브라질에서 필드 릴리스에 대 한 유전자 변형 Aedes aegypti의 대량 생산

RIDL ®(지배적인 치명적인 곤충을 운반하는 곤충의 방출) 시스템을 사용하여 Aedes aegypti의 인구 억제를 달성하기 위해 많은 수컷 모기를 풀어야 합니다. 이를 위해서는 대량 사육 기술과 기술을 사용하여 고품질의 남성 모기의 최대 수를 얻기 위해 신뢰할 수 있는 시스템을 제공해야 합니다.

모기와의 전쟁에서 승리하기 위해 새로운 기술과 방법이 모색되고 있습니다. 분자 기술의 최근 발전은 멸균 곤충 기술 (SIT)^1-3을기반으로 모기 제어의 새롭고 혁신적인 방법의 개발을 주도하고있다. RIDL(지배적인 치명적인 것을 운반하는 곤충의 방출)^4로알려진 대조군 방법은 SIT를 중심으로 하지만, 유전적 방법을 사용하여 방사선 멸균^5-8의필요성을 제거한다. Ae. aegypti의 RIDL 균주는 그랜드 케이맨^9,10의필드에서 성공적으로 테스트되었습니다. 추가 현장 사용은 계획또는 전 세계 다른 국가에서 진행중입니다.

곤충의 대량 사육은 여러 곤충 종과 일주일에 수십억 의 수준에 설립되었습니다. 그러나, 모기에서, 양육은 일반적으로 1970 년대와 80 년대에 수행되는 대부분의 대규모 양육과 함께, 훨씬 작은 규모로 수행되었습니다. RIDL 프로그램의 경우 질병을 물고 전염시킬 때 가능한 한 적은 여성을 방출하는 것이 바람직합니다. 대량 양육 프로그램에서 출시 될 수 있는 남성을 생산 하는 몇 가지 단계가 있다: 계란 생산, 새끼까지 계란을 양육, 다음 출시 하기 전에 여성에서 남성을 정렬. 이 남성은 다음 RIDL 제어 프로그램에 사용됩니다, 푸파 또는 성인으로 출시^11,12.

RIDL을 사용하여 모기 인구를 억제하기 위해 많은 수의 고품질 남성 성인을 양육해야^13,14. 다음은 Ox513A의 대량 사육 방법을 설명하며, Ae. aegypti ^8의RIDL 균주인 OX513A를 방출하고 제어 프로그램에대한 계란 및 대량 사육 RIDL 수컷의 생산에 필요한 기술을 다룹니다.

모기는 인간에 있는 질병의 범위를 일으키는 원인이 될 수 있는 많은 병원체를 전송하고 이 모기를 통제하는 것은 수세기 동안 지속적인 전투되었습니다. 화학 적 및 생물학적 방법에 기초한 곤충을 제어하는 전략은 몇 가지 주목할만한 성공을 거두었지만 많은 경우 제어가 장기적으로 지속 가능하지 않았습니다. 예를 들어, 브라질은 50년대에 Ae. aegypti의 박멸을 달성했지만 모기는 지난 40-50 년 동안 재발했습니다. 이는 살충제 저항, 환경 손상, 열악한 제어 프로그램 구현^15-20,적절한 모니터링 또는 대응 없이 신속한 재침공 등 많은 원인에 기인할 수 있다.

모기와의 전쟁에서 승리하기 위해 새로운 기술과 방법이 모색되고 있습니다.  분자 기술의 최근 발전은 멸균 곤충 기술 (SIT)^1-3을기반으로 모기 제어의 새롭고 혁신적인 방법의 개발을 주도하고있다. RIDL(지배적인 치명적인 곤충을 운반하는 곤충의^방출)4로 알려진 대조방법은 SIT를 중심으로 하지만, 유전적 방법을 사용하여 방사선 멸균의 필요성을 제거한다. RIDL 균주는 Ae. aegypti ^5-8을포함하여 몇몇 해충 종을 위해 건설되었습니다, Ae. aegypti의 RIDL 균주는 그랜드 케이맨^9,10의필드에서 성공적으로 시험되었습니다; 추가 현장 사용은 계획또는 전 세계 다른 국가에서 진행중입니다.  RIDL을 사용하여 모기 인구를 억제하는 것은^3,14를양육하는 고품질의 남성 성인의 다수가 필요합니다.

SIT 프로그램의 경우 남성만 방출하는 것이 바람직한 것으로 간주됩니다. 암컷 모기는 질병을 물고 전염시다. 또한, 방출된 멸균 수컷은 방출된 여성에 의해 프로그램 효과를 감소시킴으로써 '산만'할 수 있다. 남성 전용 방출은 조사 된 지중해 과일 파리^(21)와큰 필드 실험에서 혼합 성 방출보다 3-5 배 더 효과적인 것으로 나타났다.

RIDL 대량 양육 프로그램에서는 출시를 위해 남성을 생산하는 몇 가지 단계가 있습니다.  첫 번째는 방출 생성에 필요한 계란을 생산하는것이다(도 1). 다음 단계는 새끼 또는 성인에 계란을 양육하는 것입니다, 강아지와 여성 강아지에서 남성 강아지에서 애벌레를 분리. 여성으로부터 남성의 대규모 분리는 질량^{분류(22)에}적합한 특정 생활 단계에서 남녀 간의 차이를 요구한다. Ae. aegypti (및 기타 모기 종)에는 성 분리 기술에 악용 될 수있는 남성과 여성 pupae 사이에 상당한 크기 차이가 있습니다. 정렬 된 RIDL 남성은 pupae 또는 성인^11,12로제어 프로그램에서 출시됩니다.

다음은 Ae의 RIDL 균주인 OX513A의 대량 사육 방법을 설명합니다. 아이집트, 출시. 설명된 방법은 제어 프로그램을 위해 계란과 RIDL 수컷의 생산에 필요한 기술을 다룹니다.

곤충 요구 사항

1. 개요

1. 질량 사육에는 여러 단계가 있으며, 각각은 질량 양육 장치의 뚜렷한 영역에서 수행됩니다. 도 1은 사육의 주요 단계와 대량 사육 시설에서 발생하는 위치를 나타낸다.

2. 곤충에 대한 생물 학적 고려 사항

1. 이 프로젝트는 상파울루 대학의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 브라질은 필요한 모든 허가와 승인을 받았습니다.
2. RIDL 시스템은 조건부 치사성을 사용합니다. 식이 보조제(tetracycline)는 곤충을 대량 사육할 수 있도록 하는 RIDL 시스템의 발현을 방지합니다. 테트라사이클린없이 모기는 죽는다. 테트라사이클린은 야생의 Ae. aegypti의 번식지에서 발견되지 않으므로 탈출자들로부터 생산된 자손은 살아남지 못할 것입니다.  이것은 다른 방법 (즉, 방사선)에 의해 살균 된 야생 유형 (WT) 곤충을 사용하는 데 비해 추가 수준의 보안을추가합니다.
3. 곤충에 이중 문 입구, "공인 인력 만"표지판과 곤충 화면을 사용합니다. 모든 창문은 WT 곤충으로 식민지의 오염을 방지하고 곤충 내부에서 탈출을 방지하기 위해 밀봉해야합니다.
4. 현지 규정 및 당국에는 구체적인 추가 또는 대체 요구 사항이 있을 수 있습니다. 초기 단계에서 정보/안내를 위해 관계 당국에 연락하여 곤충에 RIDL 균주를 확립하기 전에 필요한 모든 허가 및 승인을 확보하십시오.
5. 대량 사육 곤충은 RIDL 사육에만 사용되어야합니다. 다른 균주나 곤충은 존재하지 않아야 합니다. 이것은 RIDL 긴장의 오염 및 적정성과 생존에 영향을 미칠 수 있는 병원체에 오염을 피하기 위한 것입니다, 방출된 수컷의 생산성 그리고 효력을 감소시킵니다.

3. 곤충 디자인

1. 그림 2는 브라질에 있는 비오파브리카 모스낙드에서 사용되는 곤충의 계획을 보여줍니다.
2. 모든 객실의 온도는 26°C ± 2)였으며 상대 습도는 약 70~80% 및 12:12시간 광:어두운 사이클을 사용하여 형광광 스트립을 사용하였다.
3. 이 청사진은 특정 공간 요구 사항에 따라 수정할 수 있습니다.예: 릴리스의 규모는 전체 크기를 결정합니다. 그러나 계란 생산, 사육 및 정렬, 품질 관리 (QC) 및 릴리스는 네 가지 영역으로 분리되어야한다: 계란 생산 식민지, 릴리스 생성, QC, 릴리스성인 스토리지.
4. 계란 생산 콜로니 룸 (약 20 m^2)은방출 생성을위한 계란을 생산하는 데 사용됩니다.
5. 품질 관리 영역은 해치 속도, 강아지 숫자, 푸파 크기 측정, 선별 및 제거 여성의 효과 측정을 포함하여 RIDL 라인의 절차와 적합성을 확인하기 위한 실험을 수행하는 곳입니다. 또한 치사를 측정하는 오프셋 분석을 사용하여 형광 마커 및 표현형의 존재를 확인하여 WT 오염에 대한 테스트가 수행됩니다.
6. 릴리스 생성 실(약 36m^2)에는트레이와 애벌레와 푸파의 분류를 위한 적절한 공간이 필요합니다. 트레이는 특수 제작된 알루미늄 랙에 보관되어 있습니다. 사육 및 선별을 위해서는 대형 작업 공간과 싱크대가 필요하며 트레이와 케이지를 세척하려면 다른 대형 싱크대가 필요합니다. 필터 캐치 트랩은 하수구를 통해 살아있는 모기의 탈출을 완화하기 위해 싱크대에서 폐수 콘센트에 포함되어 있습니다.
7. 트레이에 사용되는 모든 물은 배출구를 통해 폐기되며, 개발 단계에서 곤충의 탈출을 방지하는 메쉬가 들어 있는 구획이 있습니다.
8. 성인이 출시 전에 성숙하는 동안 릴리스 장치를 보유하기 위해 랙을 포함하는 성인의 저장 영역(릴리스용 성인 보관소, 그림 2)이필요합니다.

대량 사육 RIDL을 위한 생산 방법:

계란 생산 식민지는 성인을 생산하기 위해 릴리스 생성(그림 1)에사용되는 계란을 생산하고 있습니다. 두 양육 방법에는 많은 유사점이 있지만 몇 가지 뚜렷한 차이점도 있습니다. 두 절차에 대해 동일한 양육 프로세스는 계란 생산 콜로니 섹션에만 설명되어 있습니다.

계란 생산 식민지

4화 라발 프로덕션

계란 생산 식민지는 릴리스 생성을 위한 homozygous OX513A RIDL 계란^8을 생성합니다. 고품질 관리는 제공된 계란의 생존가능성, 피트니스 및 변형 무결성을 보장합니다.

1. 부화자극은 낮은 수준의 용존 산소로 물에 잠기는 것입니다. 물의 산소 수준을 줄이기 위해 물을 끓일 때까지 가열하고 즉시 400ml를 500ml 유리 항아리 (74mm 개구부)에 넣고 뚜껑을 단단히 고정하고 실온에서 몇 시간 동안 식힙니다.
2. 달걀 1 g을 끓인 물 항아리에 넣고 다시 밀봉하고 한 시간 동안 기다립니다. 내용물을 2L의 물이 있는 트레이에 옮기고 곤충 조건에서 하룻밤을 둡니다.
3. 부화 유충을 알려진 양의 물에 넣고 알리쿼트를 복용하기에 충분한 시간 동안 자기 교반기와 벼룩을 사용하여 저어줍니다. 격렬하게 또는 연장 된 시간 동안 애벌레를 손상시키고 최소한으로 유지해야합니다. 애벌레를 부화하는 데 사용되는 표준 부피는 1 L이지만 300 개 이상의 애벌레 / ml의 밀도는 계산하기 어렵고 손상 될 수 있습니다. 따라서 약 300,000 개의 계란 / L 이상의 물을 부화하지 마십시오.
4. 3 ml 의 알리쿼트 3 ml를 복용하고 흡수 스폰지 위에 1cm 사각형의 격자와 흡수 용지 시트에 배치하여 해치 속도를 결정하여 여분의 물을 흡수합니다.  부화 계란의 누락 된 모자를 찾아 세 사각형에서 부화와 비 해치 계란의 수를 계산합니다. 해치 비율은 약 80~90%가 예상됩니다.
5. 각각 1 ml의 4 개의 알리쿼트를 가져 와서 4 개의 검은 무게 보트 (유충은 흰색이므로 검은 배경에 대해 더 쉽게 볼 수 있음)에 넣고 눈으로 존재하는 살아있는 유충의 수를 계산합니다. 카운터를 사용하는 것이 좋습니다. ml 당 유충의 평균 수는 트레이 당 애벌레의 원하는 수를 얻기 위해 각 트레이에 추가 하는 물의 양을 계산 하는 데 사용 됩니다.
6. 유충이 균주와 종 사이에서 사육 될 수있는 밀도에 큰 차이가있을 수 있습니다. 또한 RIDL 성인 남성 크기를 야생 형 남성에 비교하는 것이 바람직합니다. 이상적으로 당신은 야생 남성과 성공적으로 경쟁 할 수있는 큰 크기의 RIDL 남성과 유사하고 싶습니다. 따라서 각 RIDL 균주에 대해 유충의 이상적인 밀도를 결정해야 하며 사육 및 생산 규모에 대한 공간 제약에 대한 절충안이다. 0.1-2.5 애벌레 /ml에 이르기까지 밀도우리는 생산 출력과 품질의 좋은 조합으로 나타났습니다; 또한 메디치 에 의해 논의²³.
7. 트레이에 애벌레를 넣습니다. 저희 시설에서는 약 53cm x 37cm x 8cm(L x W x H) 및 생산용 유충의 밀도를 달성하기 위해 필요한 양의 물을 측정하는 트레이를 사용합니다.
8. 1:100 희석시 트레이에 테트라사이클린(3mg/ml)의 스톡 용액을 추가하여 30 μg/ml의 필수 최종 농도를 얻습니다.
9. 매일 미세 한 분말에 분쇄 된 플레이크 생선 음식(www.sera.de)으로애벌레를 먹이. 표 1은 하루에 애벌레 당 음식의 mg에 있는 전형적인 먹이 정권을 보여줍니다. 위에서 설명한 곤충 조건하에서 분류하는 적절한 날까지 유충을 먹이세요.

5. 푸파와 남성/여성 푸파에서 유충 을 분류

1. 부화 후 8일 후에 는 새끼에서 애벌레를 분리하여 파우파에서 유충을 분류한다. 그런 다음 남성용 새끼를 섹스 정렬하십시오. 플레이트^{분리기(24,25)로} 알려진 장치는 수컷 푸파와 암컷 푸파에서 애벌레를 분류할 수 있다. 도 3은 이 플레이트 분리기의 사용을 보여 주며 유충을 남성과 암컷 강아지로부터 분리한다.
2. 하단에 메쉬가 있는 측정 숟가락을 사용하여 500 pupae 이상으로 보정하고 케이지를 설정하고 생성 된 남성과 여성의 총 양을 추정하는 데 사용합니다.
3. 분류 첫날(8일째)에 대부분의 강아지는 남성이므로, 분류된 애벌레를 트레이에 다시 넣고 다음 날까지 후면에 놓는다(도4).
4. 모든 애벌레가 새끼를 당기거나 근로주가 끝날 때까지 2.1-2.3 단계에 설명된 대로 매일 선별 과정을 반복하십시오.
5. 1,000개의 수컷 푸파(측정 숟가락 사용)를 케이지에 넣고 9일째에는 같은 케이지에 3,000개의 암컷 새끼를 넣습니다(메쉬 탑과 그물 접근 구멍으로 조정된 30cm 높이 및 직경 30cm PVC 파이프를 사용하지만, 30cm x 30cm x 30cm 플라스틱 케이지도 BugDorm에서 사용할 수 있습니다).
6. 성인이 적어도 2 일 동안 짝짓기를 하고 자당 용액 (10%)을 제공 하도록 허용하십시오. 젖은 면 광고 리비도에 혈액 먹이 전에. 일주일에 두 개의 혈액 공급으로 2 주 동안 계란을 수집 (~두 gonotrophic 주기) 주. 이것은 3,000명의 암컷 (48개의 계란/암컷의 평균)의 케이지에서 평균 143,000개의 계란을 산출합니다. 일주일에 400만 개의 알을 생산하려면 매주 약 28개의 케이지를 설치해야 합니다.

6. 혈액 먹이주기

1. 알루미늄 플레이트 급지 시스템은 일주일에 두 번 케이지에 혈액을 공급합니다. 파라필름(그림5)이있는 알루미늄 플레이트(10cm x 10cm x 3mm)의 측면에 혈액 포켓이 만들어집니다. 먹이를 장려하기 위해 가열된 콩 백을 플레이트 피더 위에 놓아 혈액을 따뜻하게 합니다. 콩 백은 천 가방에 약 250g의 밀 알갱이로 구성되었으며, 전자레인지에서 약 10초 동안 가열됩니다. 우리가 먹이를 위해 사용하는 혈액은 현지 아바토이르에서 나온 것입니다. 이 동물 (주로 염소와 양)은 병원균의 존재를 피하기 위해 테스트되는 인간의 소비를위한 것입니다.
2. 혈액 먹이 후 3 일, 그들의 계란을 낳는 여성에 대 한 oviposition 사이트 제공 됩니다. oviposition 사이트는 내부를 덮고 물과 필터 종이약 1/4로 채워진 둥근 플라스틱 용기입니다. 이틀 후 oviposition 사이트가 제거됩니다. 계란 생산을 최대로 하려면 필터 용지가 용기 내부의 사용 가능한 전체 표면을 덮고 젖은 상태로 유지되는지 확인합니다.
3. 계란 종이를 제거하고 곤충 조건하에서 건조 흡수 성 종이에 배치; 계란은 높은 습도 (70 % 이상)에서 컨디셔닝의 기간을 필요로 적어도 48 시간 후 누워. 달걀은 습도가^25도높은 상태로 유지되는 한 해치 율이 최소화되어 최대 3개월 동안 곤충에 남을 수 있다.
4. 계란 생산 식민지 릴리스 프로그램에 대 한 주간 에 필요한 계란의 수를 제공 하기 위해 충분 한 크기의 필요가. 위에서 설명한 시설은 매주 28개의 케이지가 설치된 약 4백만 개의 알을 생산할 수 있습니다. 방출 생성 및 계란 생산 식민지에 대 한 계란의 적어도 4 주를 보장 하기 위해 저장 하는 충분 한 계란을 유지 하는 것이 좋습니다.

릴리스 생성

7화 라발 프로덕션

방출 생성을 위한 해칭, 사육 및 정렬 공정은 계란 생산 식민지에 대해 이전에 설명된 방법과 동일합니다. 그러나 생산 규모는 훨씬 더 크며 더 많은 트레이와 더 많은 노력이 필요합니다.

8. 유충, 남성 푸파, 여성 푸파를 분류

1. 애벌레, 남성 강아지 및 암컷 강아지의 정렬은 계란 생산에 대해 설명된 방법과 동일합니다.
2. 남성 강아지를 정렬 한 후 출시 전에 여성 오염을 확인하는 것이 중요합니다. 1% 이상의 여성이 존재해서는 안됩니다. 500 pupae (3 개의 무작위 강아지 측정 숟가락)의 세 개의 알리쿼트 (3 개의 무작위 강아지 측정 숟가락)를 가져 와서 현재 여성 강아지의 수를 계산합니다. 여성은 일반적으로 남성보다 크고 생식기 엽 모양의 차이로 식별 될 수 있습니다(도 6)^27. 1% 이상의 여성이 있는 경우 다시 의지하고 확인해야합니다.
3. 8일째와 9일째부터 남성만 사용하십시오. 남은 애벌레와 푸파를 오토클레이브하십시오. 브라질에서는 이 폐기물을 의료 폐기물과 동일한 방식으로 처리해야 하지만 다른 국가에서는 규제가 다를 수 있습니다. 품질 관리, 사육 및 오염 위험의 차이, 더 낮은 품질 관리로 인해 계란 생산 식민지에 대한 릴리스 생성에서 여성 강아지와 애벌레를 사용하지 마십시오.

릴리스를 위한 성인 저장: 출시 전에 등장하고 성숙하기 위해 남성을 릴리스 장치에 배치합니다. 릴리스 장치의 세부 정보는 이 메서드에서 다루지 않습니다. 그러나 우리가 사용하는 릴리스 장치의 용량은 약 1,000 남성입니다. 릴리스 메서드 세부 정보(릴리스 장치 및 릴리스 시스템)는 이 메서드에서 다루지 않습니다.

생산에 대한 예상 새끼 결과는 그림 4에표시됩니다. 수컷은 먼저 강아지, 8 일째에 피크와 여성은 부화 후 9 일에 피크. 여성에서 남성을 정렬하는 가장 좋은 시간을 알고이 새끼 곡선을 측정하는 것이 중요합니다.

6개월 이상 남성과 여성 강아지를 선별한 결과, 여성 오염이 평균 0.02%임을나타낸다(그림 5; SEM = 0.004%). 이 오염율은 릴리스 의 한 달 동안 발표 된 단지 400 여성을 나타냅니다 (약 2 백만 남성). 현재 주당 계란 생산량은 4백만 개입니다. 이 중 350만 명이 달걀 식민지와 생산을 위해 부화되고 나머지는 백업용으로 저장됩니다. 계란의 약 11%는 계란 생산 식민지에 사용되며 방출 생성을 위해 나머지는 사용됩니다. 달걀 해치 비율은 평균 87.3 %(SEM = 0.5%) L1 애벌레에서 수컷 푸파의 수율은 평균 29.5%(SEM = 1.2)이다. 약 571,000마리의 수컷 푸파(SEM = 14,000)를 생산하는 릴리스 생성 식민지를 위해 매주 2백만 개의 유충이 사육됩니다. 출현 및 방출 기간 동안 Pupae및 성인 사망률은 평균 5%, 주당 약 543,000 (SEM = 13,000)이 방출됩니다. 현재 주당 400만 개의 계란 생산량이 ~300만 달러로 줄어들 것으로 예상되며, 낭비및 저장손실의 손실을 줄이기 위해 추가최적화가 이루어질 것으로 예상됩니다. 설명된 생산에 총 6명의 직원이 필요합니다. 4 릴리스 생성에 작업 하 고 계란 식민지에 나머지 두.

품질 관리

품질 관리는 성인의 품질, 양육의 효율성, 인건비 및 비용을 유지하는 데 필수적입니다.

트랜스진 표현형 제어

RIDL 유전자 발현을 확인하기 위해 두 가지 대조군이 수행되고, 먼저 형광 마커의 발현을 확인하고 둘째로 테트라사이클린이 없는 경우 RIDL 치사성 특성의 발현을 확인한다. 모든 애벌레는 형광 마커를 표현해야합니다. 형광 마커가 예상대로 표현되고 있는지 확인하기 위해, 2,000 최초의 인스타 애벌레는 DsRed2 필터 (텍사스 레드)와 라이카 MZFLIII 스테레오 현미경으로 검사되어 불형인 개인이 존재하는지 확인합니다. tetracycline 없이 RIDL 유전자는 발현되고 우리는^{성인8에게}3-4% 생존을 기대합니다. 이를 확인하려면 테트라사이클린 없이 각 릴리스 배치에 대해 추가 트레이가 설정됩니다. 정상적인 양육에 대한 유일한 차이점은 죽은 유충으로 인한 과잉 식품의 축적이 과도한 세균 성장을 초래할 수 있기 때문에 6 일째부터 음식이 2/3 감소한다는 것입니다.

후방 제어

릴리스 생성에서 4개의 트레이를 무작위로 선택하여 별도로 정렬하고 계산합니다. 남성과 여성 강아지의 수는 매일 각 트레이에서 기록됩니다(그림 4). 남성과 여성의 예상 된 수에서 어떤 편차는 생산 및/또는 피트 니스에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 문제를 나타냅니다 및 문제의 원인을 결정 하는 데 도움이 계란 식민지에 비교될 수 있습니다.

푸파 측정

푸파 사이즈는 성인 사이즈^28과상관관계가 있는 것으로 나타났다. 성인 크기에 대한 품질 관리로서 세팔로포락스 폭은 릴리스 생성으로부터 각 선별 일에 대해 적어도 30개의 수컷 푸파로 측정됩니다. 계란 생산 식민지 암컷 푸파에 대한 또한 측정된다. 평균 세팔로토락스 폭은 방출된 수컷의 경우 1.05mm(SEM 0.005)이고 1.04mm(SEM = 0.006) 및 1.29mm(SEM = 0.006) 각각 남성과 여성의 계란 생산, 콜로니; Ae. albopictus 질량 사육^24에대해 유사한 결과를 얻었다.

그림 1. RIDL/SIT 프로그램에서 사용하기 위해 모기를 대량 사육하는 단계. 계란 생산 식민지는 방출 생성에 공급 된 계란의 품질을 보장하기 위해 품질 관리의 높은 수준을 가지고있다.  계란은 수컷이 암컷에게서 분류되는 방출 식민지에 있는 pupae를 통해 사육됩니다.  남성 성인은 RIDL 제어 프로그램에 사용됩니다.

그림 2. 릴리스 프로그램에 대한 RIDL 남성의 생산을위한 양육 시설의 회로도. 고품질 계란은 계란 생산 식민지 방에서 지속적으로 생산되고 릴리스 생성 룸에서 푸파에 사육됩니다. 애벌레와 강아지는 다음 분리하 고 새끼 는 남성에 대 한 섹스 정렬. 수컷은 다음 릴리스 장치에 배치하고 성인 저장 및 릴리스 룸에서 출시 성인에게 성숙 할 수 있습니다. 

그림 3. 접시^{분리기(26)를}사용하여 애벌레, 수컷 푸파 및 암컷 푸파를 분리한다.  플레이트 분리기는 유충, 남성 강아지 및 여성 강아지의 크기 차이를 사용하여 이 세 가지 다른 삶의 단계를 정렬합니다. 애벌레는 차례로 여성 강아지보다 작은 남성 pupae보다 작은 경향이있다.  계측기는 두 개의 유리 판을 포함한다. 하나는 비스듬한 금속 프레임에 고정되고 다른 하나는 첫 번째 플레이트 의 상단에 앉아 있으며 4 개의 조정 나사(A)를사용하여 첫 번째 플레이트를 기준으로 이동할 수 있습니다.  4개의 조정 나사를 사용하면 외부 플레이트를 백 플레이트에 비스듬히 설정하여 플레이트 사이에 쐐기 모양의 공간이 형성되어 아래쪽으로 가늘어질 수 있습니다.  애벌레와 푸파는 유리 판(B)사이에 부어 물 호스(C)를사용하여 부드럽게 세척된다.  플레이트의 각도를 조절함으로써 애벌레, 수컷 푸파 및 암컷 푸파를 분리할 수있다(D).  연속 홍조와 플레이트 각도를 증가하면 애벌레가 먼저 (체로) 플러시 될 수 있으며 수컷 강아지와 마지막으로 여성 강아지가 뒤따릅니다. 

그림 4. 대량 사육 RIDL Ae. aegypti에대한 새끼 곡선 .  이 그래프는 주당 회복된 ~135,000 pupae와 함께 23주 동안 대량 사육 된 RIDL 남성과 여성 강아지의 평균 백분율 강아지를 보여줍니다.  오류 막대 = 평균의 표준 오류, n = 23. 첫 번째 컬렉션(8일차)에서는 5일 동안 트레이에서 회수한 총 새끼에서 평균 59%, 암컷 새끼를 30% 회수했습니다. 

그림 5. 선별 된 남성 강아지의 평균 여성 오염. 이 그래프는 6개월 동안 부화한 후 8일째 남성 분류 중 월평균 여성 오염률을 보여줍니다. 

그림 6. 알루미늄 플레이트 혈액 피더 시스템. 플레이트(B)는파라필름(A)으로 덮여 있고, 혈액은 주머니에 들어간 다음 밀봉(D)한다. 플레이트는 케이지에 놓고 따뜻한 콩백(C)을위에 올려 놓아 가열합니다(E). 

그림 7. 구별 남성과 여성 Ae. aegypti pupae. Ae. aegypti pupae는 생식기 엽 모양의 차이에 의해 안정적으로 성별 될 수 있습니다 (패들 바로 아래 pupal 복부 세그먼트의 끝에). 또한, 남성은 또한 여성 보다 작은 경향이 있다.   

표 1.  Ae. aegypti RIDL 애벌레 (하루에 애벌레 당 음식의 mg)에 대한 일반 먹이 정권. 트레이당 총 유충 수를 곱하여 필요한 실제 음식의 양을 계산합니다.

RIDL은 모기^3,29-31을제어하는 효과적이고 환경적으로 안전한 방법입니다. 이 기술은 통합 해충 관리 프로그램에 적용되며, 종아리, 번식 부위 감소 및 성인을 포함한 대부분의 현재 제어 방법은이 기술과 호환됩니다. 이 방법은 Ae의 제어에 사용하기 위해 주당 최대 570,000 RIDL 남성 푸파를 생산하는 방법을 설명합니다. Aegypti와 우리의 지식에 이것은이 규모에 형질 전환 모기의 생산의 첫 번째 설명입니다. 1960년대와 70년대^25년에야생형 Ae. aegypti를 위해 일부 유사한 생산 시스템이 개발되었지만, 그 이후로 이 규모에는 비교할 만한 생산이 없었습니다. 브라질에서는 2011년 2월부터 2012년 2월까지 약 1,100만 명의 남성이 석방되었습니다. 주어진 지역에 필요한 남성의 수는 야생 인구의 크기, 방출 된 남성의 분산, 출시 후 남성의 생존 및 짝짓기 경쟁력, 환경 조건을 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다.  이전 연구는 RIDL적어도 80%^9에의해 모기의 인구를 줄일 수 있습니다 나타났습니다.

생산 규모와 수컷의 품질에 대한 대량 양육 을 최적화하는 것 사이에서 균형이 필요합니다. 예를 들어, 애벌레 밀도를 증가하면 필요한 공간, 노동 및 복근 시간을 감소시킴으로써 생산 능력을 증가시킬 수^있다(32) 그러나, 유충의 너무 높은 밀도는 짝짓기 용량이 감소된 더 작고 더 짧은 수컷을 초래할 수 있습니다^32,33. SIT 프로그램과 관련하여 남성의 질은 궁극적으로 방출 된 남성이 현장에서 여성과 짝짓기 할 수있는 능력에 의해 평가될 것입니다. 야생 대응^9,10에비해 짝짓기 경쟁력을 평가하기 위해서는 광범위한 현장 평가가 필요합니다. 이것은 수시로 '고품질' 남성 모기를 만드는 요인을 정확하게 평가하는 것이 비현실적입니다. 그러나 대규모 매스 리어링에서 일관된 생산 및 품질(일상적으로 평가할 수 있는 범위까지)을 유지하는 것이 가장 중요합니다. 이를 위해서는 작은 변동이 발생할 수 있는 모든 프로세스의 높은 수준의 경계와 표준화가 필요합니다. L1 애벌레의 알리쿼팅은 중요한 단계이며 이 점을 보여줍니다. 트레이에 애벌레의 정확한 수를 알리싱하는 것은 좋은 품질의 생산을 위해 필수적이다. 먹이 정권은 정확하게 유충의 특정 수에 맞게 조정된다. 너무 적은 / 많은 애벌레는 애벌레 생존, 강아지의 크기와 새끼에 시간에 영향을 미치는 과잉 / 아래 먹이 귀착될 것입니다. 대량 사육 의 예술에 대한 비밀이있는 경우 생산 주기의 많은 작은 단계가 일관되고 정확하며 높은 수준의 품질 관리를 수행하도록하는 것입니다.

Oxitec에 소속된 저자는 옥시텍(Oxitec Ltd.)과 옥스포드 대학에서 이 논문의 주제와 관련된 지적 재산권을 보유하고 있습니다.

우리는 비오파브리카 모스 낙타 브라질, Fundação 데 Amparo 페스키사 두 에스타도 데 상파울루 (FAPESP) 및 콘셀호 나시오날 데센볼비멘토 Científico e Tecnologia (CNPq)에 감사드립니다.  우리는 또한 그들의 도움에 대한 다음 사람들에게 감사드립니다; 미리암 도스 산토스, 길딘 실바, 게실레인 도스 산토스, 파비오 곤살베스, 존 폴 올리베이라, 루이자 가르지라, 호세 카를로스 발렌샤.