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Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.
Es werden neue Techniken und Methoden gesucht, um den Kampf gegen Mücken zu gewinnen. Jüngste Fortschritte in molekularen Techniken haben zur Entwicklung neuer und innovativer Methoden der Mückenbekämpfung geführt, die auf der Sterile Insect Technique (SIT)1-3basieren. Eine Kontrollmethode, die als RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4bekannt ist, basiert auf SIT, verwendet aber genetische Methoden, um die Notwendigkeit einer Strahlensterilisation zu entfernen5-8. Ein RIDL-Stamm von Ae. aegypti wurde erfolgreich auf dem Feld in Grand Cayman9,10getestet; weitere Feldnutzungen in anderen Ländern der Welt geplant oder in Arbeit sind.
Die Massenaufzucht von Insekten wurde in mehreren Insektenarten und auf Milliardenhöhe pro Woche etabliert. Bei Mücken wurde die Aufzucht jedoch in der Regel in einem viel kleineren Maßstab durchgeführt, wobei die meisten Großaufzuchten in den 1970er und 80er Jahren durchgeführt wurden. Für ein RIDL-Programm ist es wünschenswert, so wenige Weibchen wie möglich freizusetzen, wie sie beißen und Krankheiten übertragen. In einem Massenzuchtprogramm gibt es mehrere Stufen, um die Männchen zu produzieren, die freigesetzt werden sollen: Eierproduktion, Eieraufzucht bis zur Verpfupation und dann das Sortieren von Männchen von Weibchen vor der Freisetzung. Diese Männchen werden dann für ein RIDL-Kontrollprogramm verwendet, freigegeben entweder als Pupae oder Erwachsene11,12.
Um eine Mückenpopulation mit RIDL zu unterdrücken, muss eine große Anzahl von hochwertigen männlichen Erwachsenen13,14aufgezogen werden. Im Folgenden werden die Methoden für die Massenaufzucht von OX513A, einem RIDL-Stamm von Ae. aegypti 8, zur Freisetzung beschrieben und die Für die Herstellung von Eiern und die Massenaufzucht von RIDL-Männchen für ein Kontrollprogramm erforderlich.
Mücken übertragen viele Krankheitserreger, die eine Reihe von Krankheiten beim Menschen verursachen können, und die Bekämpfung dieser Mücken ist seit Jahrhunderten ein ständiger Kampf. Strategien zur Bekämpfung von Insekten auf der Grundlage chemischer und biologischer Methoden hatten einige bemerkenswerte Erfolge, aber in vielen Fällen war die Kontrolle auf lange Sicht nicht nachhaltig. Zum Beispiel erreichte Brasilien die Ausrottung von Ae. aegypti in den 50er Jahren, aber die Mücke ist in den letzten 40-50 Jahren wieder eingedrungen. Dies kann auf viele Ursachen zurückgeführt werden, einschließlich Insektizidresistenz, Umweltschäden, schlechte Kontrollprogramm-Implementierung15-20, und die schnelle Wiederinvasion ohne angemessene Überwachung oder Reaktion.
Es werden neue Techniken und Methoden gesucht, um diesen Kampf gegen Mücken zu gewinnen. Jüngste Fortschritte in molekularen Techniken haben zur Entwicklung neuer und innovativer Methoden der Mückenbekämpfung geführt, die auf der Sterile Insect Technique (SIT)1-3basieren. Eine Kontrollmethode namens RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4 basiert auf SIT, verwendet aber genetische Methoden, um die Notwendigkeit einer Strahlensterilisation zu beseitigen. RIDL-Stämme wurden für mehrere Schädlingsarten einschließlich Ae. aegypti 5-8,Ein RIDL-Stamm von Ae. aegypti wurde erfolgreich auf dem Feld in Grand Caymangetestet 9,10; weitere Feldnutzungen in anderen Ländern der Welt geplant oder in Arbeit sind. Um Mückenpopulationen mit RIDL zu unterdrücken, muss eine große Anzahl hochwertiger männlicher Erwachsener aufgezogen werden3,14.
Für ein SIT-Programm wird es als wünschenswert angesehen, nur Männer freizusetzen; weibliche Mücken beißen und übertragen Krankheiten. Darüber hinaus können die freigesetzten sterilen Männchen durch die freigesetzten Weibchen , die die Wirksamkeit des Programms reduzieren, "abgelenkt" werden. Die Freisetzung nur für Männer erwies sich als 3-5-fach wirksamer als die Freisetzung von gemischt-geschlechtlichen Verbindungen in großfeldigen Experimenten mit bestrahlten Mittelmeerfruchtfliegen21.
In einem RIDL-Massenaufzuchtprogramm gibt es mehrere Stufen, um die Männchen für die Freisetzung zu produzieren. Die erste besteht darin, die Für die Freisetzungserzeugung erforderlichen Eier herzustellen (Abbildung 1). Der nächste Schritt ist, die Eier bis zu Welpen oder Erwachsenen zu züchten, larven von Pupae und die männlichen Pupae von den weiblichen Pupas zu trennen. Die großflächige Trennung von Männchen und Weibchen erfordert einen Unterschied zwischen den Geschlechtern in einem bestimmten Lebensstadium, das für die Massensortierung geeignet ist22. In Ae. aegypti (und anderen Mückenarten) gibt es einen signifikanten Größenunterschied zwischen den männlichen und weiblichen Pupas, der für Techniken zur Geschlechtstrennung ausgenutzt werden kann. Die sortierten RIDL Männchen werden dann in einem Kontrollprogramm entweder als Pupae oder als Erwachsene11,12freigegeben.
Im Folgenden werden die Methoden für die Massenaufzucht von OX513A, einem RIDL-Stamm von Ae, beschrieben. Aegypti, zur Freilassung. Die beschriebenen Methoden umfassen die Techniken, die für die Herstellung von Eiern und RIDL-Männchen für ein Kontrollprogramm erforderlich sind.
Insektenanforderungen
1. Übersicht
2. Biosicherheitsüberlegungen für das Insektarische
3. Insektenbild
Produktionsmethoden für die Massenaufzucht RIDL:
Die Eierproduktionskolonie produziert die Eier, die in der Release Generation (Abbildung 1) zur Herstellung von Erwachsenen verwendet werden. Es gibt viele Ähnlichkeiten in den beiden Aufzuchtmethoden, aber auch einige deutliche Unterschiede. Die für beide Verfahren gleichen Aufzuchtprozesse werden nur im Abschnitt Eierproduktionskolonie beschrieben.
Eierproduktionskolonie
4. Larval Produktion
Die Eierproduktionskolonie erzeugt homozygote OX513A RIDL-Eier8 für die Release Generation. Eine hohe Qualitätskontrolle gewährleistet die Lebensfähigkeit, Fitness und Dehnungsintegrität der gelieferten Eier.
5. Sortieren von Larven aus Pupae und männlichen/weiblichen Pupae
6. Blutfütterung
Release-Generierung
7. Larval Produktion
Die Schraffur-, Aufzucht- und Sortierprozesse für die Freisetzungserzeugung sind identisch mit der zuvor beschriebenen Methode für die Eierproduktionskolonie. Der Produktionsumfang ist jedoch viel größer und erfordert mehr Schalen und mehr Aufwand.
8. Sortieren von Larven, männlichen Pupae und weiblichen Pupae
Adult Storage for Release: Platzieren Sie Männchen in Release-Geräte, um vor der Veröffentlichung zu entstehen und zu reifen. Die Details der Freigabegeräte werden in dieser Methode nicht behandelt. Die Kapazität der von uns genutzten Trenngeräte beträgt jedoch etwa 1.000 Männer. Die Details der Freigabemethode (Freigabegerät und Freigabesystem) werden in dieser Methode nicht behandelt.
Die erwarteten Vergupungsergebnisse für die Produktion sind in Abbildung 4dargestellt. Die Männchen verpupieren zuerst, Spitzenwert an Tag 8 und die Weibchen Spitzen am Tag 9 nach dem Schlüpfen. Es ist wichtig, diese Welpenkurve zu messen, um die beste Zeit zu kennen, um Männchen von Weibchen zu sortieren.
Die Ergebnisse von mehr als 6 Monaten sortieren der männlichen und weiblichen Welpen zeigen, dass die weibliche Kontamination im Durchschnitt 0,02 % beträgt (Abbildung 5; SEM = 0,004%). Diese Kontaminationsrate entspricht nur 400 Frauen, die über einen Monat nach freisetzungen (ca. zwei Millionen Männer) freigesetzt werden. Die derzeitige Eierproduktion pro Woche beträgt 4 Millionen. Davon sind 3,5 Millionen für die Eierkolonie und die Produktion geschlüpft, der Rest wird zur Sicherung gespeichert. Ungefähr 11% der Eier werden für die Eierproduktionskolonie und den Rest für die Freisetzungserzeugung verwendet. Eierlukenrate durchschnittlich 87,3% (SEM = 0,5%) und ertragsmenge männlicher Pupae aus L1-Larven durchschnittlich 29,5% (SEM = 1,2). Zwei Millionen Larven werden jede Woche für die Release Generation Kolonie aufgezogen, die rund 571.000 männliche Pupae (SEM = 14.000) produziert. Pupae und Erwachsenensterblichkeit während der Entstehung und Freisetzung durchschnittlich 5%, was zu etwa 543.000 (SEM = 13.000) freigesetzten erwachsenen männlichen Mücken pro Woche führt. Es wird erwartet, dass die derzeitige Produktion von 4 Millionen Eiern/Woche auf 3 Millionen US-Dollar pro Woche reduziert werden könnte, mit einer weiteren Optimierung, um den Verlust durch Verschwendung und Lagerung zu reduzieren. Insgesamt werden 6 Mitarbeiter für die beschriebene Produktion benötigt; vier arbeiten an der Freisetzungsgeneration und die restlichen zwei an der Eikolonie.
Qualitätskontrolle
Qualitätskontrolle ist wichtig, um die Qualität der Erwachsenen, Effizienz der Aufzucht, Arbeit und Kosten zu erhalten.
Transgene Phänotypkontrolle
Um die RIDL-Genexpression zu überprüfen, werden zwei Kontrollen durchgeführt, erstens zur Überprüfung der Expression des Fluoreszenzmarkers und zweitens zur Überprüfung der Expression von RIDL-Letalitätsmerkmalen in Abwesenheit von Tetracyclin. Alle Larven sollten den fluoreszierenden Marker ausdrücken. Um zu überprüfen, ob der Fluoreszenzmarker wie erwartet ausgedrückt wird, werden 2.000 erste Instar-Larven unter einem Leica MZFLIII Stereomikroskop mit DsRed2-Filter (Texas Red) überprüft, um festzustellen, ob nicht fluoreszierende Personen vorhanden sind. Ohne Tetracyclin wird das RIDL-Gen exprimiert und wir erwarten 3-4% Überleben für Erwachsene8. Um dies zu überprüfen, wird für jede Freigabecharge ohne Tetracyclin ein zusätzliches Fach eingerichtet. Der einzige Unterschied zur normalen Aufzucht ist, dass die Nahrung ab Tag 6 um 2/3 reduziert wird, da die Anhäufung überschüssiger Nahrung durch tote Larven zu einem übermäßigen Bakterienwachstum führen kann.
Aufrüstung
Vier Schalen aus der Release-Generierung werden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um einzeln sortiert und gezählt zu werden. Die Anzahl der männlichen und weiblichen Welpen wird jeden Tag von jedem Tablett aufgezeichnet (Abbildung 4). Jede Abweichung von der erwarteten Anzahl von Männchen und Weibchen deutet auf ein potenzielles Problem hin, das die Produktion und/oder Fitness beeinträchtigen könnte und mit der Eikolonie verglichen werden kann, um die Ursache der Probleme zu bestimmen.
Pupae Messungen
Pupae Größe hat sich gezeigt, dass mit Erwachsenen Größe28korreliert werden. Als Qualitätskontrolle für die Größe erwachsener Personen wird die Cephalothoraxbreite von mindestens 30 männlichen Pupaen für jeden Sortiertag aus der Freisetzungsgeneration gemessen; für die Eierproduktionskolonie werden auch weibliche Pupae gemessen. Die durchschnittliche Cephalothoraxbreite betrug 1,05 mm (SEM 0,005) für freigesetzte Männchen und 1,04 mm (SEM = 0,006) und 1,29 mm (SEM = 0,006) für Männer und Weibchen bzw. Eierproduktion, Kolonie; ähnliche Ergebnisse wurden für Ae. albopictus Massenaufzucht24erzielt.
Abbildung 1. Stufen der Massenzucht von Mücken für den Einsatz in einem RIDL/SIT-Programm. Die Eierproduktionskolonie verfügt über ein hohes Maß an Qualitätskontrolle, um die Qualität der Eier zu gewährleisten, die der Freisetzungsgeneration geliefert werden. Eier werden in der Freisetzungskolonie zu Pupae aufgezogen, wo die Männchen von den Weibchen sortiert werden. Die männlichen Erwachsenen werden dann für das RIDL-Kontrollprogramm verwendet.
Abbildung 2. Schemat der Aufzuchtanlage für die Produktion von RIDL-Männchen für ein Freigabeprogramm. Hochwertige Eier werden kontinuierlich im Raum der Eierproduktionskolonie produziert und dann im Release Generation Raum bis zu Pupae aufgezogen. Die Larven und Pupae werden dann getrennt und die Pupae für Männer geschlechtssortiert. Die Männchen werden dann in Release-Geräte gelegt und erlaubt, zu Erwachsenen für die Freigabe in der Erwachsenen Lagerung und Freigabe Raum reifen.
Abbildung 3. Trennung von Larven, männlichen Pupas und weiblichen Welpen mit einem Plattenabscheider26. Der Plattenabscheider verwendet den Größenunterschied zwischen Larven, männlichen Pupas und weiblichen Welpen, um diese drei verschiedenen Lebensphasen zu sortieren; Larven sind in der Regel kleiner als männliche Pupae, die wiederum kleiner sind als weibliche Pupae. Das Instrument besteht aus zwei Glasplatten; eine ist an einem schrägen Metallrahmen befestigt und die andere sitzt auf der Oberseite der ersten Platte und kann relativ zur ersten mit vier Verstellschrauben (A) bewegt werden. Die vier Verstellschrauben ermöglichen es, die Außenplatte in einem Winkel zur Hinterplatte einzustellen, so dass ein keilförmiger Raum zwischen den Platten gebildet wird, der sich nach unten verjüngt. Larven und Pupae werden zwischen die Glasplatten gegossen (B) und sanft mit einem Wasserschlauch gewaschen (C). Durch die Einstellung des Winkels der Platte können Larven, männliche Pupae und weibliche Pupae getrennt werden (D). Mit kontinuierlicher Spülung und Erhöhung des Plattenwinkels können die Larven zuerst (in ein Sieb) gespült werden, gefolgt von den männlichen Pupas und schließlich den weiblichen Pupas.
Abbildung 4. Pupationskurven für massenaufgezogene RIDL Ae. aegypti. Diese Grafik zeigt den durchschnittlichen prozentualen Anteil der Verpupation für massenaufzuchte RIDL-Männer und weibliche Pupas während der Beobachtung von 23 Wochen mit 135.000 US-Prozent Pro Woche. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts, n = 23. Bei der ersten Sammlung (Tag 8) haben wir durchschnittlich 59% männliche und 30% weibliche Welpen von der gesamten Pupae, die von Tabletts über 5 Tage geborgen wurde, zurückgewonnen.
Abbildung 5. Durchschnittliche weibliche Kontamination von sortierten männlichen Pupaen. Diese Grafik zeigt den monatlichen durchschnittlichen prozentualen Prozentsatz der weiblichen Kontamination während der männlichen Sortierung am 8. Tag nach dem Schlüpfen über einen Zeitraum von sechs Monaten.
Abbildung 6. Aluminium-Platte BlutzuführungSystem. Die Platte (B) wird mit Parafilm (A) bedeckt und Blut in eine Tasche geführt und dann versiegelt (D). Die Platte wird auf einen Käfig gelegt und erhitzt, indem sie einen erwärmten Bohnensack (C) oben (E )platziert.
Abbildung 7. Unterscheidung männlicher und weiblicher Ae. aegypti pupae. Ae. aegypti pupae kann zuverlässig durch die Unterschiede in der Genitallappenform (am Ende der pupalbauchischen Segmente direkt unter den Paddeln) sexiert werden. Darüber hinaus sind Männchen auch kleiner als Weibchen.
Tabelle 1. Allgemeines Fütterungsregime für Ae. aegypti RIDL Larven (mg Nahrung pro Larve pro Tag). Um die tatsächliche Menge der benötigten Nahrung zu berechnen, multiplizieren Sie mit der Gesamtzahl der Larven pro Tablett.
RIDL ist eine effektive und umweltverträgliche Methode zur Bekämpfung von Mücken3,29-31. Die Technik ist auf ein integriertes Schädlingsbekämpfungsprogramm anwendbar und die meisten aktuellen Kontrollmethoden, einschließlich Larviziden, Reduzierung von Brutgebieten und Adultizide, sind mit dieser Technologie kompatibel. Diese Methode beschreibt, wie man bis zu 570.000 RIDL männliche Pupae pro Woche für den Einsatz bei der Kontrolle von Ae produziert. Aegypti und unseres Wissens ist dies die erste Beschreibung der Produktion von transgenen Mücken in diesem Ausmaß. Einige vergleichbare Produktionssysteme wurden für Wildtyp Ae. aegypti in den 1960er und 70er Jahren25entwickelt, aber seither gab es keine vergleichbare Produktion in diesem Maßstab. In Brasilien wurden von Februar 2011 bis Februar 2012 rund 11 Millionen Männer freigelassen. Die Anzahl der Männchen, die für die Kontrolle eines bestimmten Gebiets erforderlich sind, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter die Größe der wildlebenden Population, die Verbreitung von freigesetzten Männchen, das Überleben und die Paarungswettbewerbsfähigkeit von Männchen nach der Freisetzung und Umweltbedingungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass RIDL eine Population von Mücken um mindestens 80% reduzieren kann9.
Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Optimierung der Massenaufzucht für produktionskalierung und der Kosten- und Qualität der Männer erforderlich. Beispielsweise kann die Erhöhung der Larvendichte die Produktionskapazität erhöhen, indem der Platzbedarf, die Zeit bis zur Verpupperung32reduziert wird. Eine zu hohe Larvendichte kann jedoch zu kleineren und kürzeren Männchen mit reduzierter Paarungskapazitätvon 32,33führen. Die Qualität der Männchen in Bezug auf ein SIT-Programm wird letztlich durch die Fähigkeit der freigelassenen Männchen beurteilt werden, sich mit Weibchen im Feld zu paaren. Eine umfassende Feldbewertung ist erforderlich, um die Wettbewerbsfähigkeit der Paarung im Vergleich zu wilden Gegenstücken zu bewerten9,10. Dies macht es oft unpraktisch, genau zu beurteilen, welche Faktoren eine "hochwertige" männliche Mücke machen. Die Aufrechterhaltung einer gleichbleibenden Produktion und Qualität (soweit dies routinemäßig evaluiert werden kann) in der großangelegten Massenaufzucht ist jedoch von größter Bedeutung. Dies erfordert ein hohes Maß an Wachsamkeit und Standardisierung aller Prozesse mit kleinen Schwankungen, die möglicherweise erhebliche Auswirkungen haben. Die Aliquotierung von L1-Larven ist ein kritischer Schritt und veranschaulicht diesen Punkt. Die richtige Anzahl von Larven in Schalen zu zitieren, ist für eine gute Produktion unerlässlich. Die Fütterungsregelung ist genau auf die spezifische Anzahl von Larven zugeschnitten. Zu wenige/viele Larven führen zu einer Über-/Unterfütterung, was das Überleben der Larven, die Größe der Pupae und die Zeit bis zur Verpupation beeinflusst. Wenn es ein Geheimnis der Kunst der Massenaufzucht ist es, sicherzustellen, dass die vielen kleinen Schritte im Produktionszyklus konsequent, präzise und mit einem hohen Maß an Qualitätskontrolle durchgeführt werden, wie in diesem Papier beschrieben.
Autoren, die Mit Oxitec verbunden sind, haben eine Anstellung und/oder Beteiligung an Oxitec Ltd. Oxitec Ltd und Oxford University halten geistiges Eigentum im Zusammenhang mit dem Thema dieses Papiers.
Wir danken Biofébrica Moscamed Brasil, Fundaéo de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnologia (CNPq) für die finanzielle Unterstützung. Wir möchten auch den folgenden Personen für ihre Unterstützung danken; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valena.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vipan Premium | Sera GmbH | 190 | http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
Tetracycline | Sigma Aldrich | T7660 | |
Plate separator | J.W. Hock | 5412 | http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
Parafilm M | Pechiney Plastic packing | PM-996 | |
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) | Pleion | 0757 | |
Fluorescent scope | Leica Microsystems | MZ FLIII | http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
Adult cages | BugDorm | DP1000 | http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
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