このプロトコルは、様々な病原体およびワクチン製剤に対する宿主応答の評価を可能にする。この技術の主な利点は、それが可含性動物モデルを使用して、生体内の細菌の負担および免疫応答の評価を可能にすることである。この手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるKacy Yountです。
免疫のために、麻酔を受けた6〜12週齢のマウスのつま先ピンチに対する応答の欠如を確認し、関心のあるワクチンの0.1ミリリットルを有する28.5ゲージ針を備えた1ミリリットルのインスリン注射器をロードする。45度の角度で注射器を保持し、ベベルを上に向けて、針をマウスの三角に約5ミリメートル挿入し、ワクチンを注入する。針を筋肉に挿入して5~10秒間留め、注射器を180度回転させて、ベベルが下を向いてシールを作成し、ワクチンの漏れを防いでから注射部位からゆっくりと針を引き込みます。
その後、完全に回復するまで、監視を使用して、そのケージにマウスを戻します。ブーストから約2週間後、免疫マウスに感染する。背胸部の擦り傷、肩甲骨と首の後ろで麻酔をかけたマウスをつかみ、マウスを直立して鼻にアクセスします。
200マイクロリットルピペットチップを用いて、対象の細菌接種物の20~25マイクロリットルを動物の各ナレにゆっくりと塗布し、接種物全体が吸入されるまでマウスを保持する。次に、陰性対照として1群のマウスに等量の無菌PBSを送達する。適切な実験終点で、感染したマウス腹側を解剖板の上に置き、手足を固定します。
70%エタノールで体を濡らし、骨盤の中央の腹部の下の皮膚を留め込むために鉗子を使用する。鋭利なはさみを使用して、下顎まで垂直に切り取り、腹壁から皮膚を解剖する。皮膚を死体の側面に移動して、無菌臓器収穫のための妨げられない畑を作り、肝臓またはその近くの胸部の下の無傷の腹胸を把握する。
胸部に向かって腹膜を切って下消化管を露出させ、結腸を左に動かして脾臓を明らかにする。曲がった鉗子を使って脾臓をつかみ、はさみで結合組織を解剖する。次に、3ミリリットルのRPMIを含む15ミリリットルの円錐管に脾臓を入れ、氷の上に5%の胎児ウシ血清を入れる。
鉗子を使用して、xyphoidプロセスで胸部を安定させ、ダイヤフラムを切開します。肺は収縮し、背骨に向かって落ちる必要があります。胸当てを取り除くために側面の胸部を切り開き、肺動脈と静脈を切って右肺の上葉を分離して取り除く。
10%中性緩衝ホルマリンの15ミリリットル円錐管に少なくとも24時間固定し、左右の肺の残りのローブを分離する。その後、氷の上のPBSで1%カゼインの2ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管にローブを入れる。チップ付きの1ミリリットルのピペットマンを使用して、胸腔を満たす血液を採取し、血液を氷上の事前ラベル付き1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。
気管を覆う耳下腺、顎下腺、および顎下腺およびリンパ節を取り除き、気管を取り巻く保護膜を開いて取り除きます。細かい鉗子とはさみを使用して、気管を食道から慎重に分離し、他の結合組織は鎖骨の上から下顎骨の底まで慎重に分離する。気管を保持するために鉗子を使用し、鎖骨の上部に気管を切断します。
気管を引き下げて弾力性を最大限に引き出し、下顎の底部の気管を喉頭のすぐ上に切り、約1センチメートルの組織を単離する。その後、PBSの氷の上に1%カゼインの0.3ミリリットルを含む、事前にラベル付けされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに臓器を入れる。今、鼻への明確なアクセスのためにマウスを回し、70%エタノールで頭をスプレーします。
手動で頭蓋骨の真後ろに動物をつかみ、鼻の底から始まり、上に移動し、鼻の柔らかい肉を切り取るためにはさみを使用しています。鼻の周りから毛皮、皮膚、ウィスカーを取り除き、曲線を下向きにしてナレスにハサミの先端を挿入します。目に向かって鼻の通路を切り開き、V状の形成を作り出す。
次いで、微細な鉗子を使用して鼻中隔を採取し、軟部組織を形成内に集め、PBSの1%カゼインの0.3ミリリットルを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに、氷の上に組織を入れる。肺組織を処理するために、肺サンプルチューブの内容物全体を無菌15ミリリットルのDounceホモジナイザーに移し、害虫を使用して組織を均質化する。組織の大きな粒子が残らないまで試料を解体し、均質化懸濁液を元の15ミリリットルチューブに戻す。
コロニー形成ユニットをめっきする0.3ミリリットルのアリコートを取り除き、残りのホモジネートを遠心分離により回収する。アリコート0.5ミリリットルの上清を、イライザによるサイトカイン発現分析まで摂氏20度で貯蔵するための事前ラベル付きマイクロ遠心チューブに入れた。次いで、希釈1回当たり0.9ミリリットルの無菌PBSで均質化された肺懸濁液を確保した0.1ミリリットルのアリコートを連続的に希釈し、滅菌三角スプレッダーを使用して、事前にラベル付けされた10%ボルデット・ゲンゴウプラスストレプトマイシンプレートに各経験的に選択した希釈液の0.1ミリリットルをプレートする。
ここで、代表的な光学密度600の測定および計算は、細菌懸濁液の1つの光学密度を達成し、マウスに送達される100倍の希釈細菌接種を調製し、図示される。ワクチン抗原刺激の7日後、併用ワクチン群から免疫化された脾臓細胞はインターフェロンガンマを産生し、IL17は、IL5を大幅に調節する一方で、Tヘルパーを促進し、B百日感染時の免疫応答の17分極化を促進する。B百日症感染マウスの気道の問題から回収された細菌のコロニー形成ユニット列挙体は、対象となるワクチンの保護効果を評価するために使用することができる。
組織壊死を避けるためにできるだけ迅速かつ効率的に作業し、回収された細菌の生存率を維持するために氷の上に単離された組織を保存します。ELISpotフローサイトメトリー、DNAおよびRNAの単離を行い、免疫細胞、分析物の産生を評価し、エピジェネティックおよびトランスクリプト分析を可能にします。ボルデテラpertussisなどの感染因子と協力する場合は、適切なPPEを着用し、病原体の伝染を防ぐために認定バイオセーフティキャビネットで作業することを忘れないでください。
このプロトコルは、気道、特に鼻咽頭からのCFU列挙を詳述する。ワクチンおよび感染症分野における、鼻の細菌コロニー形成を標的にすることについての質問に取り組む。
