Name: the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo
Uploaded: 2017-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
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まず、このプロジェクトに参加した母親に心から感謝します。次に、サンプリング手続き、麻酔科医、看護師麻酔科医、外科看護師を援助し、手助けしたすべての人員を認めます。このプロジェクトは、南・東ノルウェー地方保健局とオスロ大学女性健康局のノルウェー諮問部とオスロ大学病院が提供する地方財政からの資金提供なしでは可能ではなかった。

研究はオスロ大学病院のデータ保護関係者と南ノルウェー南部ノルウェーの医療健康研究倫理委員会によって承認されました。すべての参加者は、包括的な書面による同意書に署名した。 1.準備注：手順のタイムラインは図1に概説されています 。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> 図1 ： 4容器サンプリング手順に関わるタイミングと人員を説明するフローチャート。 1色は1人を表します。この方法の詳細な説明は、プロトコルに記載されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol><li> スタッフ <ol><li&gt;超音波測定を行う高度に熟練した胎児医学専門医、手術を行う産科医2名、産科医の1人、検体を採取する2名の看護師、血液ガス分析を担当する1名の助手、他のサンプルは連続して収集の直後に収集されます。 注：より高度な胎盤組織の収集の場合、追加の人が必要です。 </li></ol></li><li> 装置 <ol><li>装置、氷冷1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）50 mL、冷RNA安定化溶液25 mL、最適切削温度化合物（OCT）5 mLを5 mL準備する。 vacutainersとチューブにラベルを付けます。機器の仮一覧を参照してください。 </li></ol></li></ol> 2.母性<ol><li>母親の臨床的および非臨床的特徴を包括的に記録し、関連する質問と私を繰り返す配送時には、重量を含む服薬基準を満たしていなければなりません。帝王切開前の絶食期間、および手術中に発生する低血圧のエピソードを記録する。 注：グローバル妊娠コラボレーション（COLAB）の最近の刊行物に報告されている母親の臨床データセットの最小値を含めてください。また、この記事では、研究集団を選択する際にいくつかの非常に重要な側面を有しており、研究18を計画する際に対処する必要があります。 </li><li>民族性、年齢、体格指数（BMI）などの父性の特徴を記録することを検討する。 </li></ol> 3.超音波<ol><li>空腹状態の女性と一緒に、配達の日にドップラー超音波検査を行います。大動脈と大静脈の圧迫を避けるために、仰臥位の女性が胎児の静止期に検査を行い、関心領域に対してわずかに横方向に傾けた。の出力を監視するディスプレイ上の機械的および熱的指標による強度の変化。 </li><li> 臍静脈 <ol><li>臍の静脈を胎児の腹部の矢状または斜めの切開部で視覚化する。目に見える枝の前に、腹腔内臍静脈の直線部分の内部血管直径を測定する。定期的なBモードを使用し、直径測定のために垂直のインボネーション角度で血管を視覚化し、拍動性の直径変化の影響を最小限に抑えるために、後の測定のためにいくつかの最適なフレームを維持する。 <ol><li>測定を5〜10回繰り返す19 。 </li></ol></li><li>同じサイトで、ドップラー超音波を使用し、時間平均平均速度（TAMX）を測定するために、インボーション角ができるだけ小さい（常に&lt;30°）ようにプローブを調整します。 3〜5秒間の速度を得る（非脈動流）。 </li></ol></li><li> 子宮動脈 <ol><li>ドップラーを使う子宮動脈が内腸骨動脈から分岐した直後に、それが外腸骨動脈を横切る際に子宮動脈を視覚化するための超音波を提供する。この部位のプローブを調整して低インポーション角（常に&lt;30°）を得、TAMXを測定します。 3心拍の平均速度として速度を求める。 </li><li> TAMXが測定されるのと同じ部位で垂直角を得ることはまずないので、直径測定の部位に近い正しい角度を得るために遠位に血管を追跡する。カラードップラー超音波で評価したところで、この部位の前に目に見える血管が枝分かれする場合は、直径の測定値を除外する。 <ol><li>定期的なBモードを使用し、直径測定のために垂直のインボネーション角度で血管を視覚化し、拍動性の直径変化の影響を最小限に抑えるために、後の測定のためにいくつかの最適なフレームを維持する。 </li><li>測定を5〜10回繰り返す19 。 </li></ol></<html> &gt; </ol></li><li>胎盤の位置に注意してください。 </li></ol> 4. 4血管血液サンプリング注：手順のタイムラインは図1に概略が示されており、サンプルの概要は図2に示されています 。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> 図2 ： 胎盤脈管構造および採取部位の模式 図 。 4容器サンプリング法では、血液サンプルを子宮静脈、橈骨動脈（子宮動脈のプロキシとして）および臍動脈および静脈から採取する。子宮動脈および臍静脈の血流を超音波で測定する。胎盤由来の組織サンプルを収集する。イラスト：ØysteinH. Horgmo、オスロ大学。5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <ol><li> 安全手順 <ol><li>作業劇場のすべての要員に手袋、外科用スクラブスーツ、マスク、帽子を提供する。 </li><li>外科医、研究スタッフに手術用スクラブスーツ、マスク、帽子、ガウン、ダブルグローブを提供する。メガネはオプションです。 </li><li>血液サンプルを手袋で取り扱う人員を提供する。 </li><li>胎盤試料を手袋と外科用マスクで取り扱う人員を提供する。均質化のためには、フードを使用する必要があります。 </li></ol></li><li> オペレーションシアターでの準備 <ol><li>ブリーフィングを行い、手術の開始前にサンプリングを補助するすべての要員に装置を渡す。 </li><li>必要な末梢動脈および静脈アクセスを支援する麻酔科医および麻酔科看護婦に連絡し、サンプリング前に液体を静脈内に投与することはない。 </li><li>橈骨動脈を補助する人に、前腕静脈サンプルを補助する人に2本のシリンジ（20mLと10mLの1つ）と1つの血液ガスシリンジ（ヘパリンを含む）を注射針で3本注射する。 </li><li> 2つの滅菌シリンジ（20 mL）、5つの滅菌シリンジ（10 mL）、3つの「バタフライニードル」および2つの血液ガスシリンジを操作領域用に準備する。 </li></ol></li><li> 血管へのアクセス。 <ol><li>末梢静脈内（iv）アクセスを保証するために、帝王切開前の標準的な手順に従ってください。 注：このサイトからサンプルを抽出する方が簡単であるため、前胸静脈が好ましい。 </li><li>超音波または触診によって橈骨動脈を手首に局在させる。 0.5mLの皮下リドカイン鎮痛の後、橈骨動脈に動脈ラインを配置する。挿入が3回失敗した場合は、このサイトからのサンプリングを中止するか、女性が挿入中に痛みを経験する場合。 注：標準的な手順に従って帝王切開の手術を行います。サンプリング手順に必要な調整だけが下に示されています。 </li></ol></li><li> 母体の血液サンプル 注：子宮切開の前に、3つの母体血液検体（子宮静脈、橈骨動脈および前胸静脈）を同時に採取する。 <ol><li>子宮の静脈では、腹腔を開いた後、開創器を用いて腹壁を持ち上げ、子宮の主枝を子宮の前外側に露出させる。可能であれば、胎盤と同じ側の子宮静脈分枝から血液を採取するか、胎盤が子宮の正中線に位置する場合は最も顕著な静脈叢を使用する。 <ol><li>蝶静脈の血液ガスシリンジに約30度の角度でバタフライ針を挿入し、穏やかな吸引によって血液を採取しないでください溶血。バタフライ針の静脈の位置を注意深く確保しながら、充填した血液ガスシリンジを20mLシリンジと10mLシリンジで交互に交換します。 注：選択された子宮静脈の対側に立つとき、最適なアクセスが保証されます。 </li></ol></li><li>橈骨動脈については、動脈内ラインから吸引する。最初の5 mLを捨て、血液ガス分析のためにヘパリンシリンジで3 mLを吸引し、続いて2つのシリンジ（20 + 10 mL）で3 mLを吸引する。 </li><li>前胸静脈については、静脈内カテーテルから静かに吸引する。最初の5 mLを捨て、3つのシリンジ（10 mL）で30 mLを吸引する。 </li><li>腹部の閉鎖を開始する前に、子宮の静脈にある採取部位の最終検査を行います。 </li></ol></li><li> 胎児の血液サンプル <ol><li>子供が生まれたときは、直ちに臍帯を締めたり、胎盤を娩出することなく、臍帯動脈から血液を吸引する。ウィットスタート血液ガス分析のためのシリンジを使用し、可能であれば3つの10mLシリンジに従ってください。 </li><li>動脈検体が固定されたら、臍静脈からサンプリングする前に、コードをクランプして子供を助産師に渡す（血液ガスおよび20 + 10mLシリンジ）。 注：採取から数秒以内にすべての臍帯標本を採取し、自発的に分離しない限り、原位置で胎盤を採取する。 </li><li>レイトコードクランプに関するノルウェーの推奨事項に従ってください。悩んでいる子供の場合は、すぐにコードを締め付けて切断し、子供を助産師や新生児医に渡してください。 </li></ol></li><li> 血液サンプルの取り扱い <ol><li>残りの血液サンプルを調製しながら血液ガスシリンジを氷上に置き、5分以内に血液ガス分析装置で分析する。 </li><li>血液検体をすぐにバキュテイナーに移し、氷上に置く前にロッカーに1〜2分間置く。血清チューブを労働に委ねるアトリエベンチを30分間安定させる。 注：これは5つのサイトすべてからのサンプルが良質を保証するために同時に準備されなければならないので、余分な注意が必要な手順の重要なステップです。 </li><li>できるだけ早く、30分以内に6℃、2,500 xgで20分間、血漿サンプルを遠心分離する。 </li><li> 30分後、血清サンプルを室温で2,500 x gで10分間遠心分離する。 </li><li>上清を2mLの凍結チューブに慎重に分注し、血小板を含まない血漿を確保するためにペレットの上に0.5mLの上清を残す。 </li><li>試料を-80℃で保存する。 </li></ol></li></ol> 5.胎盤組織の収集<ol><li>できるだけ早く、胎盤を氷冷した解剖皿に置いた後、胎盤を平らにします。 最長径と直径を90度で撮影して測定します。 </li><li>胎盤を体重測定する。 </li><li>重量、2つの直径、任意のgロスの病理、臍帯血管の数および送達から胎盤を氷上に置いた時までの時間間隔であった。 注：臨床的に示された場合、胎盤を病理学的検査に送る。 </li><li>母体表面を上にして胎盤を置き、陽性病理の領域を避けて、胎盤の各象限にランダムに位置する4〜5個のサンプリング部位を同定する。ハサミを使って脱落膜を除去し、妊婦の表面から3〜5mmを切り取る。各サイトから1~2 cm 3の絨毛組織を採取する。 </li><li>収集した組織を50mLの冷1M PBSで穏やかに洗浄する。各採取場所から数ピースに分け、アリコート。 注：胎盤の大きさは、計画された分析に依存します。 </li><li> 0.1~0.5cm 3の組織サンプルのアリコートを5本のクライオチューブに加え、液体窒素で急速に凍らせる。 </li><li> 0.1〜0.2 cm 3の小片を25 mLのRNA安定化溶液でチューブに加えます。 4時にストア6; Cで24時間、RNA安定化溶液を捨て、それを交換する。フリーズ。 </li><li> OCT 0.5 mLを含む5本の凍結チューブに0.5 cm 3のピースを加え、OCTで上にして混合し、凍結させる。 </li><li>分析までサンプルを-80℃で保存する。 注：Burton et al。計画された分析に応じて、胎盤サンプリングの実用的な側面の優れた概要を提供する。 図20は、微絨毛および基底膜の単離のために残りの組織を調製し、そして真空吸引技術によって脱落膜組織を収集することを検討してください。 21、22 </li></ol> 6.新生児の特徴<ol><li> Apgarスコア（1,5,10分）、性別、体重、長さ、妊娠期間、新生児集中治療室への入院（滞在の長さと結果）などの新生児の特徴を記録する。 </li><li>新生児の体組成を人体測定、空気置換プレチスモグラフまたは二重X線吸光光度法を用いて測定した。 23、24 </li></ol> 7.計算<ol><li>動脈および子宮動脈において同様の血液組成を仮定し、子宮胎盤の動静脈濃度差を計算する。 子宮静脈内動静脈濃度差= C A - C V 臍静脈 - 動脈間濃度差= C v -C a ここで、Cは下付き文字：A、橈骨動脈; V、子宮静脈; v臍静脈およびa、臍動脈。 </li><li>容量血流量、mL /分（Q）を計算する： <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Dは血管の直径（cm）であり、TAMXは時間平均最大速度であり、hは空間的血液速度プロファイルの係数である。臍静脈の係数として0.5を使用し、子宮動脈25、26 0.6。 </li><li>フィックの原理に従って、胎盤摂取量と放出量を計算する： 子宮内摂取 =（ C A - C V ）× Qm 胎児取り込み=（C のV - CのA） x Q f 下付き文字：m、母体およびf、胎児。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

<html>胎盤4血管サンプリング法は、主に3つの目的に関連する。第1に、特定の物質がどのように母体側の胎盤によって取り込まれ、臍帯血および胎児に移されたかを研究するために使用することができます。第2に、この方法は、プロゲステロンの結果によって示されるように、胎盤によって産生され、母体または胎児の循環系に放出される物質の研究に非常に関連している。第3に、急速な成長および組織リモデリングの間にインビボで胎児がどのように老廃物を排除するかを研究することは有用であり得る。 4容器法の重要なステップと物流上の問題 胎盤4-血管サンプリングは、以前に、正常な生理学的妊娠8、10 インビボにおける主要栄養素の胎盤移動を決定するために使用されていますss = &quot;xref&quot;&gt; 12であるが、被験者数は限られている。 4容器サンプリングの限定された使用はおそらく、手順の厳しいロジスティックのためである。この方法を使用するためには、胎児医学、産科学および麻酔学の各部門の患者、研究者および職員の間の良好な調整が不可欠である。私たちは、主な研究者のいくつかが産科医であり、臨床的なルーチンと重要な人材を知っていることが大きな利点であったと考えています。それにより、毎日の臨床実践に沿って研究手順が実施されている。手順のすべてのステップを調整し、確保することで、200を超える母親/新生児のペアからサンプルを取得しました。さらに、私たちの戦略は、サンプリングの手順が成功するためには決定的な技術上の課題があり、余りにも多くのサンプラーが不必要なデータの変化をもたらす可能性があるため、サンプリング手順をほとんど手に入れないことです。結果すべての超音波検査は、同じ超音波装置を使用して同じ検査者によって実行されることをお勧めします。船舶の壁の解像度が重要であるため、装置は注意して選択する必要があります。子宮の大きさと内容によって、直径測定に使用される垂直入射角度と、正確に同じ場所で流速測定のための低い入射角度の両方を得ることが困難になるため、第3妊娠の子宮動脈は特に技術的に測定するのが難しい。さらに、血液採取の成功は、子宮静脈の適切な採取部位の同定および穏やかな吸引を必要とする。臍帯側では、胎児赤血球の脆弱性は、吸引力に特に注意する必要がある。乳児への送達または軽度のストレスが、臍帯動脈の早期収縮と関連して動脈標本体積が減少することは、我々の経験である。 <strong&gt; 4法の倫理問題 「胎盤4血管サンプリング」法は、侵襲的かつ厳しい手順である。したがって、不要なサンプリング手順を避けるために、包含質問と除外基準を研究の質問に従って明確に定義すべきである。帝王切開の適応症が研究プロジェクトへの参加の影響を受けないようにするために、患者は、送達様式の決定後に包括的に接近すべきである。この手術は手術室で余分な時間を要しませんが、サンプリングに起因する不都合や外乱を制限するために人員を増やす必要があります。我々は、動脈系の挿入が侵襲性が低く、動脈および静脈からの同時サンプリングを確実にするので、子宮動脈のプロキシとして橈骨動脈を使用した。一部のグループでは動脈血を使用しており、これはさらに侵襲性の低い手技である13 。しかし、apa動脈ラインに関連する局所血腫の1つの発症から手の一時的な感覚異常に至り、4つの部位のいずれかから採取する間に悪影響を経験していない。特に、穿刺した子宮静脈からの出血は認められなかった。 4容器法の方法論的/分析的問題 胎盤4枝試験の結果の解釈におけるいくつかの方法論的問題に取り組むことが重要である。第1に、胎盤によって取り込まれ、放出される物質の質量を計算することが目的ならば、血液の通過量を考慮することが重要である。子宮の静脈は胎盤を排液するだけでなく、子宮筋を排水すること、および卵巣および膣の脈管構造と様々な程度の吻合を伴う子宮の脈管構造が維持されることに留意すべきである。次に、胎盤を横切る水の交換が濃縮物に影響を及ぼす可能性があることを考慮することが重要であるそれによって計算された動静脈濃度差に影響を及ぼす。理想的には、これは母親と胎児のペアごとに失われた水の濃度差を調整することで最も効果的です。これは、胎盤または子宮によって取り込まれないまたは放出されない物質を測定することによって達成され得る。ヘモグロビン濃度または赤血球の計算されたパーセンテージ（ヘマトクリット）は、水交換の補正因子として役立ち得る。さらに、胎盤の母体側で化合物の取り込みまたは放出を解釈する場合、比較のために他の組織に動静脈差を得ることが重要であり得る。従って、本発明者らは、胎盤上の動静脈の相違を前腕の毛細血管床の相違と比較することによって、胎盤の特異的特徴を特徴付けるために、前胸静脈からの血液サンプルを含めた。本発明者らは、sFlt-1の胎盤放出および胎盤増殖のfa全身性内皮細胞がこれらの化合物14の潜在的な供給源であり得るからである。研究の疑問に応じて、胎盤の効率、 すなわち （mmol / L）/ kgまたは（mmol / min）/ kg胎盤の胎盤効率を計算するために、動静脈差を胎盤の重量に関連付けることが重要である。 4容器法の限界と強さ 胎盤の生理学は、膣送達のストレスよりも帝王切開の影響を受けにくいが、この方法にはいくつかの制限がある。一般的な妊娠合併症（子癇前症、糖尿病、肥満および中等度胎児巨大症など）のほとんどの場合、膣内送達が推奨され、募集を制限および偏らせる可能性があります。この方法のすべてのステップを最適化しても、血液サンプリング手順および超音波ボリュームの技術的困難のために、各患者の完全な測定値およびサンプルを得ることは困難である（ 図3 ）。さらに、超音波測定は可能な限り手術時間に近づけて実施されるが、脊椎麻酔および血液採取の前に本質的に行われる。このことから、母体心拍出量（CO）が変化し、おそらく子宮胎盤（および胎盤 - 胎盤）の血流に影響を及ぼす可能性がある。脊髄麻酔薬によるCOの可能な変化は、現在の研究で使用されたフェニレフリンによって補われる。参加者のサブセット（n = 23）の予備データは、脊髄麻酔前およびサンプリング時点（未発表データ）におけるCOの有意な変化を示さない。動物では対照的に、ヒトで4容器サンプリング方法を使用して、時間変数を導入し、血液量5を操作する可能性の両方を制限する、29、30。これらの考察から、4つの容器<html>サンプリング方法は断面であり、大部分が本質的に観察され、得られたデータはそれに応じて分析されなければならない。他方で、4血管サンプリング法は、 in vitroで決して再生できない状況で、相互作用する全ての因子と共に、インビボでヒト胎盤生理学および病態生理学を研究する独特の可能性を提供する。それは、動物や他の実験的研究から浮かび上がった仮説を検証する絶好の機会を提供する。同様に、 インビトロおよび動物研究において機構的に試験される必要がある新しい仮説を生成することができる。 4容器法の可能性のある応用 、病的妊娠において、母体と胎児の動静脈の濃度差は、これまでに、別々に研究されている、およびインビボ 15、16 内の既存の仮説のいくつかの試験のために許可されass = &quot;xref&quot;&gt; 31。 4血管サンプリング法は、病理学的妊娠ではなく、母体、胎盤および胎児単位を一緒に研究する魅力的な機会を提供し、母体と胎児との相互作用の範囲内で、古いものと新しいものの両方について新しい光を当てる可能性があります。 4容器サンプリング法は、試料のさらなる分析に依存して、正常妊娠および病理学的妊娠の両方における広範な研究課題に適用され得る。バキュテイナーの選択、血液の量、胎盤の範囲および他の組織サンプルは、研究の質問に従って決定されるべきである。 Burton et al。は、最近、胎盤組織の良質なサンプルを確保するための手順を記述し、解決すべき大量のサンプルを必要とする特定のパズルに対処するために、異なるバイオバンクのマージを可能にする優れた論文を発表した20 。 4本の試料を分析して、エキソソームの母体への特異的放出を研究することができる循環、薬物、代謝産物および毒素の移動が含まれる。大規模なオミックス（メタボロミクス、プロテオミクス、およびリピドミクス）分析は、胎盤によって分泌される母体血漿中の物質および代謝産物を同定する可能性を有する。これにより、4血管サンプリング法の確立は、母体循環における胎盤由来因子を同定し、胎盤機能のバイオマーカーを可能な限り摘発することができる。胎盤栄養膜芽細胞の母親に向かう微絨毛および胎児に面する基底細胞膜を分離する技術と組み合わせて、関連するトランスポータータンパク質21の活性および位置とともに物質の移動を研究することができる21 。さらに、4つの血管の栄養素および微量栄養素のレベルを分析し、栄養素の移動を胎盤32の栄養素およびエネルギー感知システムに関連付けることによって、インビボでの栄養素移動を制御するメカニズムを解明することができる</sup&gt;。安定した同位体の使用と4つの容器のサンプリングの組み合わせは、アミノ酸移送33で実証されているように、よりダイナミックで力学的な情報を提供する強力なアプローチである33 。送達前のグルコース注入は、別の可能なアプローチである。胎盤移行は、BMI、グルコースおよび血漿脂質プロフィールのような母体の代謝変数、および出生時体重および体組成18のような胎児の結果に関連し得る。一緒に、これらのアプローチは、母体と胎児の状態とニーズとの間の相互作用の中心に位置する胎盤の統合的役割を明らかにするだろう。

健康、米国の国立研究所によると、胎盤は、人体1、2、3で最もよく理解器官です。進行中の妊娠に非倫理的リスクを課すことなく、インビボでヒト胎盤にアクセスして研究することは困難である。したがって、ヒトにおける胎盤機能の研究は、主に、インビトロおよびエクスビボモデルに基づく。胎盤輸送および代謝のインビボ研究において以前の大部分は、6匹の動物が 4、5で行われています。しかし、胎盤の構造や機能は種間でかなり異なるため、動物からヒトへの結果の外挿は慎重に行わなければなりません。ほんの少しのヒトのインビボ研究で、正常な生理学的条件下での胎盤および胎児の摂取および輸送を調べたら条件、及びどれがいくつかの化合物7、8、9、10、11、12、13の統合された転送を探求してきました。これらの基礎研究は、ヒト胎盤のin vivo研究が実現可能であり、それらがいくつかの目的に役立つことを示している。第1に、主にインビトロ 、 エクスビボおよび動物研究から得られる現在の胎盤機能の概念をヒトの環境で試験し、ヒトの胎盤に対する新規かつより特異的な洞察を提供することができる。第2に、異常な胎児の成長、子癇前症、母体糖尿病、メタボリックシンドロームおよび他の母体の代謝障害に関連する機能不全の胎盤の特性をよりよく特徴付けることができる。第三に、ヒトのインビボ研究は、診断を開発する機会を提供するチック、および胎盤機能の予測ツールである。 この背景で我々は、in vivoでのヒト胎盤機能を調査するための生理学的データの包括的なコレクションを確立することを目指した。計画された帝王切開期間中に、我々は子宮静脈への腹腔内アクセスを利用して、胎盤の母体および胎児側の入来および出血血管から血液サンプルを収集する（4血管サンプリング法）。これらの試料は、栄養素および他の物質の対の動静脈濃度差を計算するために使用される14 。さらに、我々は、超音波によって胎盤の両側のボリューム血流量を測定する。その結果、任意の化合物の胎盤および胎児への取り込みを定量化することができる。また、母体と胎児の循環15、16、17に胎盤によって放出される物質を決定することが可能です。結合するとき胎盤および他の関連組織の分析から、この方法は、同じ母親と胎児の対においてインビボでの胎盤機能の多くの局面を統合する潜在的可能性を有する。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

人間の胎盤はまだ子宮内にある間、研究のために非常にアクセスすることができません。従って、インビボでのヒト胎盤生理学の現在の理解は、胎盤の解剖学的構造、血行力学および妊娠期間における種間の多様性にもかかわらず、主に動物研究に基づいている。ヒト胎盤研究の大部分は、 ex vivo灌流研究またはin vitro栄養膜研究である。 インビトロ研究および動物モデルは必須であるが、in vivoでのヒト胎盤へのそのような研究からの結果の外挿は不確実である。我々は、期間中にヒト胎盤生理学をインビボで研究し、その方法の詳細なプロトコールを提示することを目指した。計画された帝王切開期間中に子宮切開の直前に子宮静脈への腹腔内アクセスを利用して、我々は胎盤の母体および胎児側の入来および出血血管から血液サンプルを収集する。コンを組み合わせるとき血漿中の血中濃度を測定することにより、胎盤および胎児への取り込みおよび放出を定量化することができる。さらに、同じ母親 - 胎児対からの胎盤組織試料は、トランスポーター密度および活性ならびに胎盤機能の他の局面のインビボでの測定を提供することができる。この4容器サンプリング法のこの統合的な使用により、正常妊娠および病理学的妊娠の両方において、インビボでの胎盤栄養素移動および代謝の現在の概念のいくつかを試験することができる。さらに、この方法は、胎盤機能不全のバイオマーカーの探索に重要な貢献であり得る、胎盤によって分泌される物質の母体循環への同定を可能にする。

4血管サンプリング法は、臨床診療において適用可能であり、我々は209母/幼児対からの血液サンプルを首尾よく得た。これらのうち128件では、体血流量を測定することもできました。 70匹の母親と胎児のペアで、完全な4脈管サンプリングと母体と胎児の両方の血管の良好な流量測定が得られた（ 図3 ）。さらに、私たちは今までに30人の子癇前症患者から血液および胎盤サンプルを収集しました。我々は以前の方法14、15、16の2つのアプリケーションを実証し、栄養素のヒト胎盤転送だけでなく、血管作動性要因の胎盤リリースに関する記事を公開しています。 4容器法を用いて胎盤移植を研究する方法の例 重要な動脈がある胎盤の両側でのグルコースのインビボ子宮胎盤摂取および胎児摂取を実証する（ 表1 ）。グルコースの胎盤移入は母体 - 胎児のグルコース勾配に依存し、それにより母体のグルコースレベルに依存する。しかしながら、我々はこれまで、この勾配、したがってグルコース転移が胎児のインスリンレベルおよびグルコース消費によっても有意に影響を受けることを実証した。これは、この方法が重要な母親と胎児の相互作用をどのように示しているかの例である14 。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 容器 </td><td> グルコースmmol / L </td><td> p-値* </td></tr><tr><td>放射状動脈</td><td> 4.49 [4.22,4.84] </td><td></td></tr><tr><td>子宮静脈</td><td> 4.23 [3.94、4.53] </td><td></td></tr><tr><td>臍静脈</td><td>3.78 [3.52、4.06] </td><td></td></tr><tr><td>臍帯動脈</td><td> 3.24 [2.95,3.56] </td><td></td></tr><tr><td> ペアの違い </td><td></td><td></td></tr><tr><td>放射状動脈 - 子宮静脈</td><td> 0.29 [0.13,0.41] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td>臍動脈 - 臍静脈</td><td> 0.54 [0.29,0.76] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td>放射状動脈 - 臍帯動脈</td><td> 1.25 [1.03,1.51] </td><td> &lt;0.001 </td></tr></tbody></table> 表1： グルコースの 中央値[Q1、Q3]濃度および動静脈 差 * Wilcoxon署名順位テスト臍帯循環への（胎盤の放出から）胎児のグルコース取り込みは、母胎 - 胎児勾配、しかし胎盤血流5 。同様に、胎盤重量または出生時体重の関数として胎児のグルコース摂取量を調べることも関連し得る。 n = 128では、総臍静脈流の中央値[Q1、Q3]が196.2 [158.3,232.2] mL /分であり、臍帯循環から胎盤への胎児グルコース取り込みの中央値を計算した。 0.10 [0.05,0.15] mmol /分である。出生時体重については、これは0.03 [0.02,0.04]（mmol /分）/ kgに等しい。胎盤は、胎盤1kg当たり0.16 [0.10,0.26]（mmol /分）を放出する。 胎盤摂取を研究するために4血管法をどのように使用するかの例 動物研究は、グルタミン酸が胎盤および胎児肝臓のアミノ酸の相互変換および他の代謝経路の酸化燃料として重要であることを示唆している27 。胎盤4血管サンプリング法を用いて、我々はヒトにおけるグルタミン酸の胎盤凍結および臍帯動脈の相違（ 表2 ）。我々は、臍循環からのグルタミン酸の胎盤の取り込み（したがって胎児の放出）を見出した。さらに、母体循環からのグルタミン酸の胎盤摂取を見出した。この両方の循環からの胎盤の取り込みは、栄養素の胎盤代謝が経胎盤移植の調節の一部であることをヒトでインビボで実証するために、どのように4血管法を用いることができるかの一例である。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 容器 </td><td> グルタミン酸μmol/ L </td><td> p-値* </td></tr><tr><td>放射状動脈</td><td> 61.5 [51.0,77.7] </td><td></td></tr><tr><td>子宮静脈</td><td> 51.0 [36.3、65.0] </td><td></td></tr><tr><td>臍静脈</td><td> 39.3 [24.7,52.8] </td><td&gt; </td></tr><tr><td>臍帯動脈</td><td> 44.7 [33.1,59.3] </td><td></td></tr><tr><td> ペアの違い </td><td></td><td></td></tr><tr><td>放射状動脈 - 子宮静脈</td><td> 10.4 [1.6,21.2] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td>臍動脈 - 臍帯静脈</td><td> -8.7 [-16.0、0.2] </td><td> &lt;0.001 </td></tr></tbody></table> 表2：グルタミン酸の濃度[Q1、Q3]中央値および動静脈差 * Wilcoxon署名順位テスト 4容器法を用いて胎盤放出を調べる方法の例 胎盤がプロゲステロンを分泌することが確立されており、胎盤の母体側で我々の4血管法を検証するために、本発明者らは、プロゲステロンのin vivo放出を、rm 28 。我々は、母体循環へのプロゲステロンの有意な胎盤放出を見出した（ 表3 ）。観察された動静脈差は、胎盤により放出された物質を検出するために胎盤4血管サンプリング法がどのように使用され得るかを示し、病理学的妊娠を研究する際に非常に重要である。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 容器 </td><td> プロゲステロンnmol / L </td><td> p-値* </td></tr><tr><td>放射状動脈</td><td> 678 [514、971] </td><td></td></tr><tr><td>子宮静脈</td><td> 1852 [1059、2786] </td><td></td></tr><tr><td> ペアの違い </td><td></td><td></td></tr><tr><td>放射状動脈 - 子宮静脈</td><td> -1187 [-1855、-404] </td><td> p &lt;0.001 </td></tr></tbody></table>表3： プロゲステロンの[Q1、Q3]濃度および子宮胎盤動静脈差の中央値 * Wilcoxon署名順位テスト<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig3v2.jpg" /> 図3 ： 参加者と失われた参加者のフローチャートと図解 A.参加者が含まれていることが示され、参加者は主に帝王切開前の就労開始や研究を行うのに十分な人員不足のために失われたことが示されています。 B.正常妊娠完全4-血管の血液サンプルは162（91％）で得られた（青色）（：ブラック、不完全母体血液サンプル：グレー不完全胎児血液サンプル）を有する179人の女性のうち。物的制約のために51名（28％）の参加者が超音波測定に含まれなかった。 12人のうち超音波を受けた8人の参加者（72％）は、すべての参加者（淡緑色）で胎盤側の胎児側の血流測定値を得たが、母体および胎児側の血流測定値はすべて77（60％）、 （濃い緑色）。イラスト：ØysteinH. Horgmo、オスロ大学。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55847/55847fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

我々は、期間中にインビボでヒト胎盤生理学を研究するための詳細な方法を提示する。本方法は、胎盤の母体側および胎児側の入ってくる血管および出る血管から採取した血液採取と、体積血流および胎盤組織サンプリングの超音波測定とを組み合わせる。

ヒト胎盤生理学の統合研究への4容器サンプリングアプローチ<em&gt;インビボ</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

the-4-vessel-sampling-approach-to-integrative-studies-human-placental

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K ビュー.  Oslo University Hospital. 我々は、期間中にインビボでヒト胎盤生理学を研究するための詳細な方法を提示する。本方法は、胎盤の母体側および胎児側の入ってくる血管および出る血管から採取した血液採取と、体積血流および胎盤組織サンプリングの超音波測定とを組み合わせる。 

ビデオ: The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

単一絨毛膜性のツイン胎盤の血管のマッピングのためのガイドワイヤ補助カテーテルと有色色素注入

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

医学

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia polycythemia sequence (TAPS)1,2. Injection studies of twin placentas have shown that such anastomoses are almost invariably present in monochorionic twins and extremely rare in dichorionic twins1. Three types of anastomoses have been documented: from artery to artery, from vein to vein and from artery to vein. Arterio-venous (AV) anastomoses are unidirectional and are referred to as "deep" anastomoses since they proceed through a shared placental cotyledon, whereas arterio-arterial (AA) and veno-venous (VV) anastomoses are bi-directional and are referred to as "superficial" since they lie on the chorionic plate. Both TTTS and TAPS are caused by net imbalance of blood flow between the twins due to AV anastomoses. Blood from one twin (the donor) is pumped through an artery into the shared placental cotyledon and then drained through a vein into the circulation of the other twin (the recipient). Unless blood is pumped back from the recipient to the donor through oppositely directed deep AV anastomoses or through superficial anastomoses, an imbalance of blood volumes occurs, gradually leading to the development of TTTS or TAPS. The presence of an AA anastomosis has been shown to protect against the development of TTTS and TAPS by compensating for the circulatory imbalance caused by the uni-directional AV anastomoses1,2. 
Injection of monochorionic placentas soon after birth is a useful mean to understand the etiology of various (hematological) complications in monochorionic twins and is a required test to reach the diagnosis of TAPS2. In addition, injection of TTTS placentas treated with fetoscopic laser surgery allows identification of possible residual anastomoses3-5. This additional information is of paramount importance for all perinatologists involved in the management and care of monochorionic twins with TTTS or TAPS. Several placental injection techniques are currently being used. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of (residual) vascular anastomoses using colored dye injection.

Twin-to-twin transfusion syndrome and twin anemia polycythemia sequence are two potentially devastating problems in perinatal medicine. Both disorders occur only in monochorionic twins and result from unbalanced blood flow through placental vascular anastomoses. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of vascular anastomoses using colored dye injection of placental vessels after birth.

カラー染料を使用して単一絨毛膜性の胎盤における血管吻合の正確かつ簡単に評価

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

生物学

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

生物工学

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

発生生物学

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

免疫・感染学

フローベースアプローチによるex vivo胎盤外植片培養の改善

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

著者スポットライト:胎盤組織におけるシングルセルシーケンシングと空間的組織学による研究の進展 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

ヒト胎盤生理学の統合研究への4容器サンプリングアプローチ

要約

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単一絨毛膜性のツイン胎盤の血管のマッピングのためのガイドワイヤ補助カテーテルと有色色素注入

カラー染料を使用して単一絨毛膜性の胎盤における血管吻合の正確かつ簡単に評価

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

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三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

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プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

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げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

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Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定