我々の方法は、マウス胚性幹細胞から心臓フィールド特異的心臓前駆細胞を生成することを目的としている。この心臓フィールドレポーター幹細胞ラインは、先天性心疾患の根底にあるメカニズムのハイスループット研究を可能にし、遺伝的および薬理学的操作に適したシステムを提供する。いくつかのチャンバー固有の先天性心疾患があります。
このプロトコルは、インビトロでの心新生を再現することにより、疾患メカニズムの研究と将来の再生療法の開発を可能にする。このプロトコルは、異なるチャンバーの心臓前駆細胞が心臓の発達中にどのように指定されるかについての洞察を提供することができる。2i培地で0.1%ゼラチンコーティングT25フラスコでトランスジェニックマウス胚性幹細胞を増殖させることから始めます。
細胞が70〜80%合流に達したら、PBSで培養液をすすい、フラスコあたり1ミリリットルのトリプシンを加えて、37°Cで単一細胞に培養を解約する。細胞が剥離したら、DMEMで4ミリリットル10FBSで反応を中和し、適切な方法で細胞を数える。新鮮な培地濃度ごとに5個の細胞に約3倍10倍に希釈し、遠心分離により細胞を回収する。
その後、新しい0.1%ゼラチンコーティングT25フラスコに再めっきするために新鮮な2i培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁します。心臓スフェロイドからのCPC生成の場合、遠心分離によって切り離されたトランスジェニックマウス胚性幹細胞サンプルの6個に2.5回10を収集し、25ミリリットルのSFD培地で細胞を再懸濁する。セル懸濁液を150~25ミリメートルの無菌プレートに1枚に入れ、摂氏37度でインキュベーションし、5%の二酸化炭素を48時間加熱します。
インキュベーションの終わりに、心臓の回転楕円体を円錐形の管に集める。遠心分離によってスフェロイドを沈下し、スフェロイドの選択的な単離を促進し、単一細胞を回避する。スピフェロイドを、アクチビンAのミリリットル当たり1ナノグラム、骨形態形成タンパク質4の1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを添加した新鮮なSFD培地の25ミリリットルで再懸濁する。
スフェロイドを同じ培養プレートに再プレートし、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。翌日、心筋分離によってすべての心臓回転楕円体を思い出す。分化した胚体を、超低い付着体でめっきするための新鮮なSFD培地25ミリリットルで再懸濁し、細胞培養インキュベーター内の75センチメートル平方フラスコを48時間再中断する。
蛍光レポーターを用いた心臓フィールド特異的CPCの分離については、遠心分離により胚体を採取し、37°Cでトリプシンを1ミリリットルで3D培養物に3分間解離する。インキュベーションの終わりに、ピペット処理を行って細胞を解約し、DMEMで10%FBSの4ミリリットルで反応を中和します。70マイクロメートルのストレーナーの上に混合物を渡して、解心しない胚体を除去し、遠心分離によって濾過された細胞を沈下する。
蛍光レポーター発現でCPCを選別するには、ペレットを500マイクロリットルFACS溶液で再懸濁し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して氷上の5ミリリットルポリスチレン丸底管に細胞を濾過します。次に、細胞を並べ替えてFACSによってRFPおよびGFP発現細胞を単離し、1ミリリットルのFBSで細胞を収集する。表面タンパク質Cxcr4発現に基づいて第1の心臓界CPCを分離するために、蛍光共役抗Cxcr4抗体を補ったPBS中の100マイクロリットルの10%FBSにおける単一マウス胚性幹細胞RFP発現心臓前駆細胞を再懸濁する。
室温で5分後、1回の新鮮で冷たいPBSの1〜2ミリリットルで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、FACS溶液500マイクロリットルで細胞を再懸濁し、40マイクロメートルのストレーナーを通して5ミリリットルの丸底チューブに細胞をフィルター処理します。次に、Cxcr4発現で細胞をソートし、Cxcr4陽性集団と負母集団の両方を、氷上のチューブあたり1ミリリットルのFPSを含む個々のチューブに収集します。
FACS単離された心臓フィールド特異的心臓前駆細胞を再培養するには、遠心分離によって選別された細胞を収集し、SFD培地中のペレットを再懸濁する。その後、0.1%ゼラチンコーティングされた384ウェルプレートに4つの細胞あたり約30倍を播種します。細胞死の増加が選別後に注目される場合は、各ウェルに10マイクロモルROCK阻害剤を加える。
2日間の培養の後、自発的な殴打を観察すべきである。メッキされたCPCが心筋細胞に分化する能力を分析するために、トリプシンによる分化の12日目に細胞を収集し、示されているように、単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を単離し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を再懸濁させる。室温で30分後、遠心分離により固定細胞を採取し、PBSでペレットを洗浄して過剰な固定剤を除去する。
次に、PBSで細胞を10%FBSで再懸濁し、マウス抗トロポニンT抗体で細胞サンプルの半分をインキュベートし、残りの半分のサンプルを陰性対照として使用する。室温で30分後、新鮮なPBSで細胞を2回洗浄し、適切な二次抗体を加えた10%FBSプラスPBSでサンプルを再懸濁します。室温でさらに30分間のインキュベーションの後、洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を2回洗浄し、フローサイトメーターで分析するためにチューブあたり200マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。
約132時間分化した後、Tbx1-RFPおよびHcn4-GFP心臓前駆細胞は蛍光顕微鏡で検出することができる。一般的に、GFP細胞とRFP細胞は、ほぼ同時期に出現し、前駆細胞の2つの集団は、近接して、典型的には相補的なパターンで拡大し続ける。アクチビンAと骨形態形成タンパク質4の濃度を調整すると、第1心臓フィールド心臓前駆細胞の割合が変化する。
同様に、RFPレポーターマウス胚性幹細胞株を用いて、132時間分化後、RFP陽性心臓前駆細胞が現れる。Cxcr4の免疫染色後、RFP陽性、Cxcr4陽性、およびRFP陽性、Cxcr4陰性細胞を単離することができます。分化の12日目の心臓トロポニンTの免疫染色は、最初の心臓フィールド細胞が主に筋細胞に分化することを確認する。
同様に、RFP陽性、Cxcr4陰性心前駆細胞に由来する細胞は、Cxcr4単一陽性心臓前駆細胞と比較してはるかに高い割合で心筋細胞を生じさせる。時折、マウス胚性幹細胞は効率的に分化できず、心臓フィールド特異的な心臓前駆細胞の数が非常に少ない。サイトカインの添加のタイミング、濃度、および一貫性と細胞の数は、チャンバー特異的心臓前駆細胞の生成を成功させるために重要です。
この手順に従って、研究者は心臓前駆細胞の異なる集団の生理学的特性を分析し、その仕様および機能に関するさらなる洞察を得ることができる。
