Il bioprinting 3D degli astrociti rappresenta un progresso nell'ingegneria neuro tissutale, consentendo la biofabbricazione di modelli in vitro utili per comprendere i meccanismi coinvolti nelle malattie neurologiche. Il vantaggio principale del bioprinting 3D è quello di biofabbricare le strutture aggiuntive delle cellule che imitano le caratteristiche biochimiche e meccaniche dei tessuti, fornendo una migliore comprensione delle dinamiche cellulari in salute e malattia. Questo protocollo può essere applicato alla biofabbricazione di altri tessuti molli, in quanto si basa sulla bioprinting 3D di un bio-inchiostro composto da polimeri naturali e componenti della matrice extracellulare.
Per cominciare, tagliare il tessuto corticale isolato dal topo eutanasizzato in piccoli pezzi con una micro forbice curva. Lavare i pezzi di tessuto tre volte con un millilitro di HBSS pipettando su e giù. Dopo aver rimosso HBSS aggiunto per la terza volta, aggiungere un millilitro di 0,05% di tripsina e incubare il tessuto per cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Per la dissociazione meccanica del tessuto, pipettare delicatamente la miscela di tripsina tissutale su e giù 15 volte. Quindi, trasferire la miscela dissociata in un tubo conico da 15 millilitro e aggiungere un volume uguale di FBS per neutralizzare l'attività della tripsina. Filtrare la sospensione attraverso un filtro filtrante a celle da 0,4 micrometri per rimuovere i frammenti non dissociati.
Lavare il filtro con un millilitro di mezzo astrocitario. Pellet lungo la sospensione cellulare filtrata mediante centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, sospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura degli astrociti.
Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura T25. Costituisci un volume medio totale di 3,5 millilitri e incuba le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per ottenere il fibrinogeno alla concentrazione finale di tre milligrammi per millilitro, trasferire 0,9 millilitri di 10 milligrammi per millilitro soluzione di fibrinogeno alla soluzione di gelatina-gelatina metacrilolica.
Per ottenere il fotoi iniziatore alla concentrazione finale dello 0,5% peso in volume, aggiungere 0,015 grammi di fotoi iniziatore alla soluzione di gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno preparata. Dopo il vortice, mantenere la soluzione a 40 gradi Celsius, al riparo dalla luce per evitare la degradazione del PI. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri in un tubo conico sterile da 15 millilitro.
Trasferire 980 microlitri della soluzione di biomateriale in un tubo conico da 15 millilitri. Per ottenere la laminina alla concentrazione finale di due microgrammi per millilitro, aggiungere 20 microlitri di laminina diluita al tubo contenente bio-inchiostro. Mescolare delicatamente pipettando su e giù, evitando bolle e mantenere la soluzione di bio-inchiostro a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronta per essere miscelata con le cellule.
Tripsinizzare gli astrociti primari con lo 0,05% di tripsina per 5 minuti e neutralizzare l'attività della tripsina con FPS in un rapporto di uno a uno. Quindi, trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitro e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti. Dopo aver contato le cellule, trasferire 1 volte 10 alle 6 celle in un tubo conico e una centrifuga diversi come dimostrato.
Lasciare solo 200 microlitri del surnatante nel tubo e sospendere il pellet cellulare picchiettando delicatamente il fondo del tubo conico. Per ottenere una concentrazione finale di 1 volte 10 alle 6 cellule per millilitro, trasferire un millilitro di gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno soluzione al tubo contenente le cellule e omogeneizzare tubando delicatamente su e giù. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per trasferire lentamente gli astrociti deposti in gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno bio-inchiostro in una siringa di plastica da cinque millilitri, evitando la formazione di bolle.
Collegare un ago smussato sterile calibro 22 alla siringa. Esporre la bioprinter alla luce UV per 15 minuti, quindi pulire la bioprinter con etanolo al 70%, quindi collegare la siringa alla testina di stampa della bioprinter e lavare manualmente il bio-inchiostro per rimuovere le bolle rimanenti. Per eseguire la bioprinting, posizionare una parabola di coltura di 35 millimetri sul tavolo della bioprinter, posizionare l'ago a 0,1 millimetri di distanza dalla superficie del piatto di coltura per consentire il movimento dell'ago e premere il pulsante Stampa.
Una volta terminata la bioprinting, assicurarsi che la siringa si allontani dal piatto e si avvicini al piatto di coltura. Posizionare il piatto di coltura sotto la luce UV per la reticolazione della gelatina metacriloil. Utilizzare una spatola sterile per trasferire il costrutto biostampato su una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere 500 microlitri di soluzione di cloruro di calcio trombina e lasciare per 30 minuti per consentire la reticolazione della fibrina. Dopo aver rimosso la soluzione reticolante, lavare il costrutto con due millilitri di PBS, quindi sostituire il PBS con un millilitro di terreno di coltura degli astrociti. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e cambiare il mezzo ogni tre giorni.
Usa una spatola per trasferire il costrutto biostampato in un piatto di coltura da 35 millimetri. Lavare il costrutto con un millilitro di PBS. Depositare 100 microlitri del reagente morto vivo sul costrutto e tenerlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti, tenendolo al riparo dalla luce.
Dopo aver rimosso il reagente morto vivo, lavare il costrutto con PBS come dimostrato. Trasferire il campione su un piatto confocale e osservare le cellule all'interno del costrutto al microscopio confocale utilizzando l'eccitazione di 488 e 570 nanometri per l'acquisizione dell'immagine. Dopo il bioprinting 3D, è stata stimata l'integrità dello scaffold bioprinted ed è stata osservata la formazione di una struttura ben definita con cellule intrappolate all'interno del biomateriale.
Dopo i processi di bioprinting e cross-linking, la maggior parte delle cellule ha presentato una morfologia rotonda quando il costrutto è stato incubato con un mezzo astrocitario. Le impalcature biostampate hanno mantenuto l'integrità dopo sette giorni di incubazione e, sebbene siano state osservate alcune cellule rotonde, molti astrociti si sono diffusi in tutto il costrutto, presentando morfologia astrocitica e interconnessione. La vitalità cellulare è stata valutata subito dopo la bioprinting e i risultati hanno mostrato che alla velocità inferiore, le cellule vitali rappresentavano fino al 74% delle cellule totali, essendo significativamente più alte delle cellule biostampate a velocità più elevata.
La vitalità degli astrociti bioprinted è stata normalizzata in astrociti in coltura 2D e i risultati hanno indicato che il settimo giorno, gli astrociti bioprinted avevano aumentato significativamente la vitalità. Subito dopo la bioprinting, gli astrociti hanno mostrato una morfologia rotonda e un test di morti vivi. Dopo una settimana, gli astrociti si diffusero in tutto il costrutto e presentarono una morfologia distinta di cellule, identica alla coltura 2D.
Gli astrociti bioprinted 3D erano caratterizzati da immunofluorescenza. Dopo sette giorni di incubazione nel costrutto bioprinted, sono stati osservati astrociti altamente densi con una morfologia simile a una stella. Le cellule astrocitarie biostampate espresse lo specifico marcatore di astrociti la proteina acida fibrillare gliale indica il mantenimento del fenotipo astrocitico dopo sette giorni di bioprinting, e questi risultati indicano che la composizione del bio-inchiostro ha fornito un microambiente biocompatibile per promuovere l'adesione, la diffusione e la crescita degli astrociti.
La valutazione di specifici geni e marcatori cellulari espressione da parte degli astrociti bioprinted fornirebbe evidenza della funzione neuro-tessuto-simile, come la reattività astrocitaria a seguito di stimoli specifici. Questo protocollo apre la strada alla biofabbricazione di strutture neuro-simili più complesse composte da diversi tipi di cellule in biomolecole, consentendo l'imitazione di specifiche nicchie neurogeniche.
