레벨 펼친 해마 내 CA1-CA3 피라미드 전지 층의 위치를 나타낸다 (그림 3C 참조). 해마가 펼쳐진 후 크리스탈 바이올렛으로 염색 섹션을 얻으려면 조직 포스트 고정했다. 펼친 해마는 4 % PFA의 O / N의에 넣었다. 그런 다음, 조직은 드라이 아이스의 C ° -35까지 냉각하는 자전거 타는 포함 이소 펜탄 (2- 메틸 부탄)에 스냅인을 동결 이전 48 시간 동안 자당 용액 (30 %)에 보관하고, 이어졌습니다. 동결 절편 후 크리오에서 잘라 냈다피라미드 세포 층의 위치를 공개하는 (그림 2 참조) 횡단면에 20 μm의 두께 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 PMEA 3. 펼친 해. (A) 각 금 금속 트레이스의 끝에있는 미소 전극을 가진 새로운 PMEA의 상위 뷰입니다. 오른쪽에 삽입 200 ㎛, 높이 20 ㎛의 ^7,13 직경 전자 현미경 하에서 단일 미세 전극을 나타내고있다. (B) 미세 전극 어레이상의 미소 전극 주위 플라스틱 기록 챔버와 PGA 패키지에 접착된다 유리 기판. 오른쪽에 삽입 미세 전극의 도착에 배치 펼쳐진 해마를 보여줍니다AY 왼쪽 중간. (C)에서, 광학 결맞음 단층 촬영 영상은 다른 실험에서 어레이의 상부에 위치 펼친 조직을 도시한다. 오른쪽에서 왼쪽에있는 OCT의 영상에서 얻은 두 종 슬라이스 이미지는 바로 세포체 층 아래의 영역에 도달 (흰색 도트가 화살표가 가리키는) 미세 전극 팁을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

4. 실험 설정 그림. (A) 나사와 플라스틱 커버 뚜껑은 가능한 물 손상으로부터 보호 할 수있는 회로를 통해 배치됩니다. 기록 챔버는 용액 흐름을 수행하는 입구 및 출구 관을 모두 갖는다. 나일론 섬유 메쉬 접착 사용자 정의 만든 조직 앵커, 담배 마는를 고정하는 데 사용됩니다실험 동안 UE. (B) 픽쳐가 실험 기간 동안 샘플 조각을 들고 조직 앵커를 도시 PMEA의 유리 기판의 아래쪽에서 찍은. 만곡 와이어는 조직의 상부에 가압로부터 메시 나일론 섬유이다. 라운드 점은 미세 전극의 기지입니다. 화살표는 여러 실험 후 손상되었다 전극을 가리 킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

펼쳐진 해마에서 PMEA에 의해 기록 된 그림 5. 원시 데이터. 패널을 왼쪽 : 하나의 미세 전극에서 기록 간질 활동을 4-AP-유도 오른쪽 패널 :. 왼쪽에있는 시간 창에 표시된 신호의 확대 버전을. (A) 운동량의 예에서의 10 초 구간100 μM 4-AP ACSF 의해 선보였 34.9 dB의 SNR을 가진 신호의 극성에 기초하여 기저 수지상 영역에 위치 미소 전극 중 하나에 대해 획득. (B) 원 데이터를 SNR과 세포체쪽에 위치하고, 다른 미세 전극으로부터 체세포 층 내에 위치하는 전극에서 얻은 기록의 27.2 dB. (C) 예 중. 이 예에서, SNR은 여전히 전도하지만 조직 내로 침투하지 절곡 전극으로부터 얻어지는 dB 18.53. (D) 기록이다. 구부러진 전극은 그 본래 전극 (이 예에서는 1.5 dB)에 비해 크게 낮은 SNR있다. 미세 전극에서 기록 (E) 기준 잡음. 기준은 일반적으로 최대 150에서 200 μV에서 가치와 하나의 전극의 임피던스 피크가 약 1 MΩ 2입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2-D 맵 전파로 신경 기록 데이터도 6의 전환. (A) 170 밀리 초 시간 윈도우는 각각의 채널은 단일 신경 스파이크 PMEA의 사진에 그려 잘라내. 원시 데이터는 100 Hz에서 로우 패스 필터에 의해 필터링된다. 깨진 전극으로부터 신호는 주변의 녹음으로 보간됩니다. 이 예제에서는, 스파이크는 긍정적이다. (B) (A)의 적색 화소에서 하나의 신경 스파이크 개별 정상화에 대한 사용자 지정 개발 방법 컬러 바 (자세한 내용은 이전의 출판물을 참조하십시오에 정규화 정규화 ^7). (C)에 대해 개개의 정규화에 의해 작성된 컬러 맵은 상이한 시점에서 펼쳐진 해마의 전체 영역에 걸쳐 그 전파 움직임을 나타낸다.www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

해마의 종 방향 및 횡 방향 축이 관통하는 미세 전극 배열과 조합 보존 펼친 해마 제제의 개발은, 해마 ⁷ 해부학 신경 연결 또는 전파를 조사하는 강력한 도구를 제공한다. 이 전개 절차는 성인 쥐에서 해마를 공부에 적용됩니다. 이러한 준비와 최근의 연구는 4-AP에 의한 간질 활동이 펼쳐진 해마의 전체 영역에 걸쳐 대각선 파면 (그림 6) ^7,8로 전파 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 연구들은 평평한 해마 신경망 신경 전파 (도 6)를 조사 할 때 그대로 펼친 해마 횡 또는 종 중 조각에 비해 상당한 이점을 제공한다는 것을 보여 주었다.

미세 관통 기존 마일 비해 상당한 장점을 제공한다평평한 표면 ^11,12,17 위에 위치 여러 연락처로 구성 croelectrode 배열 (MEA). 셀 층이 약 250-300 μm의 거리 표면 (그림 2)에서 위치하고 있기 때문에 평면 전극 MEA는 펼쳐진 해마와 함께 사용하기 어렵다. 여기에 설명 PMEA는 ^7,13 깊숙한 조직에 도달하는 200 ㎛의 높이가 신경 전달을 연구하기에 적합한 관통 전극 (64)으로이 문제를 해결하기 위해 설계되었다. 또한, 이러한 피질 슬라이스와 같은 임의의 평면 티슈 제조에서 PMEA에도 적용, 해마 등 횡단면

이 PMEA를 사용하는 또 다른 이점은 개선 된 SNR이다. 이 PMEA의 시제품​​ 연구 이전 연구가 표시된 이후이 PMEA 의해 기록 신경 신호의 SNR 비율은 VSD 기록에 비해 훨씬 더 높고 안정 19.4 ± 3dB의 평균값을 갖는다 보여준다 독성VSD의 포토 블리치 명확 데이터 ^8을 기록 할 수있는 능력을 손상. 함께 그 평탄화 전극 배열에 비해 더 높은 SNR을 갖는 20dB 정도 내지 30의 범위로, 본 연구에서 (도 5) PMEA 증가로부터 기록의 SNR을 티슈 앵커를 사용하여 개선 된 실험 프로토콜을 가진 10 - 15 dB ^11,18의 값입니다. 해마 펼치는 능력 순서로 기록 평면 어레이 심문 수 뉴런 (CA1-CA3)의 층을 얻기 필수적이다.

실리콘 어레이는 투명 기판 상에 내장하기 때문에, 전압 감응 염료 영상 법은 ⁸ 해마 신경 활동의 전파를 연구 PMEA 시스템에 통합 될 수있다. 형광 표시기가있는 전압 감응 트랜스 제닉 마우스는 또한 pharmacologi 의해 유도 기원과 생리 학적 조건 하에서 전파 신호뿐만 아니라 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다칼 에이전트 또는 다양한 동물 모델 ^(9)에서 유전자 변형 조직.

고품질의 녹음을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째 조직 생존을 보장하기 위해, 수술은 가능한 빨리 수행되어야한다. 일반적으로, 그것은 2.10에 2.1의 모든 단계))를 통해 이동하는 데 약 1 ~ 2 분 걸립니다. 실제 실험 수술을 실시하기 전에 몇 가지 샘플 동물의 전개 과정의 연습은 매우 좋습니다. 둘째, 유동 속도 요구는 기록 챔버 내의 관류 액의 레벨 중 변동을 방지하기 위해 일정하게 유지되어야한다. 더욱이, 조직을 배열 조직의 이동을 방지하기 위해 아래로 고정되어야한다.

여기에 설명 PMEA가 펼친 해마 신경 전달을 모니터링하는데 유용 신호를 제공 할 수 있지만, 기록이 방법에는 몇 가지 단점과 한계가있다.

첫째로, 미소 전극 (그림 5D, E) 그들에 배치 된 기계적인 힘으로 인해 손상 될 수 있습니다. 조직의 배치 및 제거의 과정 동안, 작은 페인트 브러시 및 배열 사이의 접촉 사고는 미소 전극이 휘거나 고장 날 수 있습니다. 티슈 앵커 미세 조작기에 의해 하강 될 때, 상기 챔버의 바닥을 따라 조직의 수평 이동은 굽힘 또는 전극의 파손으로 이어질 수있는 전단력을 만들 수있다. 미래 설계에서, 마이크로 전극 그들을 강하게 만들 수있는 약간 두꺼운베이스로 재편되어야한다. 이 PMEA의 현재 버전에서, 상기 기록 전극은 폭이 좁은베이스함으로써 전극 (도 3A)을 약화 직경 ^(13)에 비해서.

세정 절차는 적절하게 배열 달아서 잔여 조직 및 섬유를 제거하도록 개선되어야한다. 각 실험 후, 작은 조각조직의 미세 전극에 부착 된 상태를 유지하고 있었다 전극에 남아있는 잔여 조직이 제거되어야한다. 이러한 잔여 조직이 제거되지 않으면, 전극의 임피던스와 레코딩의 SNR이 영향을받을 가능성이있다. 프로토콜 부분의 일부 5에 표시된대로 증류수로 시스템의 플러싱은 좋습니다. 또한, 사용자는 시스템을 손상시키지 않고 조직을 용해 할 수있는 일부 약산 용액으로 세척 시스템을하는 것이 좋다

이 프로토콜의 또 다른 단점은 전개 과정 동안,이 펼쳐진 해마 있으며, perforant 경로 DG에서 해마의 다른 층에 전파 가능한 신경 신호의 조사를 방지, 절단 점이다.

결론적으로 펼친 해마 tissu와 높은 종횡비 미세 전극 배열을 조합하여 해마 내의 신경 활동의 전파를 조사하는 여기 신규 방법론을 설명했다전자. 방법은 두 종 방향 및 횡 방향으로 전파 할 수있는 방법을 신경 활성의 이해로 이어질 않았다. 이 기술은 어레이의 상부에 유사한 방식으로 배치 피질 조직에 적용될 수있다. 어레이는 투명하고, 또한 신경 조직에 신호 전달에 대한 중요한 결과로 이어질 수 있기 때문에 또한,이 제제와 광 기록 기술을 결합하는 것이 가능하다.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.