国立衛生研究所によって提供された資金 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. に)、バイオ テクノロジーにおける教育研究のカリフォルニア州立大学プログラム (CSUPERB: D.L.S. 脊椎動物の造血ニッチの分子制御)大学院の研究室 (A.C.B.)、カリフォルニア州立大学チコ校でから。

カリフォルニア州立大学、Chico、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 諮問委員会は、以下に述べるすべての方法を承認しました。
1. 漂白剤 48 hpf ゼブラフィッシュ胚
<ol><li>15 cm (w) x 15 cm (l) 7 cm (h) プラスチック容器 × 3 の洗い場を作成: 1000 mL 胚中 (E3;表 1参照) で 5% の漂白剤の 1 mL と 1)、2) 滅菌 E3 と 3) 滅菌 E3。胚が水没する溶液 500 mL を各コンテナーにいるを確認します。 注: テスト条件ごとに、少なくとも 10 の胚が必要でしょう。この洗浄方法は、最大 200 の胚を収容できます。</li>
	<li>転送ピペット茶漉しに胚を配置し、5 分 (内の胚) と茶漉しを削除し、洗浄駅 #2; 5 分間の手洗い所 #1 の卵が水没最後の 5 分間洗浄駅 3 番に繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄後茶漉しクリーン 10 cm シャーレを逆さま回すと胚を優しく洗浄からすすぎ胚は滅菌 E3 と茶漉しと転送ピペットをオフします。</li>
</ol>2. Dechorionate 胚
<ol><li>転送ピペットと削除し、シャーレからできるだけ多くの E3 を破棄、胚に dechorionation プロテアーゼ (10 mg/mL) 500 μ L を追加します。5 分は軽く絨毛を完全に削除するシャーレの側の室温で孵化させなさい。</li>
	<li>血清ピペット滅菌 E3 プロテアーゼを希釈するの 20 mL を追加します。胚を解決することを許可し、転送ピペットで E3 を削除します。このステップを 3 回繰り返します dechorionation プロテアーゼの痕跡をすべて削除します。</li>
</ol>3. 胚サンプルの準備
<ol><li>P1000 ピペットを使用して、単一の滅菌 1.5 mL 遠心チューブに 10 胚を配置します。</li>
	<li>ピペットで E3 を削除し、破棄します。 注意: ピペット ケアでの胚は容易に転置され、次の洗浄手順中に破棄されます。</li>
</ol>4. 解離過程の胚の準備
<ol><li>層流フードのサンプルを転送し、1 mL を追加することによって胚を洗って滅菌 E3。P1000 ピペットで上澄みを外し、管の底に沈殿する胚を許可します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄後、E3 を削除し、破棄します。粘液コーティング (胞子、酵母やそれに閉じ込められる可能性があります細菌) 周囲の萌芽期のゼブラフィッシュを削除する E3 で 10 mM ジチオトレイトール (DTT) の 1 つの mL を追加します。微量遠心チューブを水平に置くし、層流フードの 25 分間室温でインキュベートします。</li>
</ol>5. 胚解離
<ol><li>サンプル (Ca2 +と Mg2 +) を持つ滅菌 DPBS 1 mL で 3 回洗います。最後の洗浄後 (Ca2 +と Mg2 +) の DPBS の 500 μ L と 5 mg/mL (26 U/mL) 解離プロテアーゼの 5 μ L を追加します。 注意: この酵素は、Ca2 +と Mg2 +を必要があります、ので、DPBS にこれらのイオンが含まれていることを確認します。</li>
	<li>層流フードで 60 分位サンプルの 180 rpm 水平軌道シェーカーで 37 ° C でサンプルをインキュベートし、サンプルは完全に分離されるまで、P1000 を持つ胚をカップ刻んだ。 注意: は、彼らが解離になるときを判断する定期的に胚を確認します。胚ソリューションの組織の存在のいくつかの量が必要それは、完全に均質なしないでください。過剰のダイジェスト (補足図 1を参照) の HSPCs を破壊します。</li>
</ol>6. 解離胚の準備
<ol><li>5 mL ポリスチレンの上部の貯水池にピペット、10 解離胚はラウンド 35 μ m の細胞のストレーナー キャップと底部チューブです。</li>
	<li>ピペット、リンス (いいえ Ca2 +や Mg2 +) を持つ滅菌 PBS と転写液 5 mL ポリスチレン管を含むペトリネット チューブ フィルター ステップ 6.1 からの細胞。液 4 mL、5 mL のポリスチレン管に存在までを繰り返します。 注: PBS、DPBS、または他の等張バッファー ソリューション可能性があります使用するこの段階で彼らは、Ca2 +や Mg2 +を含まない限り、
</li>
	<li>4 ° C および均質化細胞サンプルをペレットに 5 分間、300 x g でチューブを遠心します。ピペット、削除、丸底チューブから上澄みを廃棄します。チューブの下部に小球形細胞を妨害しないように注意してください。100 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
</ol>7. セルロースの調製
<ol><li>完全なセルロース (表 1) 原液 x 1 を生成し、16 G 針、3 mL シリンジと滅菌丸底 14 mL チューブに 2.5 mL を追加します。テスト条件ごとに 1 つの管を使用します。</li>
	<li>
サイトカイン、小さい分子、または各サンプルを調査する他のエージェントを追加します。
	<ol>
<li>骨髄性分化 1% 鯉血清および 0.3 mg/mL 組換えゼブラフィッシュ顆粒球コロニー刺激因子 (Gcsf)34メチル セルロース培地を追加します。スヴォボダらを参照してください。37鯉血清および組換えサイトカインを生成する方法について完全な説明のため。</li>
		<li>赤血球分化・ メチル セルロース培地に 1% 鯉血清と 0.1 mg/mL 組換えゼブラフィッシュ エリスロポエチン (Epo)38を追加します。</li>
		<li>血液前駆細胞を調べると、Epo と Gcsf を追加します。 注意: サイトカイン ・添加物ないの合計の総容積の 10% 以上媒体は個々 のコロニーを識別する十分な粘性できません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 解離胚セルロース添加
<ol><li>ピペットを使用して、遺伝子組換えサイトカインと鯉の血清と準備されたセルロースの表面に解離 10 胚の 100 μ L を追加します。キャップのふたとサンプルを完全に均質に優しく渦です。各チューブは今 10 胚解離の組織を含める必要があります。</li>
	<li>3 mL 注射器や 16 G 針、2 別の 35 ミリメートルのシャーレにサンプルの分注 1 mL を使用しています。サンプルはペトリ皿に完全に分散していることを確認します。サンプルごとに繰り返します。</li>
	<li>15 cm シャーレにセルロースの細胞と 35 mm ペトリ皿を配置します。それぞれの 15 cm の皿に 5 mL のサンプルを湿らせるために滅菌水 1 つの 35 mm ペトリ プレートを追加します。32 ° C および 5% CO2で 7-10 日間インキュベートします。</li>
</ol>9. HSPC 由来コロニー形成単位 (CFUs) の可視化
<ol><li>7 日間をインキュベート後 40 〜 100 倍の可視化と列挙に倒立顕微鏡にサンプルを配置します。この時点で、個々 のコロニーをピペットで分離され、染色や遺伝子解析を受けることができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41++cmyb++precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis.">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo.">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li><li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

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ゼブラフィッシュ モデル システムかつ決定的に原始的な脊椎動物の造血を勉強するための効率的で効果的かつ安価なモデルとなっています。高速で安価なといくつかの技術的な困難の試金の世代は、小分子をテスト、突然変異体の胚を分析、HSPC 生物学の重要な分子経路の解明に利用できます。体外メッキ HSPCs のアダルト ゼブラフィッシュからは突然変異誘発、サイトカイン、造血障害研究する効果的な方法です。このプロトコルは、これらの研究に基づいていますが、ゼブラフィッシュの胚を利用します。ゼブラフィッシュの胚にこれらのアッセイを適用するより迅速なデータ収集、(薬剤スクリーン) の少ない薬の使用より少ない物理的なスペースの使用により、テストの mRNA 発現および/または特定の遺伝経路の morpholino (MO) ノックダウンが可能します。重要なは、初期の脊椎動物の開発でのみ発生する造血の段階の検討もできます。
このアッセイの柔軟性のためそれは簡単に多くの多様なニーズを満たすために変更することができます。このプロトコルの変更の 1 つは発達のタイミングの変調胚利用の年齢を変更するには、時間をかけて HSPC 世代の定量ことができます。異なる 36 前に発生する HSPCs の erythromyeloid の前駆細胞6, などのサブセットの検討も可能となります生じるbona fide HSCs3,4,5,8対の hpfその後。誰がまだ発展途上の胚より制限されたゼブラフィッシュ HSPC サブセットを特定および識別するにできませんでしたが、これらの試金はこれらの実験を許可します。それは重要な動物の発達段階を変更したとき、セルロースに追加のセルの量も最適化されています。あまりにもいくつかの動物は、間も、植民地を出ない多く HSPC コロニーの不可算プレートが作成されます。特定実験に合わせることができるもう一つの変更は、異なるサイトカインを追加します。Gcsf 骨髄コロニーに列挙できる、Epo を追加する赤芽球コロニー定量なります。これらのサイトカインの両方を追加すると、複数系統 CFU 世代。重要なは、これらの試金は推定されるサイトカインや HSPC 増殖と分化への影響のテストを許可します。これらのアッセイは、大規模な薬物テストを実行する変更もできます。胚は、異なる時点での化合物の濃度化学物質血液の生産に正または負の効果があるかどうかを開発中に公開できます。これらの実験を変更することができます最後の方法は、胚がそれぞれ特定の mRNA または MOs は、ノザン、ノックダウンの特定の遺伝子を 1 セル段階で注入することです。24-48 時間を開発した後これらの胚は、利得- または損失--関数の特定の遺伝子の再生 HSPC 形成・増殖・分化に重要な役割を決定するこれらの試金に受けることができます。また、異なる遺伝子組換えゼブラフィッシュ系統を利用すると、速度とを収集し、データの解釈の容易さ助けとなるに注意してくださいすることが重要です。例えば、1 つは赤芽球系の開発に興味がある場合、は、 gata1のこれらの実験を実行する簡単です: した DsRed 胚40、運転した DsRed 特異的遺伝子組換え Gata1 転写因子のプロモーターを持つ蛍光。この方法では、赤芽球系コロニーを分析する際、蛍光顕微鏡を利用できます。同様に、これらの研究は、複数遺伝子を一度に複数のセル血統を探して存在を持つ動物で実行できます。この手法は多能 HSPCs; を識別する役に立つでしょう赤芽球と骨髄コロニー形態で区別しやすいが、それは複数系統特異遺伝子発現により同じ植民地の存在を可視化せずに bipotential の前駆細胞を含むコロニーを識別することは困難.
これらのアッセイでは、多くの利点を持っていますが、それはこれらの実験を実行のたびに十分なコントロールを設定する必要結果、調査結果の解釈手法では細かなバリエーションを変更でした。たとえば、それはあなたのテクニックが正確でない場合、別の日に実験を実行する場合、HSPCs の別の番号を取得することが可能この可能性に対処、1 つは常に適切なコントロールを含める必要があります。Mo の開発に及ぼす影響をテストした後、同じクラッチから (または uninjected またはコントロール MO を注入) 胚の制御実験を行う場合は、実験試料と一緒に処理するか。実験は特定の薬の効果をテストする場合、未処理のサンプルは、コントロールとして含まれているべきです。最後に、特定のサイトカインの開発に及ぼす影響をテストする場合、同じクラッチから動物も処理し、同時にサイトカインを加えて培養をせず。
このin vitroアッセイは実行する簡単ですし、結果、解釈が簡単、プロシージャの間にいくつかの潜在的な問題が発生します。7 日間の培養後コロニーを見てない場合可能性がありますいくつかの問題があります。まず、サイトカインが純粋な適切な濃度のことを確認してください。サイトカインがどのように生産されているに応じて濃度を変更し、彼らの活動を最適化する必要がある場合があります。一般的に発生する別の問題は、胚の消化過剰; HSPCs を破壊します。消化手順で世話をし植民地を繰り返し見てない場合タイミングを変更します。最後に、問題になることができる、ことを確認すべての成分が追加され、正しく混合セルロースと鯉血清添加の混合します。技術的な問題だけでなく植民地が特定の状況下で、もはや必要がありますを実現することが重要です。追加の 3 日間の培養後はしばしば小さいコロニーが多く表示されます。その後まもなく乾燥を開始する、セルロース、過去 10 日間行くことはお勧めしません。別の一般的な問題は時々 植民地は 35 mm のペトリ皿; のエッジの周りを収集する傾向が、特に、縁の周りに徹底的にプレートをスキャンは不可欠です。また、厚く、粘性物質でこれらの植民地を開発していることを覚えておくことが重要です。わずかに異なる観察を上下にフォーカスを調整、顕微鏡を中心と飛行機-植民地がない座っているプラスチック皿の下部に。
これらの in vitroアッセイの利点の多くがあるが、彼らも、いくつかの制限があります。最大の問題は、これらの試が決定的に証明できない、祖先は、HSC - 照射動物の長期的な再構成によってのみ証明することがでくことです。さらに、いないすべてのサイトカイン、定義され、ゼブラフィッシュ、まだ調べることができます HSPCs の種類を制限するを検討しました。例えば、ゼブラフィッシュ リンパ支持サイトカインは特定されていない、まだこれらの試の B および T 細胞の生産を防止します。さらに場合サイトカインは、特定の特定の種類 (または金額) の添加が不正確に特定の造血の細道分化多能性 HSPCs を培養するときは明らかです。もう一つの潜在的な注意点は、このアッセイの場合 HSPCs、サンプルで実際に存在しているが、いくつかの理由を区別することができない (またはが成り立たない) が見分けることができない効果的にです。ほとんどの in vitroアッセイとさらに実験常に行わなければならない調査結果を検証します。これらの問題がなければこれらのクローンの試金から多くの情報を収集できます。
これらの試金は、造血障害の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にので、重要です。研究者は MOs で特定の遺伝経路をたたくことし、プレート消化動物遺伝子が造血の役割を果たしているかどうか。さらに、(生成済みまたは新規突然変異誘発スクリーンで生成) 突然変異体の魚は、迅速かつ容易に評価できます。また HSPC の生物学の薬ある開発や生存率に悪影響を及ぼすかどうかを観察することも変調方式を識別するためにライブ、全体の生物の効率的な薬物スクリーニング アッセイを許可これらの試金。これらの試金異なる縦長で発展途上のゼブラフィッシュの HSPCs の定量ができます。大人7,27,30,41とゼブラフィッシュ胚3,4,42, HSC 数字を量的に表わすしようとした複数の研究中43, 研究が量的に表わされるないゼブラフィッシュ系統制限 HSPCs の量が異なる。また、検討し、血液細胞の形成と分化、謎のままプロセスで重要な分子経路を調節するこれらのアッセイを利用できます。

増結は、生物の生存に必要な成熟した血液細胞の多数を作るプロセスです。成熟した血液を構成する発達制限携帯各種に造血幹細胞 (造血) の分化を含むキーの発達プロセスです。これらの造血システムが枯渇しないように、初期胚から死に至るまで維持されている必要があります更新する必要があります。ポスト mitotic の血液細胞の大半を十分に補充するために、脊椎動物の造血幹・前駆細胞 (HSPCs) の定数の分化・増殖を必要な毎日がリサイクルされていると。HSCs は制限された幹細胞のサブセットに最初の差別化によって成熟した血液細胞を生成します。一般的なリンパ球前駆細胞 (CLPs)1、最終的に T、B、NK 細胞を作り出す、および一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp)2顆粒球、赤血球、巨核球マクロファージを生成します。これらの前駆細胞が特定の細胞系譜を生成するのにコミットしているし、骨髄赤芽球系前駆細胞 (Mep) 顆粒球や血小板、赤血球を生成するなどの詳細の発達制限前駆細胞へと分化好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージの2を生成するマクロファージ前駆細胞 (省)。識別し、これらの前駆細胞を分離することにより重要な分子経路の同定、造血分化に関与して白血病などの多くの造血器疾患発生これらの前駆細胞が正常に失敗するとき区別します。
過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) モデル システム胎児および成体造血研究重要な研究ツールとなっています。ゼブラフィッシュ遺伝子解析に適しているで、系統発生的に最も低い脊椎動物のモデル種と同様血管と人間に造血システムを持つ。Zebrafish の胚が子宮、ex開発し、48 時間ポスト内受精 (hpf) は HSPCs3,4,5,6,7、8を生成します。ゼブラフィッシュは、また非常に肥沃な女性シングル クラッチで 100 個の卵を産卵大きいサンプルの大きさおよび実験的レプリケーションを可能にします。Zebrafish の胚が光学的に透明な造血系の顕微可視化を可能にします。蛍光遺伝子組換え数行ゼブラフィッシュrunx1など HSCs をマーキング: EGFP 魚9、 cd41: EGFP 魚10、およびkdrl:mCherry;cmyb: GFP3二重肯定的な動物、HSC の出現と拡大生体内で3,4,7,8、ライブ、リアルタイムの可視化を可能にします。 9。ゼブラフィッシュの速い世代時間と開発子宮 exにおける突然変異誘発の研究11,12,13,14,15と薬物使用につながっています。16,17,18,19、20人の血液疾患の治療の約束を保持する化合物をスクリーニングします。全体的にみて、造血系、存在と形質転換線、および迅速な再生時間を容易に開発の保全したゼブラフィッシュ造血の研究のための安価な迅速、柔軟、かつ理想的なモデル。
分離して造血をテストの多数の方法は、哺乳類の造血システムで開発されています。調査官は、流出色素25,26HSCs の能力を悪用すると同様、HSCs21,22,23,24をマークに細胞表面受容体の組み合わせを利用できます。彼らにラベルを付ける蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの物理的な分離ができます。セルが、HSC であることを証明するには、内因性 HSPCs、推定 HSCs 移植と成熟した血液細胞の種類すべての長期的な多系統の再構成を観察することを破壊するホスト動物を照射する必要があります。これらのアッセイは、造血細胞移植免疫のマッチングを容易にする近交系マウス系統と多数細胞表面の抗体があるのでマウスでよくはたらきます。ただし、いくつかのゼブラフィッシュ造血細胞表面の抗体は、生成された27, 同定と HSCs の分離を妨げることをされています。マークし、ゼブラフィッシュ HSCs を分離する最も一般的な方法は、トランスジェニック動物、セル固有のプロモーターは、蛍光タンパク質の発現を運転するという。研究は可視化して、背側大動脈の腹側の壁の HSCs の列挙にはこのテクニック3,4,8,9を利用した顕微鏡。他の研究室は、ゼブラフィッシュ28,29系統のクローンを生成しているし、MHC 一致動物30の成功移植を実行しています。ただし、これらのテクニックは、多くの実験室は膨大なコスト、技術的に困難でありは時間がかかる。これらの問題に対処するため研究所は存在、増殖率と HSPCs31,32,33、分化能力をテストするためのいくつかの in vitroアッセイを生成しています。 34,35,36。これらの試 HSPCs体外31,32,33,34,35,36, の救助の増殖・分化を示す造血障害36と発見とサイトカイン33,34,35のテストのための効率的な方法です。彼らはまた、HSPC 生物学31,32の遺伝子を識別するために利用されています。この研究では、私たちが一歩これらの試さらに、ゼブラフィッシュの胚の HSPCs の定量を可能します。これらの試また変異動物の HSPCs の数を量的に利用することができ、動物が破壊的造血薬で治療します。本質的に、これらの試金は高速、現在のいくつかの技術的な課題、HSPC 数字を量的に表わす、彼らの増殖を調べるし、分化におけるブロックを調査する安価な方法をあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:741px;" width="741">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#39;s MDM</td>
			<td style="width:115px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HyClone PBS (1x)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;DMEM 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;Ham&#39;s F12 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">FBS 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HEPES 100 mL (1 M)</td>
			<td style="width:115px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Penicillin/streptomycin (5000 U/mL 
			and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">1.5 mL MCF tube</td>
			<td style="width:115px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td>
			<td style="width:115px;">BD Safety Glide</td>
			<td style="width:119px;">305905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Methocel MC</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">14 mL Polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Librease TM</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Pronase</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">15 cm Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:341px;">AB</td>
			<td style="width:115px;">Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
			<td style="width:119px;">ZL1</td>
			<td>zebrafish strain used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

造血は造血幹・前駆細胞 (HSPCs) が分化成熟した血液を構成する異なる細胞系譜の多数、重要な細胞プロセスです。これらの HSPCs の分離・同定は難しいので定義された事後彼らは、特定のセルにその分化後だけ定義できます。過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) 造血を調査するモデル有機体となっています。ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex、開発し、48 時間後受精 (hpf) によって HSPC 分化を評価するために決定的な HSPCs アッセイを生成していると移植を利用した増殖機能が開発されているとそれ以降。共焦点顕微鏡を用いた特殊な形質転換線の可視化に加えて造血システムの再構成。ただし、これらの試金はコストが法外な技術的に困難で、多くの実験室では時間がかかるです。HSPCs を評価するための in vitroモデルの開発はより速く、費用対効果になるし、以前に比べて現在の少ない困難に HSPC 生物学に影響を与える突然変異や薬物の画面をすばやく評価する所を可能にするメソッドが記述されています。HSPCs を評価するためにこの小説の in vitroアッセイは、めっき解離全体ゼブラフィッシュ胚とだけ HSPC の分化と増殖を促進する追加の外因性の要因によって実行されます。胚が単一のセルに分離される、単一の前駆細胞から生じるコロニー形成単位 (CFUs) を生成させる HSPC 支持のコロニー刺激因子とメッキします。これらの試金からの分子経路のより注意深い検査ように HSPC 増殖、分化および脊椎動物の造血の基盤とその調節不全を理解する研究者を可能にする規制を担当中に病。

HSPC ゼブラフィッシュ胚の数を評価するために 48 の hpf 胚消化、造血支持の外因性の成長因子とセルロースでメッキされ (図 1A) の 7 日間の培養します。7 日後、コロニー形成単位 (CFUs) が列挙 (図 1B) とイメージ (図 1C)。追加別のサイトカインを制御することによって生産の植民地の種類を制御できます: Epo は赤血球分化に必要な Gcsf は骨髄性の分化に必要な。鯉の血清は、哺乳類の組織培養; 牛胎児血清の使用に似ています一般的な成長因子の情報源です。図 1Epo、Gcsf と鯉血清が追加されました、赤芽球系、顆粒球、および混合の erythromyeloid 植民地の列挙を許可します。これらの植民地は形や色により識別できます。赤芽球コロニーはタイトな小さな、コンパクトな、hemoglobinization のための赤い色を持っています。骨髄コロニーはより大きい、端を持ち、フリル付きの外観を与えることにより運動性細胞を持っています。
めっき処理胚のゼブラフィッシュの成功 HSPC 支持の要因をもたらす CFUs インキュベーションの 7 ~ 10 日後。重要なは、CFUs の数量は直接胚メッキ (図 1B) の数と相関します。それぞれ約 1,200 か 2,400 CFUs が得られます (これは、10 または 20 の胚は実験の先頭から始まるに関連して) mL あたり 4 または 8 の胚をメッキします。それは難しいと 2,400 CFUs を数える大規模の実験を実行するときに時間がかかると我々 のプロトコルは 10 の胚を使用して示唆しています。胚の消化の方法論によるその他の破片はメチル セルロースに存在が、顕微鏡下で高倍率での実際の植民地から見やすい。他の細胞の残骸が存在、するが、HSPC 支持サイトカインの添加による HSPC 派生だけ CFUs の存在になります。CFUs は小さくて簡単に見たことがない場合、文化は、増加の成長を奨励する 10 日間培養することができます。しかし、高められた潜伏が多く CFUs; を得られません胚の消化にサイトカイン活性の喪失を示してこれ CFUs が存在しない場合 (HSPCs; のそれに続く破壊と補足の図 1を参照)、またはサンプルの不適切なめっき。常に、技術のわずかな変化は HSPC 列挙の偽の違いには譲歩しないようにこの実験が実行されるたびに適切なコントロールを実行することが重要です。たとえば、HSPCs morphant 胚に存在の数を分析する実験を実行すると、と一緒に通常兄弟とサンプルが準備必要があります。HSPCs の開発で、薬の効果を比較する実験を行う場合未処理の兄弟とサンプルを準備し、と一緒に分析する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56836/56836fig1.jpg"> 図 1:48 の hpf ゼブラフィッシュ胚から列挙する HSPC 派生 CFUs。(A)胚めっき HSPC 支持サイトカインとセルロース造血 CFUs の生成のための概要。48 hpf ゼブラフィッシュ胚解離、エリスロポエチン (Epo)、顆粒球コロニー刺激因子 (Gcsf) erythromyeloid 分化を許可する鯉血清と 1% 完全なセルロースのメッキします。(B)コロニー形成単位 (CFUs) (実験から始まる 10 または 20 の胚は、それぞれ) mL あたり 4 または 8 の胚の濃度でメッキのサンプルからの列挙体。列挙体は、100 X 倒立顕微鏡上で行われました。バーは、CFUs の平均数を示すし、エラーバーは標準偏差を示します。(C)コロニーの形態がセルロース胚めっきの代表。コロニーの形態を示します; 植民地を構成する細胞の種類画像は代表的な赤芽球と骨髄コロニーです。CFUs 400 X で撮影します。スケール バー = 50 μ m。 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56836/56836fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56836/56836supfig1.jpg"> 補足図 1: 胚解離プロテアーゼ消化。(A) 10 胚消化前に、の画像 (左; 未消化)、十分に消化後 (中間; 消化), と余分な消化後 (右; 以上消化)。(B) (A)の消化と消化管の画像 (7.3 X) に拡大。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56836/56836supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

造血幹・前駆細胞 (HSPCs) ゼブラフィッシュ胚を量的に簡単な方法を紹介します。成熟した血液へと分化支持の要因とセルロースでめっき解離ゼブラフィッシュから HSPCs います。これにより血液の検出欠陥や薬剤のスクリーニングを簡単に行なうことができます。

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

7.9K ビュー.  California State University, Chico. 造血幹・前駆細胞 (HSPCs) ゼブラフィッシュ胚を量的に簡単な方法を紹介します。成熟した血液へと分化支持の要因とセルロースでめっき解離ゼブラフィッシュから HSPCs います。これにより血液の検出欠陥や薬剤のスクリーニングを簡単に行なうことができます。

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

発生生物学

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.

造血幹細胞細胞代謝の解析

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...