著者らは、低酸素室装置を提供してくれたNai-Sum Wong博士と技術サポートのためのAlice Luiさんに感謝したいと思います。

動物を含むすべての処置は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに厳密に準拠して実施され、香港大学の医学のLi Ka Shing教授のための生きた動物の使用に関する委員会によって承認された。インフォームドコンセントを得た後、健康なドナーの腸骨稜からヒト骨髄サンプルを得た。議定書は、香港大学の制度審査委員会の承認を受けています。 1.ラットMSC培養液の調製<ol><li> 大腿骨からのMSCの収穫 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての切開ツール（ すなわち、はさみ、鋭い切開はさみ、および歯を切った鉗子）をオートクレーブする。 </li><li> 15％ウシ胎仔血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S、1％v / v）を補充した最小限の必須培地α修飾（αMEM）を含むMSC増殖培地を調製する。）。 </li><li>ペントバルビタールの過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）により、若い雄Sprague Dawleyラット（体重200〜250g）を犠牲にする。 注：異なるラットの骨髄サンプルは別々に処理する必要があります。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。腹部と下肢を70％エタノールで完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、内側の太ももの上の皮膚と皮下組織を削除します。大腿筋が露出するまで、大腿筋を円周方向に外します。膝と股関節が見えるまで、この近位および遠位に継続する。大腿骨を股関節と膝関節に通し、鋭利な先端を切って切り取ってください。 注：この段階で大腿骨を切開して骨髄腔を露出させないでください。インタクトな大腿骨を層流組織培養フードに移し、さらなる処理を行う。 </li><li>骨幹端部を通って大腿骨の遠位端および近位端を横断するために、尖った切断されたはさみを使用する。 </li><li> 70μmセルストレーナーを50mLコニカルチューブの上に置きます。露出した大腿管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10mM Na 2 HPO 4 、pH7.4）を含む21G、10mLシリンジを挿入し、洗浄を繰り返すことによって円錐管に骨髄内容物を洗い流す。 注：各大腿骨を洗い流すために約20mLのPBSを使用する。洗い流された内容物の色が血液で汚染されて濁っている場合、より大きな容積を使用することができる。 </li><li> 480 xgで5分間遠心分離して細胞を集める。上清を捨てる。細胞ペレットを10mLのMSC増殖培地に再懸濁する。 10cmの組織培養皿に細胞をプレートする。組織培養皿を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に入れる。メッキの最初の日を0日目として記録する。 注：遠心を含むすべてのステップで、ブレーキを最大減速に設定します。 </li></ol></li><li> MSCコロニーの設立と拡大 注：このプロトコルr骨髄腔内からMSCを選択するための手段として、組織培養プラスチック粘着性を欠く。骨髄の内容物を組織培養プラスチックに2日間付着させる。 <ol><li> 2日目に、10mLのPBSで培養プレートを3回すすぎ、非接着細胞を除去する。すすいだ後、PBSを10 mLのMSC増殖培地に交換する。細胞をPBSで洗浄し、3日ごとにMSC増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目に見えるはずです（ 図2A ）。 </li><li>増殖培地を除去し、細胞をPBSですすぐことにより、10日目までに細胞を通過させる。組換え酵素細胞解離試薬1.5mLを添加し、37℃で5分間インキュベートする。反応を中和するために3mLのMSC増殖培地を添加する。 250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 </li><li> PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 40,000細胞/ cm 2の密度で継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレートに継代した。 注：ラットのMSCは継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである（ 図2B ）。細胞は、最大8継代について、工程1.2.2に記載されているように継代することができる。 MSCは、免疫細胞化学および三分化分化能力を特徴とすることができる（ 図3 ） 12 。第3および第8継代の間のMSC培養物のみが、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮の対象となる。より大きい継代数のMSCは、平らな形態をとっており（ 図2C ）、十分な数の神経前駆細胞を産生しない。これらの培養物は捨てるべきです。 </li></ol></li></ol>ヒトBMSC培養物の調製<ol><li> 1mLのヒト骨髄を9mLのMSC増殖培地で希釈し、細胞を10cmの組織培養皿上に置いた。細胞培養器（37℃、5％CO 2 ）で培養物を維持する。 </li><li> 2日後に培地を除去し、10mLのPBSで培養液を3回穏やかにすすいで非接着細胞を除去する。最後のすすぎ後、PBSを除去し、10mLのMSC増殖培地と交換する。 PBSすすぎ後の培養3日ごとに増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目まで可視でなければなりません。コロニーの数は被験者によって異なる場合があります。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、10日目に細胞を通過させる。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレート上に40,000細胞/ cm 2の密度で播種する。 注：ヒトMSC（ 図2D ）は、ラットMSCと同様の形態を示し、同様に、継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである。彼らは奇妙でなければならない免疫細胞化学および三重化分化のためのそれらの能力によって凍結される12 。ラットのMSCと同様に、第3および第8継代間のヒトMSCは、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮に供される。 </li></ol> 3.低酸素プレコンディショニング<ol><li>リングクランプを外した後、低酸素チャンバーの部品（ベース、フタ、トレイ）を分解し、70％エタノールで個々の部品をきれいに拭きます。チャンバ構成要素を、層流組織培養フード内に置き、UV光下で15分間滅菌する。 </li><li>低酸素プレコンディショニングの前に、培地を除去し、10mLのPBSでラットおよびヒトMSC培養物（セクション1および2）をリンスする。 PBSを、25mMのHEPESを補充した10mLのMSC増殖培地で置換する。 注：10cm皿上で培養されたMSCは、低酸素プレコンディショニングの対象となる前に80〜90％のコンフルエントに達しているはずです。 </li><li>カウルを置く低酸素室の中で皿を作る。チャンバーのコンポーネントを再構成し、リングクランプを締めます。 99％N 2 /1％O 2のガス混合物を10L /分の流速で5分間チャンバ内に流す。 </li><li>低酸素室の接続端をシールして、ガス漏れがないことを確認します。チャンバーを細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）の中に16時間置く。 </li><li>低酸素プレコンディショニングが完了したら、その後の神経前駆細胞濃縮培養に備えて培養液をチャンバーから取り出す。 </li></ol> 4.神経前駆細胞濃縮培養<ol><li> B27（2％v / v）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、20 ng / mL）、上皮成長因子（EGF、BGF）を補充したダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養混合物F12（DMEM / F12） 20 ng / mL）、およびP / S（1％v / v）であった。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、低酸素プレコンディショニングラット/ヒトMSCを分離する。250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 6,000細胞/ cm 2の密度で、神経前駆細胞および細胞を低付着性の6ウェルプレートに再懸濁する。培養物を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に12日間置く。 3日ごとに神経前駆細胞の75％を補充する。 注：サイズの大きい非接着性細胞クラスターは、6-7日目まで観察されるべきである。 10〜12日目までに、直径が100μm以上のニューロスフェアを観察することができます（ 図4 ）。低酸素プレコンディショニングMSCは正常酸素条件下で培養されたMSCと比較してより多くのニューロスフェアを生じるはずである9 。 </li><li> 10日目のピペットに吸引し、15 mLコニカルチューブに移すことにより、12日目に神経球を収集する。神経球を250xgで5分間遠心分離する。 注：ニューロスフェアは、ネスチンおよびGFAPなどの神経前駆マーカーについて12日目に特徴付けられた。 </li></ol> 5. DRGニューロンと共培養による運命決定シュワン細胞の作製<ol><li> 精製ラットDRGニューロンの調製 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての解剖器具（ すなわち、解剖はさみ、鉗子、2つの顕微解剖鉗子、およびマイクロダイシングハサミ）をオートクレーブする。 </li><li>ポリ-D-リシン（PDL、PBS中10μg/ mL）を含む6ウェル組織培養プレートを4℃で一晩コートする。 PDLを除去し、1ウェルあたり1.5mLのPBSですすぐ。 </li><li>プレートをラミニン（PBS中10μg/ mL）で37℃で2時間コーティングすることにより続行する。 1ウェルあたり1.5mLのPBSでプレートをすすぐ。 </li><li> B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％v / v）、神経成長因子（NGF、20ng / mL）およびP / S（1％v / v）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン維持培地を調製する。 ％v / v）。 </li><li>B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％）、NGF（20ng / mL）、P / S（1％）、フルオロデオキシウリジン（FDU、10）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン精製培地を調製する。 μg/ mL）、およびウリジン（10μg/ mL）である。 </li><li>妊娠中のラットを第14-15妊娠期にペントバルビタール過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）で屠殺する。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。 70％エタノールで腹部を完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、動物の下腹壁を縦に切る。解剖はさみを使用して子宮を特定し、除去する。子宮の壁を切断して胚を露出させ、抽出する。 PBSで満たされた滅菌10cm培養皿に胚を移す。培養皿を氷上に置きます。 </li><li>解剖用の胚をPBS（室温）で満たした滅菌10 cm培養皿に移し、解剖顕微鏡の下に置く。胚を伏せやすい位置に置いてください。 NOTE：白っぽい脊髄および付着したDRGは、その半透明な皮膚を介して、胚の背側に見える。 </li><li>脊髄のいずれかの側に沿ってmicrodissecting鉗子を挿入し、周囲の軟部組織から脊髄を分離し始めるために鈍的な解剖を使用してください。頚部の開口部と尻尾のスタブに沿ってマイクロ鉗子を使用して動物から脊髄を切断します。周囲の柔らかい組織からそれを解放するためにコードの腹側の面にさらに鈍的な解剖を行います。 </li><li>解放された脊髄の背側の面に残っている柔らかい組織を除去するためにマイクロダイシング鉗子を使用してください。 注：この段階では、脊髄、神経根、および付着したDRGのみが残るはずです。 </li><li> microdissecting鉗子を使用して、それらの接続神経根から個々のDRGを切り離します。 PBSを含む1.5mLの滅菌遠心分離管にDRGを移すために、1mL先端に取り付けられたピペットペンを使用する。 注：各1.5 mLチューブについて、最大100のDRGを収容できます。 </li><li> 5分間250xgでDRGを遠心分離し、組換え酵素細胞解離試薬（200μL/チューブ）にそれらを再懸濁する。 10分間インキュベートする（37℃、5％CO 2 ）。 250×gで5分間DRGを遠心分離し、上清を除去し、DRGニューロン維持培地に再懸濁する。 200μLピペットチップを用いて穏やかに粉砕することによりペレットを解離させる。適切な希釈後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのDRGニューロン維持培地中のPDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレートに5,000細胞/ cm 2の密度で細胞を播種する。培養2日後、DRGニューロン維持培地を除去し、PBSですすぎ、DRGニューロン精製培地で置き換える。 注：精製サイクルごとに、DRG培養物を精製培地で2日間処理し、続いてメンテナンス培地で1日間インキュベートする。 3-4回の精製サイクルの後、remすべての内因性グリアの楕円形が予想される7 。これには約14日かかります。精製された培養物は、ニューロンマーカーTUJ1に対して陽性であり、S100β発現には存在しない（ 図5 ）。 </li></ol></li><li> シュワン細胞様細胞の生成 <ol><li> β-ヘレグリン（100ng / mL）、bFGF（10ng / mL）、血小板由来成長因子（PDGF-AA、5ng / mL）、FBS（10％）、及びα-D-セレクチンを補充したαMEMからなるグリア誘導培地を調製する。 P / S（1％v / v）。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのグリア誘導培地中、5〜10球/ cm 2の密度で、PDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレート中のセクション4で調製したニューロスフェアをプレートする。 PBSで細胞をすすいだ後、グリア誘導培地を2日ごとに交換する。 注：播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外向きに移動することが見られる。7日目までに、移動性細胞はテーパ状の外観を有し、シュワン細胞に対する免疫陽性を示すはずであるマーカーp75ニューロトロフィン受容体（p75）およびS100β7。これらのセルはSCLCと呼ばれます。 </li></ol></li><li> SCLCとDRGニューロンとの共培養 <ol><li> DRGニューロン維持培地（ステップ5.1.4）およびグリア誘導培地（ステップ5.2.1）からなる共培養培地を1：1の体積対体積比で調製する。 </li><li> FBS（5％）、β-ヘレグリン（10ng / mL）およびP / S（1％v / v）を添加したDMEM / F12からなるシュワン細胞維持培地を調製する。 </li><li> 7日目のSCLCから培地を除去し、PBSですすぎ、37℃で5分間、組換え酵素細胞解離試薬0.5 mL /ウェルと共にインキュベートする。共培養培地中にSCLCを再懸濁する。 </li><li>適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li> SCLCを精製されたDRGニューロン培養上に1,000細胞/ cm 2の密度でシードする。共培養を14日間維持し、培地交換は2日ごとに行う。 注：共培養の間、SCLCsは、成熟シュワン細胞の典型的な紡錘体様形態を獲得した（ 図6 ）。これらの細胞は、成長因子の回収後に表現型を維持し、 インビトロおよびインビボで軸索をミエリン化することができる7,10。シュワン細胞マーカー（ すなわち、 p75およびS100β）の陽性は、免疫蛍光によってモニターされるべきである。 </li><li>共培養が完了すると、ステップ1.2.2に記載されている通り、運命決定されたシュワン細胞を通過させる。 1ウェルあたり0.5 mLの解離試薬を使用する。適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li>運命決定されたシュワン細胞をシュワン細胞維持培地に10,000細胞/ cm 2の密度で再懸濁する。免疫蛍光のために細胞をPDL /ラミニンでコートした6ウェルプレートに植えます。 注：共培養には必然的に線維芽細胞を採取したMSCが含まれている細胞運命7 。これらの細胞は、同時培養の完了時に運命決定シュワン細胞と一緒に継代される。この線維芽細胞の上に横たわるシュワン細胞は、他の場所で記載されているように、PBSの「コールドジェット」（4℃）ですすぎ洗いした後、容易に剥がすことができる。運命決定されたシュワン細胞は、維持培地中で1ヶ月間増殖させることができる。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+transplantation:+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury?.">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?.</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li><li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair:+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus.">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation?.">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?.</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li><li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li><li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation.">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li><li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem/progenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia/ischemia.">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li><li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy.">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves.">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li><li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning.">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).</li><li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells.">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection:+phenotype,+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential.">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li><li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mesenchymal+stem+cells:+characterization,+differentiation,+and+application+in+cell+and+gene+therapy.">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li><li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+jet:+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic,+apoptosis-inducing+drug+treatment.">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li></ol>

この原稿のすべての著者は、宣言するための開示がありません。

低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである。一般的に、我々は、8を超える通過数を有するMSCを利用しない。それらの幹細胞性を維持するために、MSCが100％コンフルエンスに達する前に速やかにMSCを通過させることが重要である。逆に、MSCを低すぎるコンフルエントに維持することは望ましくない。私たちの経験から、40,000細胞/ cm 2の密度でMSCを播種するか、または1：2の比率で80％コンフルエントな細胞を単純に継代培養することにより、最良の結果が得られる。 DRGネットワ​​ークの適切な確立と維持は評論家です共培養の成功の決定因子である。 DRG収穫に必要な時間は最小限に抑える必要があります。個々の神経節は、神経根のみを扱うのが最善であるときに、特に脊髄からの分離中に、非外傷様式で取り扱われるべきである。長期間の収穫は、組織浸軟および細胞生存率の低下をもたらすので、一般に、我々は、動物屠殺時と収穫DRGの酵素消化時との間に2時間未満を目標とする。培養中の基層からのDRGニューロンの分離はしばしば遭遇する。これが起こらないようにするために、コーティングは組織採取時に新しく調製し、実施しなければならない。一般に、大きな、未消化のDRGクラスターはより頻繁に分離し、共培養の成功をもたらさない。酵素消化の持続時間および粉砕の量は、 図5のような外観を有するネットワークを達成する目的で調整することができる。 私たちのcocu一貫して運命決定を誘導し、並行して行われる培養の20〜30％のみが運命決定シュワン細胞を産生する7,13。したがって、我々は十分なDRGおよびSCLCを準備し、同時に3〜4個の6ウェル培養プレート中で共培養を行う。私たちは、胚の年齢、細胞生存率、密度、およびトポグラフィを含む基礎となるDRGネットワ​​ークに関連する因子の組み合わせが共培養成功に影響を及ぼすと仮定する。これらの根底にある変数は、さらに調査し、標準化する必要があります。共培養収量の制限とは別に、ラット由来のDRGニューロンおよび動物産物の必要条件を置き換える手段を探さなければならない。さらに、プロトコルの期間を短縮する必要があります。我々のプロトコールの簡略化された改変として、我々は、SCLCの以前の世代なしに、精製DRGニューロンに直接播種した10日目のニューロスフェアから成熟シュワン細胞を誘導することに成功した我々の方法によって濃縮されたニューロスフェアは、ニューロンおよびグリア系譜の細胞の堅牢な供給源として役立つ。前駆細胞を運命に導くための我々のプラットフォームは、その固有のリスクを伴う遺伝子操作を回避するという利点を有し、細胞移植は、細胞移植、疾患モデリング、およびグリア分化の研究に関連する。

神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i）幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii）それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である3 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。 MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する<html>脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能6 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。 損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する2 。 SCLCは、グリオジェニック因子（ すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA）を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経8内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン7を共培養SCLCに導き、ass = &quot;xref&quot;&gt; 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro 7,9およびin vivo 10で機能を示す 。 MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:140px;">Sigmaaldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4526</td>
			<td style="width:329px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1280/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>17504-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B/100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nerve growth factor (NGF)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heregulin beta-3, EGF domain (&#946;-Her)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Fluro-2&#39; - deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P7886-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin / streptomycin (P/S)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Express</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm plate for adherent culture</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well plate for adherent culture</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Used for expansion of MSCs following passaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>Used for neural progenitor enrichment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD90(Thy-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human/rat STRO-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human nestin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD90(Thy-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat nestin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-S100&#946;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-p75</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human nuclei</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

この原稿は、骨髄間質細胞（MSC）集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態（16時間酸素1％）を与え、続いて表皮成長因子（EGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子（PDGF）を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞（SCLC）を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節（DRG）ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。

我々のプロトコルの重要なステージの概要を図1に示します。要約すると、ラットおよびヒトMSCは、組織培養プラスチックの接着によって選択される。拡張されたMSCは、低酸素状態で前処理され、次いで、ニューロスフェア形成条件に供される。ニューロスフェアをプレートし、SCLCに分化させる。 SCLCは、精製されたDRGニューロンと共培養され、運命決定されたシュワン細胞を生成する。 培養したラットおよびヒトMSCの形態を図2に示す 。彼らの健康なテーパード形態は、多分化能を失った高継代数について維持されたMSCの四角形の外観と対照的に示される。拡大したラットおよびヒトのコロニーは、造血幹細胞マーカーの欠如であるMSCマーカーの発現および三倍化のための能力を示すべきであるferentiation（ 図3 ）。第3および第8継代間の健康なMSCは、16時間低酸素プレコンディショニングを受け、その後、EGF / bFGF補充を伴う低付着性培養プレート上に継代される。低酸素プレコンディショニングの結果、ニューロスフェアの数が多くなり、平均ニューロスフェアのサイズも大きくなります（ 図4 ）。 ニューロスフェアをPDL /ラミニン被覆培養プレート上にプレーティングし、β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AAを含有するグリア誘導培地中での培養によってSCLCになるように誘導する。 SCLCは、シュワン細胞および対応するマーカー発現の特徴的なテーパー形態を示すが、表現型的に不安定であり、成長因子の中断時に線維芽細胞表現型に戻る知覚ニューロンとの共培養は、細胞内因性のswを引き起こすための前提条件であるコミットメントを運命にかゆみがある。精製されたDRGネットワ​​ークの確立は、FDUおよびウリジンによるパルス処理によって達成され、内在性グリアを除去し、S100β免疫陽性の非存在によって確認されるべきである（ 図5 ）。 7日目に、SCLCを継代し、精製したDRGニューロンと14日間共培養する（ 図6 ）。共培養が完了すると、成熟した運命を守ったシュワン細胞が出現するはずである。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55794/55794fig1.jpg" /> 図1：プロトコルの概要。骨髄は、ラット大腿骨またはヒト腸骨稜吸引液のいずれかから得られる。骨髄内のMSCは、組織培養用プラスチックに付着して拡張することができる。神経ポテンシャルを有するMSCを濃縮するために、細胞を1％O 2中で16時間前処理し、次いで、低付着性培養液p1に継代するbFGF / EGFを補充した。これにより、ニューロスフェアが形成され、PDL /ラミニン被覆組織培養プラスチック上にプレートされ、グリア誘導培地中で培養されてSCLCが生成される。 SCLCを継代し、精製されたDRGニューロンと2週間共培養して成熟に導く。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55794/55794fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55794/55794fig2.jpg" /> 図2：MSCコロニーの樹立。組織培養プラスチック上に骨髄細胞を移植してから6〜7日後に、大きさのMSCコロニーが見えるようにすべきである。ラットMSCコロニーの代表的な画像が示されているが（ A ）、ヒトコロニーは同様の外観を示す。 10日目にコロニーを継代することができる。より高い倍率で見ると、両方のラット（B ）およびヒト（ D ）MSCは、継代後に特徴的な線維芽様様形態を示す。高い継代数で維持されているMSCは、平らな四角形の形態（ C ）を獲得し、捨てるべきである。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55794/55794fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55794/55794fig3.jpg" /> 図3：MSCの特徴付け。 （ A〜D ）ヒトMSCの代表的な画像。 MSCは、CD90（ A ）、CD73（ B ）、およびStro-1（ C ）のような適切なマーカーの発現、およびCD45（ D ）のような造血幹細胞マーカーの非存在によって特徴付けられ得る。 （ E - G ）ラットM（ E ;脂質沈着物がスーダンレッドで染色されている）、骨芽細胞（ F ;アリザリンレッドで染色された細胞周囲マトリックス）、および軟骨細胞（ G ;サフラニン-Iで染色されたプロテオグリカン）を示し、 O）を適切な培養条件下で培養する。スケールバー=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55794/55794fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55794/55794fig4.jpg" /> 図4：MSCからの神経前駆細胞の濃縮。ラット（ A ）およびヒト（ C ）MSCの両方は、EGF / bFGFを補充した培地中の低付着組織培養プラスチック上で培養すると神経球を形成する。ラットの数および平均直径（ <strong&gt; B）およびヒト（ D ）球は、球誘導の前にMSC（16時間、1％O 2 ）の低酸素プレコンディショニングによって増強される。スケールバー=200μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55794/55794fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55794/55794fig5.jpg" /> 図5：精製されたラットDRGネットワ​​ークの樹立。精製されたDRGネットワ​​ークは、抗有糸分裂剤FDUおよびウリジン（A）によるパルス処理後に確立される。 S100βを発現する内因性グリア（B）を欠いている神経突起ネットワークは、SCLCとの共培養のための準備が整っている。スケールバー=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55794/55794fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 図6：DRGニューロンとの同時培養による骨髄由来のシュワン細胞の生成。精製DRGニューロンおよびヒトSCLCとの共培養2週間後、紡錘形の運命決定シュワン細胞が正常酸素および低酸素処置群（ AおよびD ）の両方から出現する。これらの細胞は、シュワン細胞マーカーp75（BおよびE）およびS100β（CおよびF）を発現する。ヒト核抗原（HuNeu）の発現は、S100β陽性細胞がラットDRGに由来するグリア細胞を汚染していないことを示している。スケールバー=100μm。

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Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K ビュー.  The University of Hong Kong. 骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...