Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.

Es werden neue Techniken und Methoden gesucht, um den Kampf gegen Mücken zu gewinnen. Jüngste Fortschritte in molekularen Techniken haben zur Entwicklung neuer und innovativer Methoden der Mückenbekämpfung geführt, die auf der Sterile Insect Technique (SIT)^1-3basieren. Eine Kontrollmethode, die als RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)⁴bekannt ist, basiert auf SIT, verwendet aber genetische Methoden, um die Notwendigkeit einer Strahlensterilisation zu entfernen^5-8. Ein RIDL-Stamm von Ae. aegypti wurde erfolgreich auf dem Feld in Grand Cayman^9,10getestet; weitere Feldnutzungen in anderen Ländern der Welt geplant oder in Arbeit sind.

Die Massenaufzucht von Insekten wurde in mehreren Insektenarten und auf Milliardenhöhe pro Woche etabliert. Bei Mücken wurde die Aufzucht jedoch in der Regel in einem viel kleineren Maßstab durchgeführt, wobei die meisten Großaufzuchten in den 1970er und 80er Jahren durchgeführt wurden. Für ein RIDL-Programm ist es wünschenswert, so wenige Weibchen wie möglich freizusetzen, wie sie beißen und Krankheiten übertragen. In einem Massenzuchtprogramm gibt es mehrere Stufen, um die Männchen zu produzieren, die freigesetzt werden sollen: Eierproduktion, Eieraufzucht bis zur Verpfupation und dann das Sortieren von Männchen von Weibchen vor der Freisetzung. Diese Männchen werden dann für ein RIDL-Kontrollprogramm verwendet, freigegeben entweder als Pupae oder Erwachsene^11,12.

Um eine Mückenpopulation mit RIDL zu unterdrücken, muss eine große Anzahl von hochwertigen männlichen Erwachsenen^13,14aufgezogen werden. Im Folgenden werden die Methoden für die Massenaufzucht von OX513A, einem RIDL-Stamm von Ae. aegypti ⁸, zur Freisetzung beschrieben und die Für die Herstellung von Eiern und die Massenaufzucht von RIDL-Männchen für ein Kontrollprogramm erforderlich.

Mücken übertragen viele Krankheitserreger, die eine Reihe von Krankheiten beim Menschen verursachen können, und die Bekämpfung dieser Mücken ist seit Jahrhunderten ein ständiger Kampf. Strategien zur Bekämpfung von Insekten auf der Grundlage chemischer und biologischer Methoden hatten einige bemerkenswerte Erfolge, aber in vielen Fällen war die Kontrolle auf lange Sicht nicht nachhaltig. Zum Beispiel erreichte Brasilien die Ausrottung von Ae. aegypti in den 50er Jahren, aber die Mücke ist in den letzten 40-50 Jahren wieder eingedrungen. Dies kann auf viele Ursachen zurückgeführt werden, einschließlich Insektizidresistenz, Umweltschäden, schlechte Kontrollprogramm-Implementierung^15-20, und die schnelle Wiederinvasion ohne angemessene Überwachung oder Reaktion.

Es werden neue Techniken und Methoden gesucht, um diesen Kampf gegen Mücken zu gewinnen.  Jüngste Fortschritte in molekularen Techniken haben zur Entwicklung neuer und innovativer Methoden der Mückenbekämpfung geführt, die auf der Sterile Insect Technique (SIT)^1-3basieren. Eine Kontrollmethode namens RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)⁴ basiert auf SIT, verwendet aber genetische Methoden, um die Notwendigkeit einer Strahlensterilisation zu beseitigen. RIDL-Stämme wurden für mehrere Schädlingsarten einschließlich Ae. aegypti ^5-8,Ein RIDL-Stamm von Ae. aegypti wurde erfolgreich auf dem Feld in Grand Cayman^{getestet 9,10}; weitere Feldnutzungen in anderen Ländern der Welt geplant oder in Arbeit sind.  Um Mückenpopulationen mit RIDL zu unterdrücken, muss eine große Anzahl hochwertiger männlicher Erwachsener aufgezogen werden^3,14.

Für ein SIT-Programm wird es als wünschenswert angesehen, nur Männer freizusetzen; weibliche Mücken beißen und übertragen Krankheiten. Darüber hinaus können die freigesetzten sterilen Männchen durch die freigesetzten Weibchen , die die Wirksamkeit des Programms reduzieren, "abgelenkt" werden. Die Freisetzung nur für Männer erwies sich als 3-5-fach wirksamer als die Freisetzung von gemischt-geschlechtlichen Verbindungen in großfeldigen Experimenten mit bestrahlten Mittelmeerfruchtfliegen²¹.

In einem RIDL-Massenaufzuchtprogramm gibt es mehrere Stufen, um die Männchen für die Freisetzung zu produzieren.  Die erste besteht darin, die Für die Freisetzungserzeugung erforderlichen Eier herzustellen (Abbildung 1). Der nächste Schritt ist, die Eier bis zu Welpen oder Erwachsenen zu züchten, larven von Pupae und die männlichen Pupae von den weiblichen Pupas zu trennen. Die großflächige Trennung von Männchen und Weibchen erfordert einen Unterschied zwischen den Geschlechtern in einem bestimmten Lebensstadium, das für die Massensortierung geeignet ist²². In Ae. aegypti (und anderen Mückenarten) gibt es einen signifikanten Größenunterschied zwischen den männlichen und weiblichen Pupas, der für Techniken zur Geschlechtstrennung ausgenutzt werden kann. Die sortierten RIDL Männchen werden dann in einem Kontrollprogramm entweder als Pupae oder als Erwachsene^11,12freigegeben.

Im Folgenden werden die Methoden für die Massenaufzucht von OX513A, einem RIDL-Stamm von Ae, beschrieben. Aegypti, zur Freilassung. Die beschriebenen Methoden umfassen die Techniken, die für die Herstellung von Eiern und RIDL-Männchen für ein Kontrollprogramm erforderlich sind.

Insektenanforderungen

1. Übersicht

1. Die Massenaufzucht hat mehrere Phasen, die jeweils in einem bestimmten Bereich der Massenaufzuchteinheit durchgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die Hauptphase der Aufzucht und wo sie in der Massenaufzuchteinrichtung auftreten.

2. Biosicherheitsüberlegungen für das Insektarische

1. Das Projekt wurde vom Komitee für Tierethik der Universität von Sao Paulo - Brasilien genehmigt und alle notwendigen Genehmigungen und Genehmigungen wurden eingeholt.
2. Das RIDL-System verwendet konditionelle Letalität; ein Nahrungsergänzungsmittel (Tetracyclin) verhindert die Expression des RIDL-Systems, so dass die Insekten massenhaft aufgezogen werden können; ohne Tetracyclin sterben die Mücken ab. Tetracyclin ist nicht in den Brutstätten von Ae. aegypti in freier Wildbahn zu finden, so dass alle Nachkommen, die von Flüchtlingen produziert werden, nicht überleben werden.  Dies erhöht ein zusätzliches Maß an Sicherheit gegenüber der Verwendung von Wild-Typ (WT) Insekten, die mit anderen Methoden(d. h. Strahlung) sterilisiert werden.
3. Verwenden Sie doppeltürigen Eingang, "Nur autorisiertes Personal" Zeichen und Insektenschutzgitter im Insektary. Alle Fenster sollten versiegelt werden, um eine Kontamination der Kolonie mit WT-Insekten zu vermeiden und helfen, Fluchten aus dem Inneren des Insekts zu verhindern.
4. Lokale Vorschriften und Behörden können spezifische zusätzliche oder alternative Anforderungen haben. Wenden Sie sich frühzeitig an die zuständigen Behörden, um Informationen/Anleitungen zu erhalten, und sichern Sie sich alle erforderlichen Genehmigungen und Genehmigungen, bevor Sie den RIDL-Stamm in einem Insektaum festlegen.
5. Das Massenaufzucht-Insektariat sollte nur für die RIDL-Aufzucht verwendet werden. Andere Stämme oder Insekten sollten nicht vorhanden sein. Dies ist, um eine Kontamination des RIDL-Stamms und Kontamination mit Krankheitserregern zu vermeiden, die Fitness und Überleben beeinträchtigen können, wodurch die Produktivität und Wirksamkeit der freigesetzten Männchen reduziert wird.

3. Insektenbild

1. Abbildung 2 zeigt einen Plan des Insektares, das bei Biofébrica Moscamed in Brasilien verwendet wird.
2. Die Temperatur aller Räume betrug 26 °C ± 2) mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von ca. 70-80% und einem 12:12 hr Hell:Dunkel-Zyklus mit fluoreszierenden Lichtstreifen.
3. Dieser Bauplan kann entsprechend den spezifischen Platzanforderungen geändert werden, z.B. bestimmt der Maßstab der Version die Gesamtgröße. Die Eierproduktion, aufzucht und Sortieren, Qualitätskontrolle (QC) und Freisetzungen sollten jedoch in vier verschiedene Bereiche unterteilt werden: Egg Production Colony, Release Generation, QC und Adult Storage for Release.
4. Der Raum der Eierproduktionskolonie (ca. 20^m2) wird zur Herstellung von Eiern für die Freisetzungserzeugung genutzt.
5. Im Bereich Qualitätskontrolle werden Experimente durchgeführt, um die Verfahren und die Eignung der RIDL-Linie zu überprüfen, einschließlich Der Messung der Schraffurrate, der Pupae-Zahlen, der Pupagröße und der Messung der Wirksamkeit des Sortierens und Entfernens von Weibchen. Tests werden auch auf WT-Kontamination durchgeführt, indem das Vorhandensein von Fluoreszenzmarker und Phänotyp mithilfe von Offset-Assays zur Messung der Letalität überprüft wird.
6. Der Raum der Freisetzungsgenerierung (ca. 36^m2) benötigt ausreichend Platz für Trays und die Sortierung von Larven und Pupas. Die Schalen werden in speziell gebauten Aluminium-Racks aufbewahrt. Für die Aufzucht und Sortierung sind ein großer Arbeitsbereich und ein Waschbecken erforderlich, und zum Waschen von Schalen und Käfigen ist ein weiteres großes Waschbecken erforderlich. Eine Filterfangfalle wurde in den Abwasserauslauf aus den Senken aufgenommen, um die Flucht lebender Mücken durch die Kanalisation zu verringern.
7. Das gesamte Wasser, das für die Schalen verwendet wird, wird durch einen Abfluss entsorgt, der ein Fach mit einem Netz hat, das das Entweichen von Insekten in jeder Entwicklungsstufe verhindert.
8. Für die Lagerung von Erwachsenen ist ein Bereich erforderlich, der für die Freigabe erforderlich ist (Adult Storage for Release, Abbildung 2), der Racking enthält, um die Freigabegeräte zu halten, während die Erwachsenen vor der Freigabe reifen.

Produktionsmethoden für die Massenaufzucht RIDL:

Die Eierproduktionskolonie produziert die Eier, die in der Release Generation (Abbildung 1) zur Herstellung von Erwachsenen verwendet werden. Es gibt viele Ähnlichkeiten in den beiden Aufzuchtmethoden, aber auch einige deutliche Unterschiede. Die für beide Verfahren gleichen Aufzuchtprozesse werden nur im Abschnitt Eierproduktionskolonie beschrieben.

Eierproduktionskolonie

4. Larval Produktion

Die Eierproduktionskolonie erzeugt homozygote OX513A RIDL-Eier⁸ für die Release Generation. Eine hohe Qualitätskontrolle gewährleistet die Lebensfähigkeit, Fitness und Dehnungsintegrität der gelieferten Eier.

1. Der Reiz für das Schlüpfen ist das Eintauchen in Wasser mit einem niedrigen Gehalt an gelöstem Sauerstoff. Um den Sauerstoffgehalt im Wasser zu reduzieren, gießen Sie Wasser, bis es kocht, und legen Sie sofort 400 ml in 500 ml Glasgläser (74 mm Öffnungsumfang), befestigen Sie den Deckel sicher und lassen Sie bei Raumtemperatur für mehrere Stunden abkühlen.
2. 1 g Eier in ein Glas gekochtes Wasser geben, wieder versiegeln und eine Stunde warten. Den Inhalt auf ein Tablett mit 2 L Wasser geben und unter insektierenden Bedingungen über Nacht lassen.
3. Die geschlüpften Larven in ein bekanntes Wasservolumen geben und mit einem magnetischen Rührer und Floh rühren, damit genügend Zeit für die Einnahme von Aliquots zur Zeit zur Einnahme von Aliquots zur Zeit ist; kräftiges Rühren oder für längere Zeit Schäden Larven und sollte auf ein Minimum gehalten werden. Das Standardvolumen, das zum Schlüpfen von Larven verwendet wird, beträgt 1 L, jedoch sind Dichten von mehr als 300 Larven/ml schwer zu zählen und können schädlich sein. Daher nicht mehr als etwa 300.000 Eier/L Wasser schlüpfen.
4. Bestimmen Sie die Schraffurrate, indem Sie drei 1 ml Aliquots einnehmen und auf ein Blatt saugfähiges Papier mit einem Raster von 1 cm Quadraten auf einem saugfähigen Schwamm legen, um überschüssiges Wasser aufzusaugen.  Zählen Sie die Anzahl der geschlüpften und nicht geschlüpften Eier von drei Quadraten, indem Sie nach der fehlenden Kappe eines geschlüpften Eis suchen. Es wird eine Schraffurrate von etwa 80-90% erwartet.
5. Nehmen Sie vier Aliquots von je 1 ml und legen Sie sie in vier schwarze Wägeboote (Larven sind weiß und daher besser sichtbar vor schwarzem Hintergrund) und zählen Sie die Anzahl der lebenden Larven, die mit dem Auge vorhanden sind; die Verwendung eines Zählers wird empfohlen. Die durchschnittliche Anzahl der Larven pro ml wird dann verwendet, um das Wasservolumen zu berechnen, das auf jedem Tablett hinzugefügt werden soll, um die gewünschte Anzahl von Larven pro Tablett zu erhalten.
6. Es kann große Unterschiede in der Dichte geben, bei der Larven zwischen Stämmen und Arten aufgezogen werden können. Es ist auch wünschenswert, RIDL erwachsene männliche Größe mit wilden Typ Männchen zu vergleichen; idealerweise möchten Sie ähnlich wie größere RIDL Männchen, die erfolgreich mit wilden Männchen konkurrieren können. Daher muss für jede RIDL-Sorte die ideale Larvendichte ermittelt werden und ist ein Kompromiss gegen Platzbeschränkungen für die Aufzucht und den Produktionsumfang. Dichten von 0,1-2,5 Larven/ml haben wir gefunden, um eine gute Kombination von Produktionsleistung und Qualität zu sein; auch von Medici²³diskutiert.
7. Fügen Sie die Larven zu den Schalen hinzu. Bei uns verwenden wir Schalen von ca. 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x B x H) und der erforderlichen Wassermenge, um die Dichte der Larven für die Produktion zu erreichen.
8. Fügen Sie eine Stammlösung tetracyclin (3 mg/ml in Wasser) in die Schalen mit einer Verdünnung von 1:100 hinzu, um die erforderliche Endkonzentration von 30 g/ml zu erhalten.
9. Füttern Sie Täglich Larven mit Flockenfischfutter(www.sera.de), das zu einem feinen Pulver zerkleinert wurde. Tabelle 1 zeigt die typische Fütterungsregelung in mg Lebensmittel pro Larven pro Tag. Füttern Sie Larven bis zum entsprechenden Tag der Sortierung unter den oben beschriebenen insektenmäßigen Bedingungen.

5. Sortieren von Larven aus Pupae und männlichen/weiblichen Pupae

1. Sortieren Sie Larven von Pupae 8 Tage nach dem Schlüpfen, indem Sie die Larven von den Pupaen trennen. Dann sex-sortieren Sie die Pupae für Männer. Ein Gerät, das als Plattenabscheider^24,25 bekannt ist, kann Larven von männlichen Pupaen und von weiblichen Pupas sortieren. Abbildung 3 zeigt die Verwendung dieses Plattenabscheiders, um Larven von männlichen und weiblichen Pupas zu trennen.
2. Mit einem Messlöffel mit einem Netz auf der Unterseite, kalibrieren Sie es mit 500 Welpen oder mehr und verwenden Sie es, um Käfige einzurichten und die Gesamtmenge der produzierten Männchen und Weibchen zu schätzen.
3. Am ersten Tag der Sortierung (Tag 8) sind die meisten Der Pupae Männchen, also legen Sie die sortierten Larven wieder in ein Tablett und ziehen sie bis zum folgenden Tag zurück, wenn die meisten Welpen Weibchen sind (Abbildung 4).
4. Wiederholen Sie den Sortiervorgang jeden Tag, wie in den Schritten 2.1-2.3 beschrieben, bis alle Larven verpupiert sind oder bis zum Ende einer Arbeitswoche.
5. Legen Sie 1.000 männliche Pupas (mit dem Messlöffel) in einen Käfig und fügen Sie am 9. Tag 3.000 weibliche Welpen in den gleichen Käfig (wir verwenden 30 cm hohe und 30 cm Durchmesser PVC-Rohre mit Mesh-Top und einem netzierten Zugangsloch angepasst, aber 30 cm x 30 cm x 30 cm Kunststoffkäfige sind auch bei BugDorm erhältlich).
6. Lassen Sie Erwachsene für mindestens 2 Tage paaren und versorgen Sie sie mit Saccharoselösung (10%) auf nasser Baumwolle ad libitum vor der Blutfütterung. Sammeln Sie Eier für zwei Wochen (zwei gonotrophe Zyklen) mit zwei Blutfutter pro Woche. Daraus ergeben sich durchschnittlich 143.000 Eier aus einem Käfig von 3.000 Weibchen (durchschnittlich 48 Eier/Weiblich). Für die Produktion von 4 Millionen Eiern pro Woche müssen jede Woche etwa 28 Käfige aufgestellt werden.

6. Blutfütterung

1. Ein Aluminiumplatten-Fütterungssystem versorgt Käfige zweimal pro Woche mit Blut. Eine Bluttasche entsteht an der Seite einer Aluminiumplatte (10 cm x 10 cm x 3 mm) mit Parafilm (Abbildung 5). Um die Fütterung zu fördern, wird das Blut erwärmt, indem ein beheizter Bohnenbeutel auf die Tellerzuführung aufgebracht wird. Der Bohnensack bestand aus ca. 250 g Weizenkörnern in einem Stoffbeutel, der etwa 10 Sek. in einer Mikrowelle erhitzt wird. Das Blut, das wir zur Fütterung verwenden, stammt aus einem lokalen Schlachthof; Da diese Tiere (hauptsächlich Ziegen und Schafe) für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, werden sie auf die Vermeidung von Krankheitserregern getestet.
2. Drei Tage nach der Blutfütterung wird eine Eileiter für die Weibchen zur Verfügung gestellt, um ihre Eier zu legen. Die eileiterstelle ist ein runder Kunststoffbehälter, der bis zu 1/4 mit Wasser und Filterpapier gefüllt ist, der die Innenseite bedeckt. Zwei Tage später wird die Eileiter entfernt. Stellen Sie für eine maximale Eierproduktion sicher, dass das Filterpapier die gesamte verfügbare Oberfläche im Behälter abdeckt und nass bleibt.
3. Das Eipapier entfernen und auf saugfähiges Papier legen, um es unter insektierenden Bedingungen zu trocknen; Eier benötigen eine Konditionierungszeit bei hoher Luftfeuchtigkeit (über 70%) von mindestens 48 Stunden nach der Verlegung. Eier können im Insekt abis zu 3 Monate mit minimaler Abnahme der Schraffurrate gelassen werden, solange die Luftfeuchtigkeit hoch gehalten wird²⁵.
4. Die Eiproduktionskolonie muss ausreichend groß sein, um die Anzahl der Eier bereitzustellen, die wöchentlich für das Freisetzungsprogramm benötigt werden. Die oben beschriebene Anlage kann etwa 4 Millionen Eier mit 28 Käfigen pro Woche produzieren. Es wird empfohlen, genügend Eier zu lagern, um mindestens 4 Wochen Eier für Release Generation und Eiproduktionskolonie zu garantieren.

Release-Generierung

7. Larval Produktion

Die Schraffur-, Aufzucht- und Sortierprozesse für die Freisetzungserzeugung sind identisch mit der zuvor beschriebenen Methode für die Eierproduktionskolonie. Der Produktionsumfang ist jedoch viel größer und erfordert mehr Schalen und mehr Aufwand.

8. Sortieren von Larven, männlichen Pupae und weiblichen Pupae

1. Die Sortierung von Larven, männlichen Pupas und weiblichen Welpen ist identisch mit der für die Eierproduktion beschriebenen Methode.
2. Nach dem Sortieren der männlichen Pupae ist es wichtig, vor der Freisetzung auf weibliche Kontamination zu überprüfen; es sollte nicht mehr als 1% Frauen vorhanden sein. Nehmen Sie drei Aliquots von 500 Pupae (drei zufällige Pupae Messen Löffel) und zählen Sie die Anzahl der weiblichen Pupae vorhanden. Weibchen können identifiziert werden, da sie im Allgemeinen größer als Männer sind und durch Unterschiede in der Geschlechtslappenform (Abbildung 6)²⁷. Wenn es mehr als 1% Weibchen gibt, sollten sie zurückgegriffen und erneut überprüft werden.
3. Verwenden Sie nur die Männchen ab Tag 8 und 9 für die Freigabe; alle verbleibenden Larven und Pupas zu autoklavieren. In Brasilien müssen diese Abfälle wie medizinische Abfälle behandelt werden, aber die Vorschriften können in anderen Ländern unterschiedlich sein. Verwenden Sie keine weiblichen Pupas und Larven aus der Freisetzungsgeneration für die Eierproduktionskolonie aufgrund von Unterschieden in der Qualitätskontrolle, Aufzucht und Kontaminationsrisiken durch größere Mengen und niedrigere Qualitätskontrolle.

Adult Storage for Release: Platzieren Sie Männchen in Release-Geräte, um vor der Veröffentlichung zu entstehen und zu reifen. Die Details der Freigabegeräte werden in dieser Methode nicht behandelt. Die Kapazität der von uns genutzten Trenngeräte beträgt jedoch etwa 1.000 Männer. Die Details der Freigabemethode (Freigabegerät und Freigabesystem) werden in dieser Methode nicht behandelt.

Die erwarteten Vergupungsergebnisse für die Produktion sind in Abbildung 4dargestellt. Die Männchen verpupieren zuerst, Spitzenwert an Tag 8 und die Weibchen Spitzen am Tag 9 nach dem Schlüpfen. Es ist wichtig, diese Welpenkurve zu messen, um die beste Zeit zu kennen, um Männchen von Weibchen zu sortieren.

Die Ergebnisse von mehr als 6 Monaten sortieren der männlichen und weiblichen Welpen zeigen, dass die weibliche Kontamination im Durchschnitt 0,02 % beträgt (Abbildung 5; SEM = 0,004%). Diese Kontaminationsrate entspricht nur 400 Frauen, die über einen Monat nach freisetzungen (ca. zwei Millionen Männer) freigesetzt werden. Die derzeitige Eierproduktion pro Woche beträgt 4 Millionen. Davon sind 3,5 Millionen für die Eierkolonie und die Produktion geschlüpft, der Rest wird zur Sicherung gespeichert. Ungefähr 11% der Eier werden für die Eierproduktionskolonie und den Rest für die Freisetzungserzeugung verwendet. Eierlukenrate durchschnittlich 87,3% (SEM = 0,5%) und ertragsmenge männlicher Pupae aus L1-Larven durchschnittlich 29,5% (SEM = 1,2). Zwei Millionen Larven werden jede Woche für die Release Generation Kolonie aufgezogen, die rund 571.000 männliche Pupae (SEM = 14.000) produziert. Pupae und Erwachsenensterblichkeit während der Entstehung und Freisetzung durchschnittlich 5%, was zu etwa 543.000 (SEM = 13.000) freigesetzten erwachsenen männlichen Mücken pro Woche führt. Es wird erwartet, dass die derzeitige Produktion von 4 Millionen Eiern/Woche auf 3 Millionen US-Dollar pro Woche reduziert werden könnte, mit einer weiteren Optimierung, um den Verlust durch Verschwendung und Lagerung zu reduzieren. Insgesamt werden 6 Mitarbeiter für die beschriebene Produktion benötigt; vier arbeiten an der Freisetzungsgeneration und die restlichen zwei an der Eikolonie.

Qualitätskontrolle

Qualitätskontrolle ist wichtig, um die Qualität der Erwachsenen, Effizienz der Aufzucht, Arbeit und Kosten zu erhalten.

Transgene Phänotypkontrolle

Um die RIDL-Genexpression zu überprüfen, werden zwei Kontrollen durchgeführt, erstens zur Überprüfung der Expression des Fluoreszenzmarkers und zweitens zur Überprüfung der Expression von RIDL-Letalitätsmerkmalen in Abwesenheit von Tetracyclin. Alle Larven sollten den fluoreszierenden Marker ausdrücken. Um zu überprüfen, ob der Fluoreszenzmarker wie erwartet ausgedrückt wird, werden 2.000 erste Instar-Larven unter einem Leica MZFLIII Stereomikroskop mit DsRed2-Filter (Texas Red) überprüft, um festzustellen, ob nicht fluoreszierende Personen vorhanden sind. Ohne Tetracyclin wird das RIDL-Gen exprimiert und wir erwarten 3-4% Überleben für Erwachsene⁸. Um dies zu überprüfen, wird für jede Freigabecharge ohne Tetracyclin ein zusätzliches Fach eingerichtet. Der einzige Unterschied zur normalen Aufzucht ist, dass die Nahrung ab Tag 6 um 2/3 reduziert wird, da die Anhäufung überschüssiger Nahrung durch tote Larven zu einem übermäßigen Bakterienwachstum führen kann.

Aufrüstung

Vier Schalen aus der Release-Generierung werden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um einzeln sortiert und gezählt zu werden. Die Anzahl der männlichen und weiblichen Welpen wird jeden Tag von jedem Tablett aufgezeichnet (Abbildung 4). Jede Abweichung von der erwarteten Anzahl von Männchen und Weibchen deutet auf ein potenzielles Problem hin, das die Produktion und/oder Fitness beeinträchtigen könnte und mit der Eikolonie verglichen werden kann, um die Ursache der Probleme zu bestimmen.

Pupae Messungen

Pupae Größe hat sich gezeigt, dass mit Erwachsenen Größe²⁸korreliert werden. Als Qualitätskontrolle für die Größe erwachsener Personen wird die Cephalothoraxbreite von mindestens 30 männlichen Pupaen für jeden Sortiertag aus der Freisetzungsgeneration gemessen; für die Eierproduktionskolonie werden auch weibliche Pupae gemessen. Die durchschnittliche Cephalothoraxbreite betrug 1,05 mm (SEM 0,005) für freigesetzte Männchen und 1,04 mm (SEM = 0,006) und 1,29 mm (SEM = 0,006) für Männer und Weibchen bzw. Eierproduktion, Kolonie; ähnliche Ergebnisse wurden für Ae. albopictus Massenaufzucht²⁴erzielt.

Abbildung 1. Stufen der Massenzucht von Mücken für den Einsatz in einem RIDL/SIT-Programm. Die Eierproduktionskolonie verfügt über ein hohes Maß an Qualitätskontrolle, um die Qualität der Eier zu gewährleisten, die der Freisetzungsgeneration geliefert werden.  Eier werden in der Freisetzungskolonie zu Pupae aufgezogen, wo die Männchen von den Weibchen sortiert werden.  Die männlichen Erwachsenen werden dann für das RIDL-Kontrollprogramm verwendet.

Abbildung 2. Schemat der Aufzuchtanlage für die Produktion von RIDL-Männchen für ein Freigabeprogramm. Hochwertige Eier werden kontinuierlich im Raum der Eierproduktionskolonie produziert und dann im Release Generation Raum bis zu Pupae aufgezogen. Die Larven und Pupae werden dann getrennt und die Pupae für Männer geschlechtssortiert. Die Männchen werden dann in Release-Geräte gelegt und erlaubt, zu Erwachsenen für die Freigabe in der Erwachsenen Lagerung und Freigabe Raum reifen. 

Abbildung 3. Trennung von Larven, männlichen Pupas und weiblichen Welpen mit einem Plattenabscheider²⁶.  Der Plattenabscheider verwendet den Größenunterschied zwischen Larven, männlichen Pupas und weiblichen Welpen, um diese drei verschiedenen Lebensphasen zu sortieren; Larven sind in der Regel kleiner als männliche Pupae, die wiederum kleiner sind als weibliche Pupae.  Das Instrument besteht aus zwei Glasplatten; eine ist an einem schrägen Metallrahmen befestigt und die andere sitzt auf der Oberseite der ersten Platte und kann relativ zur ersten mit vier Verstellschrauben (A) bewegt werden.  Die vier Verstellschrauben ermöglichen es, die Außenplatte in einem Winkel zur Hinterplatte einzustellen, so dass ein keilförmiger Raum zwischen den Platten gebildet wird, der sich nach unten verjüngt.  Larven und Pupae werden zwischen die Glasplatten gegossen (B) und sanft mit einem Wasserschlauch gewaschen (C).  Durch die Einstellung des Winkels der Platte können Larven, männliche Pupae und weibliche Pupae getrennt werden (D).  Mit kontinuierlicher Spülung und Erhöhung des Plattenwinkels können die Larven zuerst (in ein Sieb) gespült werden, gefolgt von den männlichen Pupas und schließlich den weiblichen Pupas. 

Abbildung 4. Pupationskurven für massenaufgezogene RIDL Ae. aegypti.  Diese Grafik zeigt den durchschnittlichen prozentualen Anteil der Verpupation für massenaufzuchte RIDL-Männer und weibliche Pupas während der Beobachtung von 23 Wochen mit 135.000 US-Prozent Pro Woche.  Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts, n = 23. Bei der ersten Sammlung (Tag 8) haben wir durchschnittlich 59% männliche und 30% weibliche Welpen von der gesamten Pupae, die von Tabletts über 5 Tage geborgen wurde, zurückgewonnen. 

Abbildung 5. Durchschnittliche weibliche Kontamination von sortierten männlichen Pupaen. Diese Grafik zeigt den monatlichen durchschnittlichen prozentualen Prozentsatz der weiblichen Kontamination während der männlichen Sortierung am 8. Tag nach dem Schlüpfen über einen Zeitraum von sechs Monaten. 

Abbildung 6. Aluminium-Platte BlutzuführungSystem. Die Platte (B) wird mit Parafilm (A) bedeckt und Blut in eine Tasche geführt und dann versiegelt (D). Die Platte wird auf einen Käfig gelegt und erhitzt, indem sie einen erwärmten Bohnensack (C) oben (E )platziert. 

Abbildung 7. Unterscheidung männlicher und weiblicher Ae. aegypti pupae. Ae. aegypti pupae kann zuverlässig durch die Unterschiede in der Genitallappenform (am Ende der pupalbauchischen Segmente direkt unter den Paddeln) sexiert werden. Darüber hinaus sind Männchen auch kleiner als Weibchen.   

Tabelle 1. Allgemeines Fütterungsregime für Ae. aegypti RIDL Larven (mg Nahrung pro Larve pro Tag). Um die tatsächliche Menge der benötigten Nahrung zu berechnen, multiplizieren Sie mit der Gesamtzahl der Larven pro Tablett.

RIDL ist eine effektive und umweltverträgliche Methode zur Bekämpfung von Mücken^3,29-31. Die Technik ist auf ein integriertes Schädlingsbekämpfungsprogramm anwendbar und die meisten aktuellen Kontrollmethoden, einschließlich Larviziden, Reduzierung von Brutgebieten und Adultizide, sind mit dieser Technologie kompatibel. Diese Methode beschreibt, wie man bis zu 570.000 RIDL männliche Pupae pro Woche für den Einsatz bei der Kontrolle von Ae produziert. Aegypti und unseres Wissens ist dies die erste Beschreibung der Produktion von transgenen Mücken in diesem Ausmaß. Einige vergleichbare Produktionssysteme wurden für Wildtyp Ae. aegypti in den 1960er und 70er Jahren²⁵entwickelt, aber seither gab es keine vergleichbare Produktion in diesem Maßstab. In Brasilien wurden von Februar 2011 bis Februar 2012 rund 11 Millionen Männer freigelassen. Die Anzahl der Männchen, die für die Kontrolle eines bestimmten Gebiets erforderlich sind, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter die Größe der wildlebenden Population, die Verbreitung von freigesetzten Männchen, das Überleben und die Paarungswettbewerbsfähigkeit von Männchen nach der Freisetzung und Umweltbedingungen.  Frühere Studien haben gezeigt, dass RIDL eine Population von Mücken um mindestens 80% reduzieren kann⁹.

Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Optimierung der Massenaufzucht für produktionskalierung und der Kosten- und Qualität der Männer erforderlich. Beispielsweise kann die Erhöhung der Larvendichte die Produktionskapazität erhöhen, indem der Platzbedarf, die Zeit bis zur Verpupperung³²reduziert wird. Eine zu hohe Larvendichte kann jedoch zu kleineren und kürzeren Männchen mit reduzierter Paarungskapazität^{von 32,33}führen. Die Qualität der Männchen in Bezug auf ein SIT-Programm wird letztlich durch die Fähigkeit der freigelassenen Männchen beurteilt werden, sich mit Weibchen im Feld zu paaren. Eine umfassende Feldbewertung ist erforderlich, um die Wettbewerbsfähigkeit der Paarung im Vergleich zu wilden Gegenstücken zu bewerten^9,10. Dies macht es oft unpraktisch, genau zu beurteilen, welche Faktoren eine "hochwertige" männliche Mücke machen. Die Aufrechterhaltung einer gleichbleibenden Produktion und Qualität (soweit dies routinemäßig evaluiert werden kann) in der großangelegten Massenaufzucht ist jedoch von größter Bedeutung. Dies erfordert ein hohes Maß an Wachsamkeit und Standardisierung aller Prozesse mit kleinen Schwankungen, die möglicherweise erhebliche Auswirkungen haben. Die Aliquotierung von L1-Larven ist ein kritischer Schritt und veranschaulicht diesen Punkt. Die richtige Anzahl von Larven in Schalen zu zitieren, ist für eine gute Produktion unerlässlich. Die Fütterungsregelung ist genau auf die spezifische Anzahl von Larven zugeschnitten. Zu wenige/viele Larven führen zu einer Über-/Unterfütterung, was das Überleben der Larven, die Größe der Pupae und die Zeit bis zur Verpupation beeinflusst. Wenn es ein Geheimnis der Kunst der Massenaufzucht ist es, sicherzustellen, dass die vielen kleinen Schritte im Produktionszyklus konsequent, präzise und mit einem hohen Maß an Qualitätskontrolle durchgeführt werden, wie in diesem Papier beschrieben.

Autoren, die Mit Oxitec verbunden sind, haben eine Anstellung und/oder Beteiligung an Oxitec Ltd. Oxitec Ltd und Oxford University halten geistiges Eigentum im Zusammenhang mit dem Thema dieses Papiers.

Wir danken Biofébrica Moscamed Brasil, Fundaéo de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnologia (CNPq) für die finanzielle Unterstützung.  Wir möchten auch den folgenden Personen für ihre Unterstützung danken; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valena.