Production en masse d’Aedes aegypti génétiquement modifié pour les disséminations sur le terrain au Brésil

Pour parvenir à la suppression de la population d’Aedes aegypti à l’aide du système RIDL^® (Libération d’insectes porteurs d’une létalité dominante), un grand nombre de moustiques mâles doivent être relâchés. Cela nécessite l’utilisation de techniques et de technologies d’élevage en masse pour fournir des systèmes fiables permettant d’obtenir le maximum de moustiques mâles de haute qualité.

De nouvelles techniques et méthodes sont recherchées pour tenter de gagner la bataille contre les moustiques. Les progrès récents des techniques moléculaires ont conduit au développement de méthodes nouvelles et innovantes de lutte contre les moustiques basées sur la technique des insectes stériles (SIT)^1-3. Une méthode de contrôle connue sous le nom de RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)⁴, est basée sur SIT, mais utilise des méthodes génétiques pour éliminer le besoin de stérilisation par rayonnement^5-8. Une souche RIDL d’Ae. aegypti a été testée avec succès sur le terrain à Grand Cayman^9,10; d’autres utilisations sur le terrain sont prévues ou en cours dans d’autres pays du monde.

L’élevage massif d’insectes a été établi chez plusieurs espèces d’insectes et à des niveaux de milliards par semaine. Cependant, chez les moustiques, l’élevage a généralement été effectué à une échelle beaucoup plus petite, la plupart des élevages à grande échelle ayant été effectués dans les années 1970 et 80. Pour un programme RIDL, il est souhaitable de libérer le moins de femelles possible car elles mordent et transmettent la maladie. Dans un programme d’élevage de masse, il y a plusieurs étapes pour produire les mâles à libérer: la production d’œufs, l’élevage des œufs jusqu’à la nymphose, puis le tri des mâles des femelles avant la libération. Ces mâles sont ensuite utilisés pour un programme de lutte ridl, relâchés sous forme de pupes ou d’adultes^11,12.

Pour supprimer une population de moustiques en utilisant RIDL un grand nombre d’adultes mâles de haute qualité doivent être élevés^13,14. Ce qui suit décrit les méthodes d’élevage en masse d’OX513A, une souche RIDL de Ae. aegypti ⁸, pour libération et couvre les techniques requises pour la production d’œufs et l’élevage en masse des mâles RIDL pour un programme de lutte.

Les moustiques transmettent de nombreux agents pathogènes qui peuvent causer une gamme de maladies chez l’homme et le contrôle de ces moustiques est une bataille continue depuis des siècles. Les stratégies de lutte contre les insectes fondées sur des méthodes chimiques et biologiques ont connu des succès notables, mais dans de nombreux cas, la lutte n’a pas été durable à long terme. Par exemple, le Brésil a réussi à éradiquer Ae. aegypti dans les années 50, mais le moustique a réintrodonné au cours des 40 à 50 dernières années. Cela peut être attribué à de nombreuses causes, y compris la résistance aux insecticides, les dommages environnementaux, la mauvaise mise en œuvre du programme de contrôle^15-20et la réinvasion rapide sans surveillance ou réponse adéquate.

De nouvelles techniques et méthodes sont recherchées pour tenter de gagner cette bataille contre les moustiques.  Les progrès récents des techniques moléculaires ont conduit au développement de méthodes nouvelles et innovantes de lutte contre les moustiques basées sur la technique des insectes stériles (SIT)^1-3. Une méthode de contrôle connue sous le nom de RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)⁴ est basée sur le SIT, mais utilise des méthodes génétiques pour éliminer le besoin de stérilisation par radiation. Des souches RIDL ont été construites pour plusieurs espèces nuisibles, y compris Ae. aegypti ^5-8, une souche RIDL d’Ae. aegypti a été testée avec succès sur le terrain à Grand Cayman^9,10; d’autres utilisations sur le terrain sont prévues ou en cours dans d’autres pays du monde.  La suppression des populations de moustiques à l’aide des RIDL nécessitera l’élevage d’un grand nombre d’adultes mâles de haute qualité^3,14.

Dans le cas d’un programme de SIT, il est jugé souhaitable de ne libérer que les hommes; les moustiques femelles piquent et transmettent la maladie. De plus, les mâles stériles relâchés peuvent être « distraits » par les femelles relâchées, ce qui réduit l’efficacité du programme. La libération masculine seulement s’est avérée 3 à 5 fois plus efficace que la libération mixte dans des expériences sur le terrain avec des mouches des fruits méditerranéennes irradiées²¹.

Dans un programme d’élevage de masse RIDL, il y a plusieurs étapes pour produire les mâles pour la libération.  La première consiste à produire les œufs nécessaires à la génération de libération (figure 1). L’étape suivante consiste à élever les œufs jusqu’aux pupes ou aux adultes, en séparant les larves des pupes et les pupes mâles des pupes femelles. La séparation à grande échelle des mâles des femelles nécessite une différence entre les sexes à un stade particulier de la vie adapté au tri de masse²². Chez Ae. aegypti (et d’autres espèces de moustiques), il existe une différence de taille significative entre les pupes mâles et femelles qui peut être exploitée pour des techniques de séparation des sexes. Les mâles RIDL triés sont ensuite relâchés dans un programme de contrôle sous forme de pupes ou d’adultes^11,12.

Ce qui suit décrit les méthodes d’élevage en masse d’OX513A, une souche RIDL de Ae. Aegypti, pour libération. Les méthodes décrites couvrent les techniques requises pour la production d’œufs et de mâles RIDL pour un programme de contrôle.

Exigences insecticides

1. Vue d’ensemble

1. L’élevage en masse comporte plusieurs phases, dont chacune est effectuée dans une zone distincte de l’unité d’élevage en masse. La figure 1 montre la phase principale de l’élevage et l’endroit où ils se produisent dans l’installation d’élevage de masse.

2. Considérations relatives à la biosécurité pour l’insectaire

1. Le projet a été approuvé par le comité d’éthique animale de l’Université de São Paulo - Brésil et tous les permis et approbations nécessaires ont été obtenus.
2. Le système RIDL utilise la létalité conditionnelle; un complément alimentaire (tétracycline) empêche l’expression du système RIDL permettant aux insectes d’être élevés en masse; sans tétracycline, les moustiques meurent. La tétracycline ne se trouve pas dans les sites de reproduction d’Ae. aegypti à l’état sauvage, de sorte que toute progéniture produite par des évadés ne survivra pas.  Cela ajoute un niveau de sécurité supplémentaire par rapport à l’utilisation d’insectes de type sauvage (WT) stérilisés par d’autres méthodes(c.-à-d. rayonnement).
3. Utilisez l’entrée à double porte, les panneaux « Personnel autorisé seulement » et les moustiquaires dans l’insectaire. Toutes les fenêtres doivent être scellées pour éviter la contamination de la colonie par des insectes WT et aider à prévenir les évasions de l’intérieur de l’insectaire.
4. Les réglementations et autorités locales peuvent avoir des exigences supplémentaires ou alternatives spécifiques. Contacter les autorités compétentes pour obtenir des informations / conseils à un stade précoce, et obtenir tous les permis et approbations nécessaires avant d’établir la souche RIDL dans un insectaire.
5. L’insectaire d’élevage de masse ne doit être utilisé que pour l’élevage ridl. Aucune autre souche ou insecte ne devrait être présent. Il s’agit d’éviter la contamination de la souche RIDL et la contamination par des agents pathogènes qui peuvent affecter la condition physique et la survie, réduisant ainsi la productivité et l’efficacité des mâles relâchés.

3. Conception insectaire

1. La figure 2 montre un plan de l’insectaire utilisé à Biofábrica Moscamed au Brésil.
2. La température de toutes les pièces était de 26 °C ± 2) avec une humidité relative d’environ 70 à 80 % et un cycle lumière-obscurité de 12 h 12 à l’aide de bandes lumineuses fluorescentes.
3. Ce plan peut être modifié en fonction des besoins d’espace spécifiques, par exemple l’échelle de la version déterminera la taille globale. Cependant, la production, l’élevage et le tri des œufs, le contrôle de la qualité (CQ) et les rejets devraient être séparés en quatre zones distinctes : colonie de production d’œufs, génération de rejets, QC et entreposage des adultes en vue de leur remise à l’eau.
4. La salle de la colonie de production d’œufs (environ 20 m²⁾est utilisée pour produire des œufs pour la génération de libération.
5. La zone de contrôle de la qualité est l’endroit où des expériences sont menées pour vérifier les procédures et l’aptitude de la lignée RIDL, y compris les mesures du taux d’éclosion, du nombre de pupes, de la taille des chrysalides et de la mesure de l’efficacité du tri et de l’élimination des femelles. Des tests sont également effectués pour la contamination wt en vérifiant la présence de marqueur de fluorescence et de phénotype à l’aide d’essais de décalage mesurant la létalité.
6. La salle de génération de libération (environ 36 m²⁾nécessite un espace suffisant pour les plateaux et le tri des larves et des pupes. Les plateaux sont maintenus dans des racks en aluminium spécialement conçus. Une grande aire de travail et un évier sont nécessaires pour l’élevage et le tri et un autre grand évier est nécessaire pour le lavage des plateaux et des cages. Un piège à filtre a été inclus dans la sortie des eaux usées des éviers pour atténuer la fuite des moustiques vivants par les égouts.
7. Toute l’eau utilisée pour les plateaux est éliminée dans un drain, qui a un compartiment contenant un maillage qui empêche la fuite des insectes à n’importe quel stade de développement.
8. Une zone est requise pour l’entreposage des adultes en vue de leur libération (entreposage pour adultes en vue de leur mise en liberté, figure 2)contenant des rayonnages pour maintenir les dispositifs de libération pendant que les adultes mûrissent avant la mise en liberté.

Méthodes de production pour l’élevage en masse RIDL:

La colonie de production d’œufs produit les œufs qui sont utilisés dans la génération de libération (figure 1) pour produire des adultes. Il existe de nombreuses similitudes entre les deux méthodes d’élevage, mais aussi des différences distinctes. Les processus d’élevage qui sont les mêmes pour les deux procédures sont décrits dans la section Colonie de production d’œufs seulement.

Colonie de production d’œufs

4. Production larvaire

La colonie de production d’œufs génère des œufs homozygotes OX513A RIDL⁸ pour la génération de libération. Un contrôle de haute qualité assure la viabilité, la forme physique et l’intégrité des souches des œufs fournis.

1. Le stimulus pour l’éclosion est la submersion dans l’eau avec un faible niveau d’oxygène dissous. Pour réduire le niveau d’oxygène dans l’eau, chauffez l’eau jusqu’à ébullition et placez immédiatement 400 ml dans des bocaux en verre de 500 ml (circonférence d’ouverture de 74 mm), fixez le couvercle solidement et laissez à température ambiante pendant plusieurs heures pour refroidir.
2. Mettez 1 g d’œufs dans un pot d’eau bouillie, refermez et attendez une heure. Transférer le contenu sur un plateau avec 2 L d’eau et laisser passer la nuit dans des conditions insecticides.
3. Placer les larves écloses dans un volume d’eau connu et remuer à l’aide d’un agitateur magnétique et d’une puce pendant suffisamment de temps pour prendre les aliquotes; l’agitation vigoureuse ou prolongée endommage les larves et doit être réduite au minimum. Le volume standard utilisé pour faire éclore les larves est de 1 L, mais des densités de plus de 300 larves/ml sont difficiles à compter et peuvent être dommageables. Par conséquent, n’éclosez pas plus d’environ 300 000 œufs/L d’eau.
4. Déterminez le taux d’éclosion en prenant trois aliquotes de 1 ml et en plaçant sur une feuille de papier absorbant, avec une grille de carrés de 1 cm, sur une éponge absorbante pour absorber tout excès d’eau.  Comptez le nombre d’œufs éclos et non éclos de trois carrés en recherchant le chapeau manquant d’un œuf éclos. Un taux d’éclosion autour de 80-90% est attendu.
5. Prendre quatre aliquotes de 1 ml chacune et les placer dans quatre bateaux de pesée noirs (les larves sont blanches et donc plus facilement visibles sur fond noir) et compter le nombre de larves vivantes présentes à l’œil nu; l’utilisation d’un compteur est recommandée. Le nombre moyen de larves par ml est ensuite utilisé pour calculer le volume d’eau à ajouter sur chaque plateau pour obtenir le nombre souhaité de larves par plateau.
6. Il peut y avoir de grandes différences dans la densité à laquelle les larves peuvent être élevées entre les souches et les espèces. Il est également souhaitable de comparer la taille des mâles adultes ridl aux mâles de type sauvage; idéalement, vous voulez similaire aux mâles RIDL de plus grande taille qui peuvent rivaliser avec succès avec les mâles sauvages. Par conséquent, pour chaque souche RIDL, la densité idéale des larves doit être déterminée et constitue un compromis avec les contraintes d’espace pour l’élevage et l’échelle de production. Des densités allant de 0,1 à 2,5 larves/ml nous avons trouvées être une bonne combinaison de production et de qualité; également discuté par Médicis²³.
7. Ajouter les larves aux plateaux. Dans notre installation, nous utilisons des plateaux mesurant environ 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x L x H) et la quantité d’eau requise pour atteindre la densité des larves pour la production.
8. Ajouter une solution mère de tétracycline (3 mg/ml dans l’eau) aux plateaux à une dilution de 1:100 pour obtenir la concentration finale requise de 30 μg/ml.
9. Nourrissez les larves avec de la nourriture de poisson en flocons( www.sera.de) tous les jours, qui a été broyée en une poudre fine. Le tableau 1 montre le régime alimentaire typique en mg de nourriture par larve et par jour. Nourrir les larves jusqu’au jour approprié de tri dans les conditions insecticides décrites ci-dessus.

5. Tri des larves des pupes et des pupes mâles/femelles

1. Trier les larves des pupes 8 jours après l’éclosion en séparant les larves des pupes. Ensuite, triez les pupes pour les mâles. Un dispositif connu sous le nom de séparateur de plaques^24,25 peut trier les larves des pupes mâles et des pupes femelles. La figure 3 illustre l’utilisation de ce séparateur de plaques pour séparer les larves des pupes mâles et femelles.
2. À l’aide d’une cuillère à mesurer avec un maillage sur le fond, étalonnez-la avec 500 pupes ou plus et utilisez-la pour installer des cages et estimer la quantité totale de pupes mâles et femelles produites.
3. Le premier jour du tri (jour 8), la plupart des pupes sont des mâles, alors replacez les larves triées dans un plateau et remontez jusqu’au lendemain, lorsque la plupart des pupes sont des femelles(figure 4).
4. Répétez le processus de tri chaque jour tel que décrit aux étapes 2.1 à 2.3 jusqu’à ce que toutes les larves se nymphosent ou jusqu’à la fin d’une semaine de travail.
5. Placez 1 000 pupes mâles (à l’aide de la cuillère à mesurer) dans une cage et le jour 9, ajoutez 3 000 pupes femelles à la même cage (nous utilisons des tuyaux en PVC de 30 cm de haut et de 30 cm de diamètre adaptés avec un dessus en maille et un trou d’accès en filet, mais des cages en plastique de 30 cm x 30 cm x 30 cm sont également disponibles chez BugDorm).
6. Laisser les adultes s’accoupler pendant au moins 2 jours et leur fournir une solution de saccharose (10%) sur le coton humide ad libitum avant l’alimentation par le sang. Recueillir des œufs pendant deux semaines (~ deux cycles gonotrophes) avec deux aliments sanguins par semaine. Cela donne en moyenne 143 000 œufs provenant d’une cage de 3 000 femelles (soit une moyenne de 48 œufs par femelle). Pour la production de 4 millions d’œufs par semaine, environ 28 cages doivent être installées chaque semaine.

6. Alimentation par le sang

1. Un système d’alimentation en plaques d’aluminium fournit du sang aux cages deux fois par semaine. Une poche de sang est créée sur le côté d’une plaque d’aluminium (10 cm x 10 cm x 3 mm) avec parafilm(Figure 5). Pour encourager l’alimentation, le sang est réchauffé en plaçant un sac de haricots chauffé sur le dessus de la mangeoire à assiettes. Le sac de haricots se composait d’environ 250 g de grains de blé dans un sac en tissu, qui est chauffé pendant environ 10 secondes dans un micro-ondes. Le sang que nous utilisons pour l’alimentation provient d’un abattoir local; comme ces animaux (principalement les chèvres et les moutons) sont destinés à la consommation humaine, ils sont testés pour éviter la présence d’agents pathogènes.
2. Trois jours après l’alimentation par le sang, un site de ponte permettant aux femelles de pondre leurs œufs est fourni. Le site de ponte est un récipient en plastique rond rempli à environ 1/4 d’eau et de papier filtre recouvrant l’intérieur. Deux jours plus tard, le site de ponte est retiré. Pour une production maximale d’œufs, assurez-vous que le papier filtre couvre toute la surface disponible à l’intérieur du récipient et reste humide.
3. Retirer le papier d’œuf et le placer sur du papier absorbant pour sécher dans des conditions insecticides; les œufs nécessitent une période de conditionnement à une humidité élevée (plus de 70%) d’au moins 48 heures après avoir été posé. Les œufs peuvent être laissés dans l’insectaire jusqu’à 3 mois avec une diminution minimale du taux d’éclosion, tant que l’humidité est maintenue élevée^{à 25}.
4. La colonie de production d’œufs doit être d’une taille suffisante pour fournir le nombre d’œufs requis sur une base hebdomadaire pour le programme de mise en liberté. L’installation décrite ci-dessus peut produire environ 4 millions d’œufs avec 28 cages installées chaque semaine. Il est recommandé de conserver suffisamment d’œufs stockés pour garantir au moins 4 semaines d’œufs pour la génération de libération et la colonie de production d’œufs.

Génération de versions

7. Production larvaire

Les processus d’éclosion, d’élevage et de tri pour la génération de libération sont identiques à la méthode décrite précédemment pour la colonie de production d’œufs. Cependant, l’échelle de production est beaucoup plus grande et cela nécessite plus de plateaux et plus d’efforts.

8. Tri des larves, des pupes mâles et des pupes femelles

1. Le tri des larves, des pupes mâles et des pupes femelles est identique à la méthode décrite pour la production d’œufs.
2. Après avoir trié les pupes mâles, il est important de vérifier la contamination des femelles avant la libération; il ne devrait pas y avoir plus de 1% de femmes présentes. Prenez trois aliquotes de 500 pupes (trois pupes aléatoires mesurant des cuillères) et comptez le nombre de pupes femelles présentes. Les femelles peuvent être identifiées car elles sont généralement plus grandes que les mâles et à partir de différences dans la forme du lobe génital (Figure 6)²⁷. S’il y a plus de 1% de femmes, elles doivent être recouruées et vérifiées à nouveau.
3. N’utilisez que les mâles des jours 8 et 9 pour la libération; autoclaver toutes les larves et pupes restantes. Au Brésil, ces déchets doivent être traités de la même manière que les déchets médicaux, mais les réglementations peuvent différer d’un pays à l’autre. N’utilisez pas de pupes et de larves femelles de la génération de mise à l’eau pour la colonie de production d’œufs en raison des différences dans le contrôle de la qualité, les risques d’élevage et de contamination provenant d’un plus grand nombre et d’un contrôle de qualité inférieur.

Entreposage des adultes en cas de libération : Placer les mâles dans des dispositifs de libération pour qu’ils émergent et mûrissent avant la libération. Les détails des dispositifs de libération ne sont pas couverts dans cette méthode. Cependant, la capacité des dispositifs de libération que nous utilisons est d’environ 1 000 hommes. Les détails de la méthode de libération (dispositif de libération et système de libération) ne sont pas couverts dans cette méthode.

Les résultats attendus de la nymphose pour la production sont présentés à la figure 4. Les mâles se nymphosent en premier, atteignant un sommet le jour 8 et les femelles culminent le jour 9 après l’éclosion. Il est important de mesurer cette courbe de nymphose pour connaître le meilleur moment pour trier les mâles des femelles.

Les résultats de plus de 6 mois de tri des pupes mâles et femelles montrent que la contamination femelle est en moyenne de 0,02% (Figure 5; SEM = 0,004 %). Ce taux de contamination ne représente que 400 femelles relâchées au cours d’un mois de remise à l’eau (environ deux millions d’hommes). La production actuelle d’œufs par semaine est de 4 millions. De ce nombre, 3,5 millions sont éclos pour la colonie d’œufs et la production, le reste étant stocké pour être sauvegardé. Environ 11 % des œufs sont utilisés pour la colonie de production d’œufs et le reste pour la production de la mise à l’eau. Le taux d’éclosion des œufs est en moyenne de 87,3 % (MEB = 0,5 %) et le rendement des pupes mâles des larves L1 est en moyenne de 29,5 % (MEB = 1,2). Deux millions de larves sont élevées chaque semaine pour la colonie de la génération de libération produisant environ 571 000 pupes mâles (SEM = 14 000). La mortalité des pupes et des adultes pendant l’émergence et la remise à l’eau est en moyenne de 5 %, ce qui donne la libération d’environ 543 000 (SEM = 13 000) moustiques mâles adultes par semaine. On s’attend à ce que la production actuelle de 4 millions d’œufs par semaine soit réduite à environ 3 millions par semaine avec une optimisation supplémentaire pour réduire les pertes dues au gaspillage et au stockage. Au total, 6 personnes sont nécessaires pour la production décrite; quatre travaillent sur la génération de libération et les deux autres sur la colonie d’œufs.

contrôle qualité

Le contrôle de la qualité est essentiel pour maintenir la qualité des adultes, l’efficacité de l’élevage, la main-d’œuvre et les coûts.

Contrôle du phénotype transgène

Afin de vérifier l’expression du gène RIDL deux contrôles sont réalisés, d’une part pour vérifier l’expression du marqueur de fluorescence et d’autre part pour vérifier l’expression du trait de létalité RIDL en l’absence de tétracycline. Toutes les larves doivent exprimer le marqueur fluorescent. Pour vérifier si le marqueur fluorescent est exprimé comme prévu, 2 000 larves du premier stade sont vérifiées sous un stéréomicroscope Leica MZFLIII avec filtre DsRed2 (Texas Red) afin de déterminer si des individus non fluorescents sont présents. Sans tétracycline, le gène RIDL est exprimé et nous nous attendons à une survie de 3 à 4% chez les adultes⁸. Pour vérifier cela, un plateau supplémentaire est mis en place pour chaque lot de libération sans tétracycline. La seule différence avec l’élevage normal est que la nourriture est réduite de 2/3 à partir du jour 6 parce que l’accumulation de nourriture excédentaire due aux larves mortes peut entraîner une croissance bactérienne excessive.

Contrôle d’élevage

Quatre plateaux de la génération de version sont choisis au hasard pour être triés et comptés séparément. Le nombre de pupes mâles et femelles est enregistré chaque jour à partir de chaque plateau (Figure 4). Tout écart par rapport au nombre prévu de mâles et de femelles indique un problème potentiel qui pourrait affecter la production et/ou la condition physique et peut être comparé à la colonie d’œufs pour aider à déterminer la source des problèmes.

Mesures des pupes

Il a été démontré que la taille des pupes est corrélée avec la taille adulte²⁸. En tant que contrôle de la qualité de la taille des adultes, la largeur du céphalothorax est mesurée d’au moins 30 pupes mâles pour chaque jour de tri à partir de la génération de libération; pour la colonie de production d’œufs, les pupes femelles sont également mesurées. La largeur moyenne du céphalothorax était de 1,05 mm (MEB 0,005) pour les mâles relâchés et de 1,04 mm (MEB = 0,006) et de 1,29 mm (MEB = 0,006) pour les mâles et les femelles respectivement production d’œufs, colonie; des résultats similaires ont été obtenus pour l’élevage de masse d’Ae. albopictus ^24.

Figure 1. Étapes de l’élevage massif de moustiques pour une utilisation dans un programme RIDL/SIT. La colonie de production d’œufs a un niveau élevé de contrôle de la qualité pour assurer la qualité des œufs fournis à la génération de libération.  Les œufs sont élevés jusqu’aux pupes dans la colonie de libération, où les mâles sont triés à partir des femelles.  Les adultes mâles sont ensuite utilisés pour le programme de contrôle RIDL.

Figure 2. Schéma de l’installation d’élevage pour la production de mâles RIDL pour un programme de libération. Des œufs de haute qualité sont continuellement produits dans la salle de la colonie de production d’œufs et sont ensuite élevés jusqu’aux pupes dans la salle de la génération de libération. Les larves et les pupes sont ensuite séparées et les pupes triées selon le sexe pour les mâles. Les mâles sont ensuite placés dans des dispositifs de libération et laissés à maturité aux adultes pour être libérés dans l’entrepôt et la salle de libération des adultes. 

Figure 3. Séparation des larves, des pupes mâles et des pupes femelles à l’aide d’un séparateur de plaques²⁶.  Le séparateur de plaques utilise la différence de taille entre les larves, les pupes mâles et les pupes femelles pour trier ces trois stades de vie différents; les larves ont tendance à être plus petites que les pupes mâles qui sont à leur tour plus petites que les pupes femelles.  L’instrument comprend deux plaques de verre; l’un est fixé à un cadre métallique incliné et l’autre se trouve sur le dessus de la première plaque et peut être déplacé par rapport à la première à l’aide de quatre vis de réglage(A).  Les quatre vis de réglage permettent à la plaque extérieure d’être réglée à un angle par rapport à la plaque arrière de sorte qu’un espace en forme de coin est formé entre les plaques, effilant vers le bas.  Les larves et les pupes sont versées entre les plaques de verre(B)et lavées doucement à l’aide d’un tuyau d’arrosage(C).  En ajustant l’angle de la plaque, les larves, les pupes mâles et les pupes femelles peuvent être séparées (D).  Avec un rinçage continu et l’augmentation de l’angle de la plaque, les larves peuvent être rincées en premier (dans un tamis), suivies des pupes mâles et enfin des pupes femelles. 

Figure 4. Courbes de nymphose pour ridl d’élevage en masse Ae. aegypti.  Ce graphique montre le pourcentage moyen de nymphose pour les pupes mâles et femelles RIDL élevées en masse au cours de l’observation de 23 semaines avec environ 135 000 pupes récupérées par semaine.  Barres d’erreur = erreur type de moyenne, n = 23. Lors de la première collecte (jour 8), nous avons récupéré en moyenne 59% de pupes mâles et 30% femelles à partir de pupes totales récupérées dans des plateaux pendant 5 jours. 

Figure 5. Contamination femelle moyenne des pupes mâles triées. Ce graphique montre le pourcentage moyen mensuel de contamination des femelles pendant le tri des mâles le jour 8 après l’éclosion sur une période de six mois. 

Figure 6. Système d’alimentation en sang à plaque d’aluminium. La plaque(B)est recouverte de parafilm(A)et de sang pipetée dans une poche, puis scellée(D). La plaque est placée sur une cage et chauffée en plaçant un sac de haricots chauffés(C)sur le dessus(E). 

Figure 7. Distinguer les pupes ae. aegypti mâles et femelles. Les pupes d’Ae. aegypti peuvent être sexées de manière fiable par les différences dans la forme du lobe génital (à l’extrémité des segments abdominaux nymphaux juste en dessous des pagaies). De plus, les mâles ont également tendance à être plus petits que les femelles.   

Tableau 1. Régime alimentaire général pour les larves de RIDL aegypti (mg de nourriture par larve par jour). Pour calculer la quantité réelle de nourriture requise, multipliez par le nombre total de larves par plateau.

Ridl est une méthode efficace et sans danger pour l’environnement de contrôle des moustiques^3,29-31. La technique est applicable à un programme de lutte antiparasitaire intégrée et la plupart des méthodes de lutte actuelles, y compris les larvicides, la réduction des sites de reproduction et les adulticides, sont compatibles avec cette technologie. Cette méthode décrit comment produire jusqu’à 570 000 pupes mâles RIDL par semaine pour une utilisation dans le contrôle de l’Ae. Aegypti et à notre connaissance c’est la première description de la production des moustiques transgéniques à cette échelle. Certains systèmes de production comparables ont été développés pour le type sauvage Ae. aegypti dans les années 1960 et 70s^25,mais il n’y a pas eu de production comparable à cette échelle depuis lors. Au Brésil, environ 11 millions d’hommes ont été libérés de février 2011 à février 2012. Le nombre de mâles requis pour qu’une zone donnée soit contrôlée dépend d’un certain nombre de facteurs, y compris la taille de la population sauvage, la dispersion des mâles relâchés, la survie et la compétitivité d’accouplement des mâles après leur remise à l’eau, ainsi que les conditions environnementales.  Des études antérieures ont montré que ridl peut réduire une population de moustiques d’au moins 80%⁹.

Un équilibre est nécessaire entre l’optimisation de l’élevage en masse pour l’échelle de production et le coût par rapport à la qualité des mâles. Par exemple, l’augmentation de la densité larvaire peut augmenter la capacité de production en réduisant l’espace requis, la main-d’œuvre et le temps nécessaire à la nymphose³². Cependant, des densités trop élevées de larves peuvent donner lieu à des mâles plus petits et plus courts avec une capacité d’accouplement réduite^{de 32,33}. La qualité des mâles par rapport à un programme de SIT sera finalement évaluée par la capacité des mâles libérés à s’accoupler avec les femelles sur le terrain. Une évaluation approfondie sur le terrain est nécessaire pour évaluer la compétitivité de l’accouplement par rapport à ses homologues sauvages^9,10. Cela rend souvent impossible d’évaluer exactement quels facteurs font un moustique mâle « de haute qualité ». Cependant, il est primordial de maintenir une production et une qualité constantes (dans la mesure où cela peut être évalué régulièrement) dans l’élevage de masse à grande échelle. Cela nécessite un niveau élevé de vigilance et de normalisation de tous les processus avec de petites fluctuations pouvant avoir un impact significatif. L’aliquote des larves de L1 est une étape critique et illustre ce point. Aliquoter le nombre correct de larves dans des plateaux est essentiel pour une production de bonne qualité. Le régime d’alimentation est précisément adapté à un nombre spécifique de larves. Trop peu ou trop de larves entraîneront une alimentation excessive ou inadéquate, ce qui influe sur la survie des larves, la taille des pupes et le temps nécessaire à la nymphose. S’il y a un secret à l’art de l’élevage en masse, c’est de s’assurer que les nombreuses petites étapes du cycle de production sont menées de manière cohérente, précise et avec un niveau élevé de contrôle de la qualité, comme décrit dans ce document.

Les auteurs affiliés à Oxitec ont un emploi et/ou une participation dans Oxitec Ltd. Oxitec Ltd et l’Université d’Oxford détiennent la propriété intellectuelle liée au sujet du présent document.

Nous tenons à remercier Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) pour leur soutien financier.  Nous tenons également à remercier les personnes suivantes pour leur aide; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.