アストロサイトの3Dバイオプリンティングは、神経組織工学の進歩を表し、神経疾患に関与するメカニズムを理解するのに有用なインビトロモデルのバイオファブリケーションを可能にする。3Dバイオプリンティングの主な利点は、組織の生化学的および機械的特徴を模倣する細胞補助構造をバイオファブリケートし、健康と疾患における細胞ダイナミクスをよりよく理解することです。このプロトコルは、天然ポリマーと細胞外マトリックス成分で構成されるバイオインクの3Dバイオプリンティングに基づいているため、他の軟組織のバイオファブリケーションに適用できます。
まず、安楽死させたマウスから分離した皮質組織を、湾曲したマイクロハサミで小片に切り取ります。上下にピペットを入れ、1ミリリットルのHBSSで組織片を3回洗います。3回目に添加したHBSSを取り除いた後、0.05%トリプシンの1ミリリットルを加え、37°Cで5分間組織をインキュベートします。
機械的組織解離の場合、トリプシン混合物を15回上下に静かにピペットします。次に、解離した混合物を15ミリリットルの円錐管に移し、同量のFBSを加えてトリプシン活性を中和する。0.4マイクロメートルの細胞ストレーナーフィルターを通して懸濁液をフィルターし、解約されていない断片を除去します。
フィルターを1ミリリットルのアストロサイト培地で洗います。遠心分離によって濾過された細胞懸濁液を下にペレット。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に懸濁させる。
細胞懸濁液をT25培養フラスコに移す。3.5ミリリットルの総培地量を構成し、37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終濃度でフィブリノーゲンを得るために、ゼラチンゼラチンメタクリロイル溶液に1ミリリットルフィブリノーゲン溶液あたり10ミリグラムの0.9ミリリットルを移す。
体積で0.5%重量の最終的な濃度で写真のイニシエーターを得るために、調製されたゼラチンゼラチンメタクリロイルフィブリノーゲン溶液に0.015グラムの写真のイニシエーターを加えます。ボルテックス後、溶液を40°Cに保ち、PIの劣化を防ぐために光から保護します。次に、0.2マイクロメートルのフィルターを通して溶液を無菌15ミリリットルの円錐管にフィルターします。
生体材料溶液980マイクロリットルを15ミリリットルの円錐チューブに移します。1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度でラミニンを得るために、バイオインクを含むチューブに希釈ラミニンを20マイクロリットル加えます。上下にピペットを入れて穏やかに混ぜ、泡を避け、細胞と混合する準備ができるまでバイオインク溶液を摂氏37度に保ちます。
0.05%トリプシンで1次アストロサイトを5分間トリプシンし、FPSでトリプシン活性を1対1の割合で中和する。その後、細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を200倍Gで5分間移動させる。細胞を数えた後、実演したように、6細胞に10回10回移して、異なる円錐形チューブと遠心分離機を作り出した。
上清の200マイクロリットルのみをチューブに残し、円錐管の底部を軽くタップして細胞ペレットを吊り下げます。1ミリリットル当たり6細胞に10倍の最終濃度を得るために、ゼラチンゼラチン・メタクリロイル・フィブリノゲン溶液を細胞を含むチューブに1ミリリットル移動し、上下に軽くピペッティングして均質化する。1000マイクロリットルピペットを使用して、ゼラチンゼラチンメタクリロイルヒビロイジェンバイオインク溶液に置かれたアストロサイトを5ミリリットルのプラスチックシリンジにゆっくりと移し、泡形成を避けます。
滅菌22ゲージの鈍い針を注射器に接続します。バイオプリンターを15分間UV光に当て、70%エタノールでバイオプリンターを拭き取り、シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動でフラッシュして残りの気泡を取り除きます。バイオプリンティングを行うために、バイオプリンターテーブルの上に35ミリメートルの培養皿に置き、針の動きを可能にするために培養皿表面から0.1ミリメートル離れた場所に針を置き、印刷ボタンを押します。
バイオプリンティングが終わったら、シリンジが皿から離れ、文化の皿を閉じてください。ゼラチンメタクリロイル架橋用UV光の下に培養皿を置きます。滅菌スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを24ウェルプレートに移します。
500マイクロリットルのトロンビン塩化カルシウム溶液を加え、30分間放置してフィブリン架橋を可能にします。架橋液を取り除いた後、2ミリリットルのPBSで構築物を洗浄し、次にPBSを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に置き換える。摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。
スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを35ミリメートル培養皿に移します。PBSの1ミリリットルで構造を洗います。100マイクロリットルの生きた死んだ試薬をコンストラクトの上に入れ、37°Cで30分間保ち、光から保護します。
生死んだ試薬を取り除いた後、実演したようにPBSで構造を洗浄する。サンプルを共焦点皿に移し、画像取得のために488および570ナノメートルの励起を使用して共焦点顕微鏡の下で構築物内の細胞を観察する。3Dバイオプリンティングの後、バイオプリント足場の完全性が推定され、生体材料内に閉じ込められた細胞で明確に定義された構造の形成が観察された。
バイオプリンティングと架橋プロセスの後、ほとんどの細胞は、構築物がアストロサイト培地でインキュベートされたときに丸い形態を提示した。バイオプリントされた足場は、7日間のインキュベーションの後に完全性を維持し、いくつかの丸い細胞が観察されたが、多くのアストロサイトが構造全体に広がり、天文学的形態および相互接続を提示した。細胞の生存率は、バイオプリンティング直後に評価され、結果的に、より低速で、生存可能な細胞は、全細胞の74%まで表され、より高速でバイオプリントされた細胞よりも有意に高いことを示した。
バイオプリントアストロサイトの生存率は2D培養アストロサイトに正規化され、その結果、7日目にバイオプリントアストロサイトが有意に生存率を増加させたことが示された。バイオプリンティングの直後、アストロサイトは丸い形態と生死んだアッセイを示した。1週間後、アストロサイトは構築物全体に広がり、2D培養と同一の細胞の明確な形態を提示した。
3Dバイオプリントアストロサイトは、免疫蛍光によって特徴付けられていた。バイオプリント構築物における7日間のインキュベーションの後、星状形態を有する非常に高密度のアストロサイトが観察された。バイオプリントアストロサイト細胞は、7日間のバイオプリンティング後の星状表現型の保持を示す特定のアストロサイトマーカーグリア線維酸性タンパク質を示し、これらの結果は、バイオインク組成物がアストロサイトの接着、広がりおよび成長を促進するために生体適合性微小環境を提供したことを示している。
バイオプリントアストロサイトによる特異的遺伝子および細胞マーカー発現の評価は、特定の刺激に続くアストロサイトル反応性などの神経組織様機能の証拠を提供するであろう。このプロトコルは、生体分子内の異なるタイプの細胞で構成されるより複雑な神経様構造のバイオファブリケーションへの道を開き、特定の神経原性ニッチの模倣を可能にする。
