多糖は、タンパク質にリンクしていない限り免疫原性が悪く、タンパク質への誘導体化または共役のために活性化する必要があります。この方法では、CDAPが砂の装持ち試薬として使用される。CDAPは、多糖ヒドロキシルを活性化し、誘導体化のために、またはワクチンや診断試薬に使用するためにタンパク質にリンクされます。
CDAPは、多糖砂装用試薬として臭化シアンを大部分置き換えました。CDAPは使用が簡単で、より効率的で、臭化シアノーゲンよりも低いpHで使用することができます。それは試薬を活性化するはるかに良いです。
CDAPは、還元的アミノ化とは異なり、ほとんどの多糖類と一緒に使用することができ、これはビジナルヒドロキシルを必要とする。この化学は、タンパク質に直接および間接的に結合するために使用することができ、診断試薬を作るために使用することができます。CDAP活性化反応は、当初述べたように、非常に迅速かつ制御が困難であった。
ここで提供されるプロトコルは、化学をはるかに実行しやすく、はるかに再現可能になります。実験を開始する前に、攪拌しながら200マイクロリットルのジメチルアミノピリジンストック溶液を滴下して添加して、多糖液のpHを9に調整します。活性化のプロセス全体のために氷水浴で反応を冷やしてください。
攪拌しながらCDAP100マイクロリットルを多糖液に移すことで、シアノ-ジメチルアミノピリジン-テトラフルオロゴレートまたはCDAP活性化を進めます。タイマーを開始し、15 分間のアクティベーション中に pH の変更を監視します。0.1モル水酸化ナトリウムを速やかに10マイクロリットルずつ添加することで、目標pHでの反応を維持します。
最適な活性化時間に達したら、活性化多糖に0.5モルアジピックジヒドラジドを一度に2ミリリットル加えます。pHが水酸化物の官能化に必要な範囲であることを確認してください。反応混合物を少なくとも1時間撹拌した後、反応混合物を摂氏4度に移す。
生成物からのADH濃度を低減するために、透析装置を用いて粗型誘導体多糖液を透析する。導出多糖類を透析から回収し、多糖類とヒドラジドの濃度を決定し、ヒドラジドを多糖比に算出します。標準として使用されるミリリットルの未修飾多糖溶液あたり1ミリグラムを準備します。.
安定した均一な温度を達成するために最低1時間、140°Cに加熱ブロックを予熱します。酸がこぼれた場合には、下と暖房ブロックの周囲に保護パッドを使用してください。トリクリティートで100ホウケイ酸試験管でラベル13に1ミリグラムの炭水化物標準あたり1ミリグラムの様々な量を追加し、所望の標準濃度を達成するために水で100マイクロリットルに体積を構成します。
同様に、誘導体化多糖の5マイクログラムを含む体積を3本のサンプルチューブに添加してサンプルアッセイを設定する。各チューブに1ミリリットルのレゾルシノールあたり1ミリグラムを作り、作りたての100マイクロリットルを加えます。繰り返しピペッタを使用して、各チューブに調製された75%硫酸の300マイクロリットルを追加し、チューブを激しく渦盛り、チューブを離れて指し、ヒーターブロック内のすべてのチューブを連続した順序で安定したペースで配置し、すぐにタイマーを3分間設定します。
3分で、チューブを同じ順序で取り出し、氷水浴中のラックに直接入れます。氷冷管を取り外し、室温まで5分間平衡させます。10ミリメートルのパス長キュベットを使用して、430ナノメートルのUV-Vis分光光度計上のすべてのチューブの吸光度を読み取ります。
アッセイ反応を設定するには、ラベル付き標準チューブをチューブラック内で並べ替え、濃度を上げる順序で配置します。キャリブレーションされたマイクロピペットを使用して、各対応するチューブに100マイクロリットルの標準を追加します。ゼロ標準の場合は、サンプルバッファーの 100 マイクロリットルを使用します。
同様に、サンプルチューブを調製し、配置します。次に、校正した1,000マイクロリットルマイクロピペットを使用し、875マイクロリットルのアッセイバッファーをすべてのアッセイチューブに加えます。アッセイ反応を開始するには、25マイクロリットルの1%トリニトロベンゼンスルホン酸を各アッセイチューブに5分以内に所定の順序で加える。
アッセイチューブを高速で2秒間渦巻き、液体がチューブ開口部から半インチの高さまで渦巻くことを確認します。アッセイの開始時刻を記録し、タイマーを2時間に設定します。その後、アッセイチューブラックを室温で暗く2時間置きます。
時間が過ぎると、チューブを渦に入れ、データ収集に進みます。ADHデキストランを、レゾルシノール硫酸アッセイを用いてデキストランについてアッセイした。糖標準としてグルコースを用いた典型的な標準チューブをプロットした。
誘導体化多糖またはデキストランにおけるヒドラジド含量を、TNBSアッセイを用いて決定した。誘導体化のレベルは、異なる平均分子量のポリマー間の比較を容易にするために、デキストランの100キロダルトン当たりの水素化物として計算した。ここで説明するプロトコルは、特定の多糖に適合する必要がある場合があります。
CDAP化学は、多糖類を機能化し、多種多様なコンジュゲーション試薬を使用することができます。これは、例えば、多糖類をエリサで使用するためにビオチン化するために使用することができる。タンパク質はCDAP活性化多糖に直接リンクすることができますが、これは通常、特定の多糖に対していくらかの最適化が必要です。
共役収量は75%以上になる可能性 CDAP 化学の使用は、インド血清研究所が作ったような低コストの共役ワクチンを可能にしました。
