Ye HeとRinatアブザリモフは、ニューヨーク市立大学プロフェッショナルスタッフコングレス(PSC-CUNY)研究賞プログラムの支援を受けています。ユキ・チェンとケリー・ヴィーラサミーは、アルフレッド・P・スローン財団CUNYサマー学部研究プログラムの支援を受けています。

このプロトコルは、ニューヨーク市立大学(CUNY)先端科学研究センター(ASRC)の制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)のガイドラインに従っています。
1. 組織を収穫する
<ol><li>アルミボートを準備します。長方形のアルミニウム10cm x 20cmを準備し、中央に折り畳んで10cmの二重層正方形を作ります。一方の側にサンプル情報にラベルを付け、もう一方の側を折り畳んで、底面が約4cm x 4cmのボートを形成します。</li>
	<li>発泡スチロールボックス内の液体窒素(LN2)でボートを予冷します。 注:ボートが小さすぎると、サンプルがボートから落ちて、LN2に直接接触して凍結し過ぎる可能性があり、凍結切断中に断片化が発生する可能性があります。</li>
	<li>IACUCガイドラインに従って子宮頸部脱臼により動物を安楽死させ、関心のある組織を直ちに解剖する。<ol>
<li>動物麻酔とスナップ凍結の間隔をできるだけ短く保ち、組織採取中の代謝産物、特に死後の虚血による脳内の陰唇代謝物の変化を最小限に抑える。 注:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で動物を灌流すると虚血の持続時間が長くなり、不安定代謝物の濃度がさらに変化し、関節の実際の結果が誇張されます。したがって、血液や体液の汚染が個々のプロジェクトの代謝物の劣化や洗い流しよりも懸念されない限り、PBSで組織を灌流または洗浄することは推奨されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体窒素に浮かぶアルミニウムボートにすぐに組織を入れ、発泡スチロールボックスの蓋を閉じ、組織の大きさに応じて2〜10分間凍結します:2分、5分、出生後1日目(P1)の7分、P21、P60マウス脳、P60ラット脳それぞれ10分。 注:過剰凍結が凍結中に組織の断片化につながる可能性があるため、長時間(例えば、P1マウス脳の場合は5分)組織を凍結しないでください。</li>
	<li>鉗子でボートを取り外し、ホイルを折ってティッシュを包み、ドライアイスで輸送し、後で使用するために-80 °Cで保管してください。直後に切り離し続ける場合は、ドライアイスのサンプルをクライオスタットに運びます。 注:代謝物をよりよく保存するために、MALDIイメージングに進む前に、サンプルを無傷の組織に保存し、それを切り離すことをお勧めします。組織は、24ヶ月まで-80°Cで保存することができます。</li>
</ol>2. 組織をクライオセクション
注意:インジウム酸化チドキシ(ITO)スライドを取り扱う場合は、常に手袋を着用してください。スライドに直接呼吸を避けるか、組織セクションに人間の唾液の汚染を防ぐためにマスク(オプション)を着用してください。
<ol><li>組織を切り離す前に、MALDI互換ITOコーティングガラススライドの所望の数を収集します。</li>
	<li>抵抗に設定された電圧計を使用して、スライドの導電率をテストします。抵抗測定が読み取られる側にラベルを付ける:これは、組織の切片が付着する側になります。汚れを避けるために、スライドを清潔なペーパータオルの上に置きます。</li>
	<li>-20 °Cに設定されたクライオスタットでスライドを事前に冷却します。</li>
	<li>組織サンプルを-80°Cから除去した場合、組織の大きさに応じて、約45〜60分間、クライオスタットチャンバー内で組織を平衡させます。サンプルがドライアイスから取り出す場合は、約30分間平衡させます。</li>
	<li>70%エタノールで凍結スタットを十分に洗浄してください。クライオスタット室の薄いチップアーティストブラシや鉗子を含むすべての必要なツールを事前に冷却してください。</li>
	<li>組織の種類に応じてクライオスタットチャンバーと検体頭部の温度を設定する:肝臓の場合は-14°C、筋肉の場合は-20°C、皮膚9の場合は-25°C。</li>
	<li>クライオ組織埋め込み化合物OCTを使用してチャックに組織を取り付け、目的の領域からOCTを避ける。</li>
	<li>ステージにきれいなブレードを置き、ロックします。目的の切断角度を達成するために、ステージの位置と試料の角度を調整します。 注:異なるタイプ/遺伝子タイプの組織を切断する場合は、ブレードのきれいな部分が使用されるようにサンプルを再配置するか、クロスコンタミネーションを防ぐために次のサンプルを切断する前に新しいブレードに変更してください。</li>
	<li>目的の領域(例えば、脳内の脳梁)が見つかるまで切断を続ける。クライオスタットで平衡化されたアーティストブラシで余分な作品を払いのけて、ステージをきれいに保つようにしてください。</li>
	<li>所望の領域が明らかになったら、10-12 μmの厚さの小さいセクションを切る。セクションが剥がれやすい場合は、クライオスタットの温度を上げ、-22°Cから-11°Cの範囲に保ちます。脳組織の最適な切断温度は-15°C~-18°Cであることがわかりました。</li>
	<li>良いセクションをカットしたら、ITOスライドに接着します(クライオスタットチャンバーで動作)。</li>
	<li>アーティストブラシの先端を使用して、ティッシュの1つのセクションをITOスライドに移します。</li>
	<li>スライドの下に指を置いてセクションを指温し、安全な取り付けを確実にするためにセクションを温める。組織部は、最初に5-10 sで透明に変わり、その後、約30〜60sで不透明になります。</li>
	<li>慎重にクライオスタットにスライドを脇に置きます。</li>
	<li>他の組織サンプルに対してステップを繰り返し、組織の各部分がスライド上に均等に配置され、可能な限り整列していることを確認します。</li>
	<li>MALDI ターゲットは最大 2 つのスライドを保持できるため、同じコホートの複数のサンプルのセクションを 1 つのスライドまたは 2 つのスライドに配置して、同時に分析できるようにします。</li>
	<li>終わったら、真空箱にITOスライドを置き、乾燥剤とデシケータに移します。スライドを45~60分間真空乾燥します。 注:真空デシケータがラボで利用できない場合は、-20 °C以下のスライドを常に保ち、代謝物の劣化を避けてください。</li>
	<li>スライド保管および出荷:MALDIイメージングコア施設がMALDIイメージングに直接進むためにサンプルを調製しない限り、-80°Cでスライドを保存するか、またはドライアイス上のコア施設または他のMALDI研究所に出荷します。</li>
	<li>サンプルを最もよく保存するには、スライドをスライドトランスポーターに入れ、窒素(オプション)で満たし、パラフィルムでシールし、ジップバッグに入れ、デシカントを含む別のジップバッグに入れます。外側のジップバッグにラベルを付けます。</li>
	<li>-80 °C(最大6ヶ月)で保管するか、十分なドライアイスで出荷してください。</li>
</ol>3. マトリックスの準備
<ol><li>マトリックスを準備します。 注:すべての試薬はHPLCグレードでなければなりません。<ol>
<li>10 mg/mLの濃度でNEDCを準備します。70%メタノール(100mgのNEDC、7mLのメタノール、H2Oの3mL)の溶媒に溶解したマトリックス10mLを調製する。</li>
		<li>さらに、マトリックスを充填する前に噴霧器システムをフラッシュするために、70%メタノール:水溶液の余分な10 mLを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.17でスライドが脱水されたら、大胆な点シルバーマーカーを使用して、組織セクションの外側のガラススライドの空白スペースに「X」マークを配置し、銀の「X」の上に細かい点の黒いマーカーを持つ2番目の「x」を配置します。銀の背景(太字の銀の「X」)から鋭いコントラストを持つ黒い「X」は、後にMALDI機器で後述のマススペクトル獲得のための受託マーカーとして機能します。</li>
	<li>スライドをMALDIスライド金属ターゲットに積み込みます。プラスチックカバーを使用し、サンプルがプラスチックカバー上にあるドロー/アウトラインを使用します。扠置く。</li>
	<li>フラットベッドスキャナーを使用して、MALDIターゲットと一緒にスライドの画像をスキャンします。ターゲットの表面のネジは、スキャナーによる組織部の損傷または汚染を防ぐためのスペーサーとして機能します。選択したスライド領域を 16 ビットのグレースケールと 2400 dpi でプレビューしてスキャンします。後で MALDI MSI で使用するためにイメージを保存します。</li>
</ol>4. マトリックスの堆積
注:サブリメテーション、液滴インクジェット印刷、自動マトリックス噴霧器、アーティストのエアーブッシュ9を使用した手動スプレーなど、MALDIスライドに微細な結晶サイズのマトリックスの偶数層を適用する方法は複数あります。このプロトコルの例として、再現性の高い自動マトリックス噴霧器を用います。
<ol><li>起動:マトリックス噴霧器ユニットをオンにして、バルブが LOAD に配置されていることを確認し、噴霧器ソフトウェアを起動します。排気ファンが良好に動作していることを確認します。アクティブベントが正常に機能していない場合は、溶剤ポンプを起動しないでください。</li>
	<li>[Comms]タブですべてが通信していることを確認し、後圧が~500 psi (または 3.4 MPa) で、.1 mL/min で溶剤ポンプを起動します。</li>
	<li>窒素タンクを30 psiに設定して、マトリックス噴霧器への圧縮空気流を開始します。次に、噴霧器前面の圧力調整器を10psiに調整し、必要に応じて噴霧器ノズル温度を設定します。 注:祈りの空気圧が5 psiより低い場合、噴霧器ノズルは保護のために加熱することはできません。</li>
	<li>バルブが LOAD 位置に残っている場合は、70 mL のメタノールでループをフラッシュし、6 mL のマトリックスでループを満たします。</li>
	<li>ティッシュスライドを噴霧器のホルダーに入れ、動きを防ぐために両端をテーピングし、マトリックスによってMALDIターゲットの金属クランプの汚染を避けるためにマトリックスフリーエッジを維持します。 注:貴重なサンプルスライドに進む前に、最初に空白の顕微鏡スライドでマトリックススプレーをテストすることを強くお勧めします。</li>
	<li>噴霧を開始するために流量と温度が安定していることを確認してください。</li>
	<li>空のガラススライドを使用して事前にテストした方法を選択します。</li>
	<li>スタート を押 します。ノズル温度を設定し、選択した方法に合わせてポンプの流量を調整します。バルブを [負荷] から [スプレー位置] に切り替えて、[ 続行]をクリックして確認します。</li>
	<li>システムの実行を許可しますが、方法に応じてスライドあたり5〜20分かかります。バルブを スプレー から 負荷 位置に切り替え、完了したら [続行 ]をクリックして確定します。</li>
	<li>噴霧器からスライドを取り外し、顕微鏡下でマトリックスコーティングのパターンを調べて、微細なマトリックス結晶の均一な層を確保します。</li>
	<li>マトリックスの堆積後、スライドを金属MALDIホルダーに入れてすぐに使用します。試料スライドが1つしかない場合は、別のブランクスライドを追加して、MALDIホルダーの2つのスペースを埋めます。</li>
	<li>メーカーの指示に従って使用した直後にシステムをクリーンアップし、噴霧器ノズルの詰まりを防ぎます。</li>
	<li>サンプルスライドがマトリックスでコーティングされた後、MALDIイメージング装置に直ちに進むか、ステップ2.19で説明したのと同じダブルジップバッグ調製物を使用してドライアイスで出荷します。 注:MALDI機器などの緊急時には、コーティングされたスライドを真空状態または-20°Cで最大24時間保存しますが、一部の代謝物の劣化は、完全に研究されていない貯蔵中に起こる可能性があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. 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著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

MALDIイメージング(MALDI-MSI)は、研究者が様々な生体分子の分布と組織の修飾、病理学の分子ベースを調査することを可能にするラベルフリーイメージング技術です。MALDI-MSIと従来のLC-MSアプローチを組織分析に組み合わせることで、従来のオミックスワークフローと同じ分子深度を提供しますが、セルラーネットワーク内でのそれらの信号の空間的関係も保持します。サンプル調製は、MALDI MSIの中で最も重要なステップであり、異なるラボ4で行われたメタボロミクス研究の最終的な読み出しの変動を説明する。ここでは、MALDI MSIを用いたメタボロミクスプロファイリングのサンプル調製を標準化するための包括的かつ実用的なプロトコルを提供し、基礎生物学から翻訳研究までの現在および将来の研究にMALDI MSIを実施するために広範な研究コミュニティに利益をもたらすことを期待しています。
サンプル調製中の分子プロファイル(豊富度と空間分布の両方)の変化を最小限に抑え、汚染を避けるためには、常にすべての予防措置を念頭に置く必要があります。まず、動物安楽死と組織収穫の間の時間を最小限に抑え、例えば、その際に凍結するか、または脳内の酵素を不活性化するためにマイクロ波固定によって加熱して、死後の虚血4、5、6への責任を軽減する。第二に、サンプルのスナップ凍結状態は重要です。不十分な凍結は代謝物の分解および喪失を引き起こし、凍結を超えて凍結は凍結切断中に組織の断片化を引き起こす。凍結時間は、以前に報告された研究によると、常に最初にテストされるべきであり、この論文で提示された発達マウス脳の研究は、げっ歯類の脳組織の基準点を提供する。第三に、生体組織の切断とITOスライドへの切片の転送には、十分な実践が必要である。ブラシを使ってステージから断面を拾う際は、ブラシを繊細に使用する必要があります。ブラシの毛が組織セクションの端と接触するだけで汚染やセクションの断片化のリスクを減らします。スライド上のセクションを可能な限り平らにし、指の温暖化中にセクションのカールを防止します。第四に、ITOスライドに取り付けながら、組織の異なる領域が指の温暖化の異なる時間を必要とするかもしれないので、セクション全体がITOスライドに十分に取り付けられていることを確認してください。例えば、脳腫瘍組織は、正常な脳組織よりも長い温暖化時間を必要とする。マウントが悪いと、MALDI-MS スキャン中に組織が剥離し、断片化する可能性があります。指の温暖化は、代謝産物の実際の変化を引き起こす酵素作用および代謝を可能にする可能性があることを覚えておいてください。第5に、MALDIマトリックスの微細で均一な堆積は、正確な空間情報と強いMALDI-MS信号を達成する上で重要な役割を果たします。それは、空のスライドにマトリックス噴霧をテストし、貴重な標本スライドのコーティングに進む前に、適切なカバレッジを確認するために顕微鏡で結晶パターンを観察することをお勧めします。そして最後に、個々の研究者が組織の収穫とスライドの準備を異なる速度で実行するので、同じコホート内の標本のサンプル調製を処理する人を1人持って、変動を最小限に抑えることが理想的であろう。
上記のプロトコルは、特定の実験のニーズに合わせて調整することができる標準的な手順を詳述しています。例えば、通常、試料のクライオ切片に使用される凍結切片ゲルOCTは、組織チャックへの取り付け用接着剤としてさらに利用することができる(上記の研究で述べた研究のように)。以前の研究では、OCTのポリマー成分が強いイオン抑制14を引き起こすことが示されている。しかし、ポリマーゲルからの追加の支持なしに組織が壊れやすすぎて切断できない場合には、サンプルを埋め込むのは避けられない場合があります。これらの場合のシグナル抑制に対抗するためには、組織は、タンパク質または脂質の検出のために残留OCTを除去するために70%エタノールおよび95%エタノールで連続洗浄で洗浄する必要があるが、洗浄は小分子代謝産物9の検出には推奨されない。
MALDI MSIは、研究室と臨床現場の両方でますます関連性が高まっています。例えば、MALDI MSIは、最近、生物15の表現型機能状態を特徴付けるためにプロテオミクスの研究に有用であることが証明されており、その後の疾患16の微生物同定および診断のための薬剤として作用する。MALDI MSIは幅広い用途をサポートしていますが、特に類似種または代謝物の区別や特定の標的の同定に関しては、この技術だけに依存することに関連するいくつかの制限があります。もう一つの課題は、MALDI MSI信号に従った代謝物濃度の定量化である。MALDI MSIスペクトルのイオンの存在量と、解剖された組織全体の対応する分子種の空間分布(または相対的な存在量)は、よく相関していると考えられます。しかし、イオン強度と対応する分子種の量との関係は、イオン抑制の効果、組織構造およびイオン分子反応17を含む多数の要因によって複雑であることを常に念頭に置くべきである。MALDI-MSI18では、絶対定量(μmol/g組織)に対して内部標準を利用した技術を実装できます。これらの 2 つの課題は、MALDI MSI と液体クロマトグラフィーのタンデム MS(LC-MS/MS) 技術を組み合わせたワークフローで対処され、MALDI-MS は関心領域のマッピングを可能にし、後にマイクロ抽出と LC-MS/MS を適用して代謝物19を識別するためのより多くの情報を提供します。
MSベースのイメージング法は、近年、小分子代謝物をイメージングするための以前の手法に代わる方法として開発されています。MALDI MSIの進歩と人気の高まりに伴い、MALDIイメージングは、低分子を可視化するための新しい標準ツールになることが期待されています。生物学的文脈における脂質および内因性の小分子(例えば神経伝達物質および代謝産物)のイメージング、ならびに新しい医薬開発のための異種生物剤のイメージングは特に興味深い。これら3つの分野は、近い将来MALDI MSIの適用と急速な進歩を遂げるために20.

代謝産物は、代謝産物の中間体または代謝の産物、ヌクレオチド、アミノ酸または有機酸、脂質、生物学的機能およびプロセスの重要な構成要素である。代謝産物の研究であるメタボロミクスは、基礎、翻訳、および臨床研究の文脈における生化学的相互作用の探求と役割の理解を可能にする。代謝産物は、生物のフェノタイプと強く関連しており、細胞代謝中に生じる生化学的活動に関する情報を提供する1。したがって、ゲノミクスやプロテオミクスに加えて、メタボロミクスは生理学的および病理学的状態の両方を理解する上で重要なツールとして登場しました。例えば、メタボロミクスは、既存の薬剤の背後にあるメカニズムとその耐性を解明するために使用されます。医薬品開発において、異種代謝は、種を越えた代謝産物の活性または毒性を評価するのに有用であり、後に個別化医療2を支援することに変換される。メタボロミクスの広範な適用にもかかわらず、代謝産物のイメージングは、代謝産物の化学的反応性、構造不均一性、および広い濃度範囲3のために困難であり得る。しかし、高エネルギー化合物、グルコース、乳酸、解糖、ペントースシャント経路、およびTCAサイクル中間体を含む不安定代謝産物の濃度は、リン脂質、神経伝達物質、シグナル伝達化合物、組織酵素が死後のイシュ血症の収穫手順中に活動する数秒以内に変化し、数分で進行する可能性がある。.正確なメタボロミクスデータ取得を確実にするために、適切かつ慎重なサンプル調製は7、8を極めて重要である。代謝産物を測定するための現在確立されたプラットフォームには、NMR、酵素アッセイ、質量分析(液体およびガスクロマトグラフィーを含む)があり、最後の点を以下に説明する。
MALDI-MSIは、個々の分子種の検出を通じて複雑なサンプルの分析を可能にする最先端の技術です。MALDI MSIは、生物学的試料中の様々な分子化合物を迅速かつ再現的に測定することができるという利点を与えます。質量分析イメージングは、さらに、その複合代謝産物に基づいて組織生物学を表す画像の生成を可能にし、また、サンプル9中の代謝産物の空間分布を維持しながらそれを行う。MALDIは、抗体標識、構造修飾、または免疫染色に使用されるような他の特殊な試薬を使用せずにサンプル中の検体を検出する能力と、単一の実験内で何百もの分子を監視する能力と相まって、MSイメージングが代謝プロファイリングに与える利点のほんの一部を含む10、 11.2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)や9-アミノアクリジン(9-AA)などの一般的に使用されるマトリックスに加えて、最近発見された新しいマトリックスN-(1-Naphthyl) エチレンジロイクロ塩化 (NEDC) は、様々な低分子量代謝物の分析に適しており、MS2.
MALDI MSIの広範な適用にもかかわらず、装置の高いコストおよび実験手順の複雑さは、個々の研究所でのより広い実装を防ぐ。したがって、MALDI MSI研究の大部分は、共有コア施設を通じてサポートされています。スライド調製およびマトリックスコーティングを含むサンプル調製は、MALDI MSIにおける最も重要なステップです。しかし、スライドの準備は通常、個々の研究者の研究室で行われ、後のMALDI MSI取得に潜在的なバリエーションを生み出します。ここでは、MALDI MSI測定に進む前に生体試料のサンプル調製のための詳細なプロトコルを提供し、発達マウス脳のメタボロミックプロファイリングを例として用いることを目指しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

実験サンプルに存在する小分子や代謝産物を同定・定量化する研究であるメタボロミクスは、開発中および疾患の生物学的活動を調査する重要なツールとして浮上している。メタボロミクスのアプローチは、癌、栄養/食事、糖尿病、および代謝過程を含む他の生理学的および病理学的状態の研究に広く採用されている。本論文で提唱されたメタボロミックプロファイリングを支援する有利なツールは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージング(MALDI MSI)です。標識、構造修飾、または免疫染色に使用されるような他の特殊な試薬を含まない現場で代謝産物を検出する能力により、MALDI MSIはメタボロミクスの分野に関連する方法論を進めるユニークなツールとなります。最適な結果を得るには、適切なサンプル調製プロセスが不可欠であり、このホワイト ペーパーの焦点となります。

代表的な実験は 、図1に示すワークフローに従って行われました。出生後1日目、21日目、60日目の発達C57BL野生型マウス脳(成人)は、CUNY IACUCガイドラインに従って上記のように収穫され、液体窒素に浮かぶアルミニウムボート上でそれぞれ2、5、7分間凍結した。凍結組織は、標本頭部とチャンバーの両方に設定された−15°Cの厚さ10μmのセクションで凍結切除された。組織の凍結分を、MALDIイメージング用のITOコーティングガラススライドの冷却済み導電性側に穏やかに移した。ITOスライド上の取り付けられた凍結部分は、室温で45分間真空中で乾燥させ、続いて自動マトリックス噴霧器を使用してマトリックス堆積を行った。マトリックスNEDCを用いて代謝物を検出し、メタノール/水中10mg/mLのマトリックス溶液(70/30、v/v)を、各サイクル間で5秒間乾燥して12サイクルの流量0.1mL/minとノズル温度75°Cで堆積した。1300 mm/minの噴霧速度、2 mmのトラック間隔、10 psiのN2 ガス圧力、3 L/分の流量、ノズル高さ40mmのノズル高さを使用しました。
MALDI質量スペクトルは、MALDI飛行時間(TOF)MSI機器によって負イオンモードで取得した。メタノール中の0.5〜1μL(n= 1-90のPnクラスター)のエマルジョンをITOスライドに堆積させ、取り付けられた組織の隣に堆積し、2次較正曲線13を適用して100〜1000m/z質量範囲の機器を較正するために使用した。レーザースポット径は、ラスタ幅50μmの「ミディアム」変調ビームプロファイルに焦点を合わせていました。m/z 50から1000までの質量範囲内のスペクトルは、500ショットで1000 Hzで獲得しました。質量スペクトルデータを記録し、高度なMALDI MSIデータ解析ソフトを用いてイメージングをさらに解析した。イオン画像は、ビン幅 ±0.25 Daで、根平均平方根(RMS)の正規化で生成されました。
図2の結果は、100ダルトン間隔毎から選択したm/zスペクトルのMALDI MSIデータ分析ソフトウェアからの出力画像を示し、低分子代謝物から高分子量脂質までのスペクトルの同定に有用性を明確に示した。各行は、出生後1日目、21日目、60日目に収集された3つの組織にわたって、特定の代謝産物種の空間情報とスペクトル情報の両方を含むそれぞれのイオンヒートマップを示しています。各代表m/zについて、地域分布とイオンの豊富さの分析を使用して、異なる年齢間の対応する種の相対的な量を比較することができます。MALDI MSI方法論の強みは、m/zによって同定された特定の種の特異性を発達的マイルストーンまたは特定の解剖学的構造に識別する能力である。一部の代謝物は、P1新生児(m/ z 320.1)で濃縮され、P60成人(m/ z 846.5)で濃縮されるか、または年齢間で均一に分布(m/ z 480.3)であることが観察されています。他の分子種は、特に灰色物質(m/z 117.1;524.3;765.1)、白質(m/z 673.4;846.5)、またはCSF/心室(m/z 239.0)で特異的に濃縮される(図2A)。ヒポキサンチン(m/z 135.0)、N-アセチル-L-アスパラギン酸(m/z 174.0)、アラキドン酸(m/z 303.2)、およびリゾホスファチジルエタノールアミンLPE(18:1)(m/z 478.3)などの脂質を含む代表的な代謝産物の空間分布(m/z 478.3)、LP E(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), ホスファチジルエタノールアミン PE (44:10) (m/z 838.5), ホスファチジルイノシトール PI(38:4) (m/z 885.6) も示されています(
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> 図 1.MALDI-飛行時間(TOF)質量分析イメージングのワークフロー。 スナップ凍結組織は、クライオスタットで凍結切除され、ITOスライドに取り付けられています。→ 組織切片付きスライドは、自動マトリックス噴霧器を使用して、マトリックスの微細な層でコーティングされています。→質量スペクトルは、20-200umのラスターでMALDI-TOF MSI機器によって収集されます。→ データを分析し、画像は、高度な MALDI MSI データ分析ソフトウェアを使用して生成されます。スケールバー: 2 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> 図 2.50 μmの横解像度で得られた質量分析から選択されたm/zスペクトルを持つ代表的な出力。(A) ヒートマップは、P1、P21、P60で特定された3つの発達マイルストーンにわたって、100ダルトンm/z間隔ごとに選択された特定の代謝産物種の空間分布を示しています。(B)P1、P21およびP60における代表的代謝物の空間分布は、ヒポキサンチン、N-アセチル-L-アスパラギン酸、アラキドン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン(LPE)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)などの異なる脂質種を含む。スケールバー、500 μm.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

このプロトコルの目的は、生物学的サンプル中の代謝および分子検出を最大化するためにMALDI MSIを使用した実験を計画する際のサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.0K ビュー.  The City University of New York. このプロトコルの目的は、生物学的サンプル中の代謝および分子検出を最大化するためにMALDI MSIを使用した実験を計画する際のサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。 

ビデオ: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

代謝産物の調査のためのMALDI-質量分析イメージング<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;ルート結節

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

質量サイトメトリー分析のための試料調製

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...