This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost's Fellowship from CMU.

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The authors have nothing to disclose.

トレハロース類似体は、食品や医薬品の保全から微生物感染症6の診断と治療のために、さまざまな分野に影響を与える可能性を持っています。既存の多段階の化学合成法（ 例えば 、天然に複雑なマイコバクテリア糖を生じる）の変形例の複数の部位を有する複雑なトレハロース類似体を製造するために有用です。しかしながら、これらの方法は、比較的簡単な一置換トレハロースアナログ9、13、14の合成に適用した場合であっても、常に長く、非効率的です。別の合成アプローチは、迅速かつ効率的に上記の領域内の値を有することができるトレハロース類似体の様々な種類を生産するために必要とされます。自然からのトレハロース合成酵素を利用する生体触媒のアプローチが最も有望です。いくつかのトレハロース合成経路が、自然界には存在し、我々はいくつかの理由のためのトレハロースアナログ合成のための理想的な酵素であることがT.のテナックス 18からTRETを検討してください。 T.テナックスからTRETは、反応は、大規模生産の設定で改善された速度および微生物汚染の防止のために加熱されることを可能にする、熱安定性です。 T.テナックスからTRETは、トレハロースを分解することができるではない一方向性酵素です。 T.テナックスからTRETは、 大腸菌からの発現および精製に適しており、その出荷および保管は容易です。 TRET反応は、単一のステップであり、それは単純な基質グルコースおよびUDP-グルコースを伴います。構造的/機能的に多様なグルコース類似体の多くは、多数の市販業者から入手可能です。 UDP-グルコースは、特にTREPドナーβ-D-グルコース1-リン酸と比較して、比較的安価な糖供与体です。 T.テナックスからTRETは高い広報を持っていますグルコース基板構造のためomiscuityので、様々なトレハロースアナログがアクセス可能です。 TRET反応混合物から生成物の精製は、高速かつ簡単です。 ここで、我々はTRET酵素の上記正の属性を生かしたトレハロースアナログ合成のための詳細な最適化されたプロトコルを報告しました。 TRETプロセスは、所望であれば、追加のスケールアップが可能であるべきであるが、セミ分取スケール（10-100ミリグラム）の純粋なトレハロース類似体の種々のアクセスするために使用することができます。類似体の多くのタイプは、 例えば 、安定同位体標識及び放射性標識された（アジド、デオキシ、フルオロ、およびチオトレハロース、並びにトレハロースの立体異性体を含む、私たちの前に、現在の仕事にアクセスされたが、他の修正も可能になりますトレハロース）が特に重要です。 TRETプロセスの合成および精製工程は、運用シンプルで、簡単に合成チェの訓練を受けていない担当者が行うことができ、ミストリー。もしサイズ排除カラム：TRETプロセスの最も魅力的な特徴の一つは、両方の合成および精製手順はノート（所望の洗浄工程の数に応じて1〜4時間の範囲、非常に短時間で実行することができるということです精製は、未反応のグルコースアナログからトレハロースアナログ生成物を分離するために必要とされ、これはまだトレハロースアナログ合成のための既存の方法よりも実質的に高速である約2日）に合計時間を増加させます。 TRETプロセスはまだ報告トレハロースアナログにアクセスする最も効率的な酵素的経路であるが、それは将来の改善のための機会を提供するいくつかの欠点を有します。 UDP-グルコースは、他の糖供与体に比べて比較的安価であるが、まず、TRET処理の効率をより安価な光源からのUDP-グルコースの酵素的合成、 例えば 、α-D-グルコース1-それを結合することによって改善することができますリン酸塩、またはidentifyiによってUDP-グルコースのための安価な代用物をngの。この方法の第二の潜在的な制限は、反応範囲は、最終的にTRETの基板公差によって支配されるということです。野生型TRETの公差が（ 表1参照）、非常に高いが、いくつかの類似体は、この方法で（ 例えば 、4位で修飾された類似体）を用いて合成することができません。したがって、増加した基板の公差とTRETの操作されたバージョンは貴重になります。多くのTRET触媒反応は定量的な変換を続行しながら、第三に、下側の変換は、クロマトグラフィー精製工程を必要とします。このプロトコルでは、我々はそれが安価であるため、任意の特殊な装置を必要とせず、水溶出でのみ行うことができる比較的遅いサイズ排除プロセスを使用することに焦点を当てました。あるいは、分取スケールアミノプロピルカラムを用いたHPLC精製は、生成物の精製のための高速化方法として使用することができます。これらの制限の一部にもかかわらず、TRETプロセスが提供しますトレハロース類似体の迅速かつ効率的な製造のための強力なプラットフォームは、バイオ（テクノ）での評価やアプリケーションの論理的および生物医学分野を促進すべきです。上述TRETプロセスへの将来の改善は、さらにトレハロース及びその誘導体に関連する研究とアプリケーションを強化していきます。 トレハロース類似体は、様々な分野での潜在的な価値を持っています。冒頭で述べたように、天然トレハロースのでトレハロース、このような分解抵抗性のような特性を有する類似体が魅力的であり得る、バイオプリザベーション、食品甘味料用途に使用されます。また、天然のトレハロースの安定同位体標識及び放射性標識バージョンの様々な研究目的のために市販されており、TRET処理が確実にこれらの分子を迅速かつ効率的なアクセスを提供することができます。トレハロース類似体は、トレハロースは、哺乳動物に存在しないため、プローブおよび阻害剤との病原体を標的とするために重要でもあります。あるAP特に関心のあるこの領域のひだは、マイコバクテリアの検出です。年間150万人を殺す結核菌 、結核の原因物質は、哺乳動物には存在しないユニークなトレハロース処理経路が含まれています。例えば、トレハロースリサイクルトランスポーターと外膜常駐糖脂質にトレハロースを組み込む下流の酵素は、哺乳類22には存在しません。検出可能なトレハロースアナログでこのマイコバクテリア固有の機械を標的とすることはモデル系およびおそらくヒト患者における結核菌感染のin vivoイメージングへの魅力的なアプローチを表しています。実際、FITCケトトレハロースとTreAz（ 図1B）の上記の例は、このような動向8、9のための道を開いてきました。研究コミュニティにこれらのツールのアクセスを容易にするために、我々は、ここで急速にするためのプロトコルを報告synthesizると、クリックケミストリーと組み合わせて画像マイコバクテリアに6-TreAzを使用。 このプロトコルは、結核の診断用途に有用であり得る他の検出トレハロースアナログの開発のために適合させることができます。例えば、バリーとデイビスは、最初マイコバクテリア感染8のin vivoイメージングのための陽電子放射断層撮影法（PET）をプローブとして18 F-フルオロトレハロースの使用可能性を提案しました。 TRETプロセスは、この目標を実現するための理想的であってもよいです。 TRET迅速かつ定量2-フルオロ-グルコースからの2-フルオロトレハロースを生成することができる（ 表1参照）、18 F-2-フルオロ-グルコースは短命であるため重要である（18 Fの半減期= 110分）、非常に高速な化学反応を必要とします。既に腫瘍のPET画像化のために診療所で使用されているので、また、18 F-2-フルオロ-グルコースは、容易に入手可能です。 devに関する説明TRETプロセスの使用様々なアプリケーションのための18 F-フルオロトレハロース及びその他のトレハロースアナログのelopmentは、私たちの研究室で現在進行中です。

トレハロースは、1,1-α、αグリコシド結合（ 図1A）によって結合された2つのグルコース部分からなる対称な非還元性二糖類です。トレハロースは、ヒトおよび他の哺乳動物には存在しないが、それは、細菌、真菌、植物、無脊椎動物1に一般的に見出されます。ほとんどの生物におけるトレハロースの主な役割は、乾燥1などの環境ストレスから保護することです。また、いくつかのヒト病原体は、細胞エンベロープ生合成のメディエーターとしておよび免疫脂質2の構築のためのビルディングブロックとしてトレハロースを用いる結核を引き起こす結核菌を含む、毒性のためにトレハロースを必要とします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> 図1： トレハロースとトレハロース類似体。 （Xは構造的な変更であり、天然トレハロースと不自然なトレハロースアナログの）構造。 （B）バイオプリザベーションとバイオイメージングにおける潜在的なアプリケーションを持っている文献に報告トレハロースアナログの例を。 、そのユニークな構造と生理機能に、トレハロースは、バイオ（テクノ）で使用するための論理的および生物医学的応用3を大きな注目を集めています。 nature- 例えばで観察されたトレハロースの保護特性は、その印象的な能力は4 -haveはバイオプリザベーション・アプリケーションでその広範な使用に拍車をかけ極度の脱水を受けた&quot;復活&quot;植物の生活を維持するのに役立ちます。トレハロースは、核酸、タンパク質、細胞、および組織3のような生物学的サンプルの広い配列を保存するために使用されてきました。例えば、トレハロースは、医薬品tの数で安定化添加剤として使用されています帽子は3いくつかの抗癌モノクローナル抗体を含む、市販されています。同様に、トレハロースは、食品業界で甘味料として使用され、それが広く両方食品および化粧品産業における製品の保存のために使用されます。商用アプリケーションのこれらの種類のトレハロースの採用は、当初、天然の供給源から、または合成により純粋なトレハロースの大量を得ることができないことによって制限されていました。しかしながら、澱粉からトレハロースの経済的な生産のための効率的な酵素的方法は、最近、広範な商業的使用に拍車をかけている、開発されています 5。 （ 図1Aに示される一般構造、 図1（b）に示すトレハロース類似体の具体例）化学トレハロース類似体と呼ぶ、トレハロース誘導体を改変、様々な用途にますます注目を集めている6。例えば、ラクトトレハロース、ガラクトースで置き換え、そのグルコース単位のいずれかのトレハロースアナログであり、従って、その4位のヒドロキシル基が反転立体化学構成を有しています。ラクトトレハロースはトレハロースと同様の安定化特性を有するが、ノンカロリー食品添加物6,7などが魅力的、腸の酵素による分解に耐性です。 トレハロース類似体における当社グループの持分は、主にマイコバクテリア特異的プローブおよび阻害剤としてのそれらの値に関係します。バリーとデイビス基は蛍光顕微鏡8によりその検出を可能にする、生結核菌の細胞壁を標識代謝することが示されたFITCケトトレハロース命名フルオレセイン共役ケトトレハロースアナログを開発しました。ベルトッツィラボは、代謝、細胞壁にラベルを付け、その後DET可能性が小さいアジドトレハロース（TreAz）類似体を開発しましたクリック化学と蛍光分析9を使用してected。これらの進歩は、結核のための画像診断剤としてトレハロースベースのプローブを使用する可能性を指します。トレハロース類似体はまた、生存率および病原10、11、12のために必須である細菌で経路を破壊するために、それらの潜在的に結核菌の阻害剤として追求されてきました。 これまで、バイオ（テクノ）論理及び生物医学的用途のためにトレハロースアナログを開発する主な障害は、効率的な合成方法がないことです。トレハロースの類似体を製造するには2つの伝統的なルートは、化学合成（ 図2）に依存しています。他が適切に官能単糖ビルディングブロックで始まり、に化学的グリコシル化を実行する必要が、一方の経路は、天然トレハロースの非対称化/変更を伴います1,1-α、αグリコシド結合を築きます。最近の総説13、14で議論されてきたこれらのアプローチは、 結核菌 15からそのようなスルホ脂質-1のような複雑なトレハロース含有天然物、少量の多段階合成を達成するために有用であることが判明しました。しかしながら、両方のアプローチは、非化学者に一般的に、時間がかかり、非効率的なアクセス不能であり、そして、さらに、環境に優しいとはみなされません。したがって、トレハロース類似体の特定の種類を合成するため、これらの戦略は理想的ではありません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> 図2： トレハロースアナログ合成へのアプローチ。化学は難しいPROTECを伴う多段階の手順を使用し、左に示し、トレハロースアナログ合成へのアプローチ化/脱保護、非対称化、および/またはグリコシル化のステップ。右側に示す酵素合成は、立体選択的に水溶液中で類似体をトレハロースするための簡単な、保護されていない基質を変換する酵素（複数可）を使用しています。本明細書で報告酵素プロトコルは、単一のステップでトレハロースの類似体へのグルコース類似体およびUDP-グルコースを変換するトレハロース合成酵素（TRET）酵素を使用しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> トレハロースアナログへの効率的な生体触媒ルートは、製造、評価し、分子のこの有望なクラスの適用を容易にするであろう。トレハロースの生産5用の市販の酵素処理は、それが基質として澱粉を使用しているため類縁体を合成に適応可能ではありませんが、他の生合成経路がありますトレハロースアナログ合成のために利用することができる自然の中での方法。しかし、最近6を検討したこの地域での研究は、制限されています。一つのレポートには、対応するフルオログルコースからの単一フルオロトレハロースアナログにアクセスするには、 大腸菌（Escherichia coli）トレハロース生合成経路に触発されたメソッドを使用していました。しかしながら、このアプローチは、限られた効率と汎用8を有する三酵素系を必要とします。探索された別のアプローチは、原理的にはグルコースアナログおよびグルコース-1-リン酸6、16、17からトレハロース類似体の一段階合成を可能にする逆方向にトレハロースホス（TREP）を使用することです。このアプローチは、将来有望であることができるが、両方の反転と保持TrePs現在アナログ合成のための欠点を有します。例えば、反転TrePsは法外EXPEを持っていますnsiveドナー分子（β-D-グルコース1-リン酸）と保持TrePsが悪い酵素発現収量/安定性と限られた基板の混乱を持っています。 TREP媒介アナログ合成が実用的である前に（酵素工学を介して、例えば ）重要な改善が必要とされるであろう。 現時点では、トレハロース類似体の酵素合成のための最も実用的なアプローチは、グルコースおよびウリジン二リン酸（UDP）は、単一のステップ6でトレハロースに-グルコース変換トレハロース合成酵素（TRET）酵素を使用することです。我々は最近、グルコース類似体およびUDP-グルコース（ 図3）19からトレハロース類似体を合成-to サーモテナックス TRET、耐熱性および一方向の酵素18の使用を報告しました。この酵素は、合成方向に動作し、TREPのシステムで検出されたトレハロースの劣化の問題を回避できます。このワンステップ反応coul1時間で完了さD、及び（高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって決定されるように&gt; 99％まで）トレハロースアナログの広範な種々の高収率でアクセスされた容易に入手可能なグルコース類似体基質から（代表的な結果の表1を参照セクション）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> 図3： トレハロースアナログのTRET触媒による一段階合成。 T.テナックスからTRET酵素は、立体選択的に1ステップでトレハロースの類似体を形成するために容易に利用可能なグルコース類似体およびUDP-グルコースに参加することができます。 R 1〜R 4 =可変構造変更、例えばアジド、フルオロ、デオキシ、チオ、立体化学、または同位体ラベルの変更のため、 Yは、例えば、酸素または硫黄、または同位体標識されたヘテロための変数のヘテロ原子を=。 ここでは、広告を提供します発現および精製TRETの大腸菌から、最適化されたTRET反応条件、および完全に水性相で行われる改良された精製法を含む、TRET合成処理するためのプロトコルをetailed。この修正されたプロトコルは、セミ分取スケール（10-100 mg）を上の多様なトレハロースアナログの好都合かつ効率的な合成及び精製を可能にします。我々はまた、マイコバクテリア細胞の迅速な蛍光検出を有効にして1時間未満でマイコバクテリアにトレハロースベースのプローブを調製し、投与するために、このプロトコルの使用を実証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate,</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">S374</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing, MWCO 12&#8211;14,000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-152-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Glucose analogues</td>
			<td>CarboSynth,</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Examples of vendors that offer numerous glucose analogues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Aldrich,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MA02620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-Glucose</td>
			<td>abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>444-9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>150-4118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1056280001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>351430075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl HPLC column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-488</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues

化学的に修飾されたトレハロースのバージョン、またはトレハロース類似体は、他の分野の中で、生物学、バイオテクノロジー、および製薬科学の用途を有します。例えば、検出可能なタグを有するトレハロースアナログは結核菌を検出するために使用されており、結核診断用造影剤としての用途を有することができます。トレハロースの加水分解的に安定したバージョンはまた、ノンカロリー甘味料およびbioprotective剤としての使用のためのそれらの潜在的に追求されています。様々なアプリケーションのための化合物のこのクラスの魅力にもかかわらず、彼らの可能性は、それらの製造のための強固なルートがないために満たされていないままです。ここでは、化学合成に関連する問題を回避トレハロース類似体の迅速かつ効率的な一段階の生体触媒合成のための詳細なプロトコルを報告します。 サーモテナックスから耐熱性トレハロースシンターゼ（TRET）酵素を利用することにより、トレハロースアナログはgeneratすることができグルコース類似体および15から60分で（定量的変換まで）高い収率でウリジン二リン酸グルコースから一工程で編。スピン透析とイオン交換で構成されて簡単かつ迅速な非クロマトグラフィー精製プロトコルは、わずか45として分で水溶液中の濃度が既知の多くのトレハロースの類似体を提供することができます。未反応のグルコース類似体が残る場合には、トレハロースアナログ生成物のクロマトグラフィー精製を行うことができます。全体的に、この方法は効率的で、非化学者にアクセス可能であるトレハロース類似体の迅速合成および精製のための「グリーン」生体触媒のプラットフォームを提供します。この方法の適用を例示するために、我々は、合成、すべての水精製、および1時間未満とマイコバクテリアの有効蛍光検出を取ったそのすべてがマイコバクテリアのトレハロースベースのクリック化学プローブの投与のためのプロトコルについて説明します。今後は、OTHの中で、ということを想定しますERアプリケーションは、このプロトコルは、結核の診断のためのトレハロースベースのプローブの迅速な合成に適用することができます。例えば、短寿命放射性核種修飾トレハロースアナログ（ 例えば 、18 F修飾トレハロース）は、陽電子放出断層撮影、コンピュータ断層撮影法（PET-CT）などの高度な臨床イメージング様式を使用することができます。

T.テナックス TRETは、標準的なタンパク質発現および精製技術を使用して、約4ミリグラム/ Lの収量で大腸菌から得ました。単一ニッケルアフィニティークロマトグラフィー工程は、（代表FPLCのトレースを図4に示されている）、大腸菌溶解物からTRETを精製するのに十分でした。 TRET合成プロセスに私たちの最初の出版物に設立されたように、組換えのT.テナックス TRETは、様々なグルコース類似体、多くの市販の-への高効率19と対応するトレハロースの類似体であるのの幅広いを変換することができます。私たちの最初に報告されたプロトコルを使用して、グルコース類似体を開始する数のHPLC-決定反応収率を与える表1は 、TRETの基板乱交および合成のためのその適合の範囲を示しています。アジド、フルオロ、デオキシ含む多様な構造変更、糖環の周りの異なる位置にチオ、および立体化学的修正が主な例外は4位での修飾されて、野生型酵素によって十分に許容されています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig4.jpg" /> 図4：FPLC によってTRET精製のための代表的な結果。手順に記載したように、大腸菌溶解物からの組換えT.のテナックス TRETの精製は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて行った1.4.1-1.4.4。ブルー、紫外線（UV）吸収トレース。ライトグリーン、溶出緩衝液の濃度;ダークグリーン、圧力。 TRETに対応するピークは矢印で示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/54485fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 表1：TRET 反応のための代表的な利回り。 HPLC-決定され、いくつかのトレハロース類似体TRET反応の単離収率。 ND、検出されません。 - 反応が最適化されたプロトコルを使用して半調製規模で実施されなかったことを示します。 *サイズ排除クロマトグラフィー工程が必要であったことを示します。水平分割線は、トレハロースの糖環上の変更の位置を分離します。許可を得て、基準19から適応表。この仕事から単離収率を含むように更新。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/Table1.docx">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> ここで、我々はTRET合成プロセスの全体的な効率と速度を向上させる私たちの最初のプロトコルに最適化を報告します。元のプロトコルは、10 mMのグルコースANを使用しながらalogue及び40mMのUDP-グルコースは、同程度の変換が効率的に反応ごとに生成物の量を倍にし、比較的高価であるUDP-グルコースの無駄を制限する、20 mMグルコースおよび40 mMのUDP-グルコースを用いて得られることが決定されました。グルコースアナログとUDP-グルコースの等モル量を使用すると、下の変換をもたらしました。所望の場合、反応時間はまた、まだ70℃（でわずか15分で6 TreAz〜6 GlcAzの定量的変換によって実証された多くの類似体のための同等の変換を保持しながら、最初に60分報告未満に短縮することができます図5及び6）。 本明細書で報告精製プロトコールは、実質的に非クロマトグラフィースピン透析/イオン交換法を用いて、元の酵素沈殿/シリカゲルクロマトグラフィー法を交換する、改善されています。この変更のための理論的根拠は、TRET rのことですeaction混合物は、中性トレハロースアナログ製品以外のイオン種で完全に構成されています。したがって、混合物は、スピン透析酵素を除去し、その後、わずか45分として水溶液中で精製トレハロースアナログを提供する、イオン種の全て除去するために、混合床イオン交換樹脂で処理することができます。このすべて水性の精製方法は、環境に有害な有機溶媒、時間のかかる蒸発及び濾過工程、および特に非化学のために、ゆっくりと面倒なプロセスであり、乾式負荷シリカゲルクロマトグラフィーを回避します。記載TLCまたはHPLC分析を用いて決定した定量的な変換を示しTRET反応のために、この精製法が原因イオン交換にいくつかの糖の結合の可能性生成物の損失と、報告された反応スケールで約60〜80％の単離収率を提供します樹脂（代表単離収率は表1を参照）。未反応のグルコース類似体が残る場合には、これを水で溶出し、ポリアクリルアミドビーズベースのサイズ排除カラムを用いて所望のトレハロースアナログ生成物から分離することができます。好ましい場合、これはまた、アミノプロピルカラムを用いて分取スケールHPLCを使用して達成することができます。生成物の純度はTLC、HPLC、および/またはNMR分光分析によって評価することができます。 図5は、説明されたプロトコルを介して合成された6-TreAz、のための代表的な分析データを示しています。 TLCおよびHPLCデータは、この反応のために、6 TreAz製品に6 GlcAz基板の定量的変換を示し、スピン透析/イオン交換精製工程後の単離収率は58％でした。 1 H及び13 C NMR分光分析は、最も顕著にα、新たに形成されたグリコシド結合、並びにその純度のα立体化学を含む、6 TreAz物の構造を確認しました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig5.jpg"/&gt; 図5：TRET 反応のための代表的な分析データ。 （A）TLCおよび（B）6- TreAz〜6 GlcAzのTRET触媒変換のHPLC分析。スピン透析/イオン交換精製後に得られた6-TreAz生成物（C）1 H NMR及び（D）13 C NMRスペクトルを示します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/54485fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 結核菌を特異的に検出するためのトレハロースアナログの上記の値が与えられると、TRETプロセスは、結核の研究および診断用途のためのトレハロースベースのプローブの開発と利用を促進すべきです。このタイプのアプリケーションを示すために、我々は、最適化さTRETを使用しました急速に調製、精製、および6-TreAzトレハロースベースのクリックケミストリープローブを蛍光検出を可能にするために9 -toマイコバクテリアを管理するためのプロセス（ワークフローや代表的なデータを図6に示します）。簡単に述べると、TRETを定量15分で6 TreAz商用6 GlcAzを変換するために使用した後、反応混合物は、わずか45分を要したスピン透析/イオン交換精製法に供した（複数のすすぎ工程が増加するために省略されました速度）。したがって、既知の濃度の純粋な6- TreAz（〜5ミリモル）の水性ストック溶液は、1時間で生成されました。 6-TreAz在庫がすぐにクリックケミストリー媒介ライゲーション20、21のためのハンドルを組み込み、細胞表面のアジド標識化を達成するために、モデル細菌Msmeg（最終6-TreAz濃度〜25μM）の成長培地に投与しました蛍光プローブ。続いて、標識された細胞は、6-TreAz処理細胞のための強力な蛍光を示した蛍光顕微鏡によって分析しました。予想されたように、6- TreAzまたはそれで処理しなかった対照試料は、6 TreAz取り込みおよび代謝の取り込み9のために必要とされる機能性トレハロース輸送体22を 、欠落した、全く蛍光を示しませんでした。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig6.jpg" /> 図6：TRET- 合成トレハロースアナログを使用して、マイコバクテリアを迅速に検出するための代表的な結果。 （A）6-TREの迅速な合成、精製、および使用のためのワークフローMsmegの蛍光検出のためのアリゾナ。プロトコルの5.1.1-5.1.6は、アジドと細胞表面の代謝標識を達成するためにMsmegを生きるために、それを管理した後、6-TreAzを（1時間中〜5 mMの水溶液を与える）を合成し、精製するために使用された手順。次に、ステップ5.2.1-5.2.9で説明したように、（CuAAC）はアルキン修飾フルオロフォア、アルキン-488と細胞表面のアジドを反応させるために実施された化学をクリックします。 Msmegの対照試料は、未処理のままか、トレハローストランスポーター（ΔsugC）が欠如している間（B）機能トレハローストランスポーター（野生型およびΔsugC :: sugC）を含む6 TreAz処理したMsmegの蛍光イメージングは、強い蛍光を示しませんでした。許可を得て、基準19から適応図;改善されたTRETプロトコルからワークフローおよびイメージングデータで更新。スケールバー、5μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/54485fig6large.jpg" target="_blank">お願いします</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

迅速なワンステップ酵素合成とトレハロース類似体のすべての水精製

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.3K ビュー.  Central Michigan University. Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

生化学

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...