El protocolo permite evaluar las respuestas del huésped a una variedad de patógenos y formulaciones de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación de la carga bacteriana y las respuestas inmunitarias in vivo, utilizando un modelo animal manejable. Demostrando este procedimiento está Kacy Yount, una estudiante graduada de mi laboratorio.
Para la inmunización, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesado de seis a doce semanas de edad, y cargue una jeringa de insulina de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 28,5 con un mililitro de 0,1 mililitros de la vacuna de interés. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de 45 grados, con el bisel hacia arriba, inserte la aguja aproximadamente cinco milímetros en el deltoides del ratón e inyecte la vacuna. Mantenga la aguja insertada en el músculo durante cinco a diez segundos, luego gire la jeringa 180 grados, de modo que el bisel esté mirando hacia abajo para crear un sello, y para evitar la fuga de la vacuna, antes de retraer lentamente la aguja del lugar de inyección.
A continuación, vuelva el ratón a su jaula, con monitoreo, hasta la recuperación completa. Unas dos semanas después de aumentar, infectar ratones inmunizados. Sujete un ratón anestesiado por el escrúpulo del tórax dorsal, detrás de los omóplatos y el cuello, y coloque el ratón erguido para acceder a la nariz.
Usando una punta de pipeta de 200 microlitros, aplique lentamente de 20 a 25 microlitros del inóculo bacteriano de interés a cada nare del animal, sosteniendo el ratón hasta que se haya inhalado todo el inóculo. A continuación, entregue un volumen igual de PBS estéril a un grupo de ratones como control negativo. En el punto final experimental apropiado, coloque un lado ventral del ratón infectado hacia arriba en una placa de disección y asegure las extremidades.
Humedezca el cuerpo con 70%etanol, y use fórceps para sujetar la piel debajo del abdomen en el centro de la pelvis. Usando tijeras afiladas, haz un corte vertical hasta la mandíbula, y disecciona la piel de la pared peritoneal. Mueva la piel a los lados de la carcasa para crear un campo sin obstáculos para la recolección de órganos estériles, y agarre el peritoneo intacto debajo de la caja torácica, en o cerca del hígado.
Corte el peritoneo hacia la caja torácica para exponer el tracto digestivo inferior, y mueva el colon a la izquierda para revelar el bazo. Usando fórceps curvos, agarre el bazo y disecciona el tejido conectivo con tijeras. A continuación, coloque el bazo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 3 mililitros de RPMI y un 5% de suero bovino fetal sobre hielo.
Utilice fórceps para estabilizar la caja torácica en el proceso de xyfoide y abra el diafragma. Los pulmones deben desinflarse y caer hacia la columna vertebral. Abra la caja torácica en los lados para extraer la mama, y corte las arterias y venas pulmonares para aislar y eliminar el lóbulo superior del pulmón derecho.
Fijar el lóbulo en un tubo cónico de 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutral a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, y aislar los lóbulos restantes de los pulmones derecho e izquierdo. A continuación, coloque los lóbulos en un tubo cónico de 15 mililitros, que contiene dos mililitros de 1% de caseína en PBS sobre hielo. Usa un pipetman de un mililitro con punta para recoger la sangre que llena la cavidad torácica, y transfiere la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado sobre hielo.
Retire las glándulas parótidas, sublinguales y submaxilares y ganglios linfáticos que cubren la tráquea, y abra y retire las membranas protectoras que rodean la tráquea. Usando fórceps finos y tijeras, separe cuidadosamente la tráquea del esófago, y cualquier otro tejido conectivo desde la parte superior de las clavículas hasta la parte inferior de la mandíbula. Use fórceps para sostener la tráquea y corte la tráquea en la parte superior de la clavícula.
Tire hacia abajo de la tráquea para maximizar la elasticidad, y corte la tráquea en la parte inferior de la mandíbula, justo por encima de la laringe, aislando alrededor de un centímetro de tejido. A continuación, coloque el órgano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado, que contenga 0,3 mililitros de 1% de caseína en PBS sobre hielo. Ahora gire el ratón para un acceso claro a la nariz, y rocíe la cabeza con 70%etanol.
Agarre manualmente el animal directamente detrás del cráneo, y use tijeras para cortar la carne suave del hocico, comenzando desde la parte inferior de la nariz y moviéndose hacia arriba. Retire el pelaje, la piel y los bigotes de alrededor de la nariz, e inserte las puntas de un par de tijeras curvas en las narinas con las curvas apuntando hacia abajo. Abre el conducto nasal hacia los ojos, creando una formación similar a la V.
A continuación, utilice fórceps finos para recoger el tabique nasal y el tejido blando dentro de la formación, y coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga preetiquetado de 1,5 mililitros que contenga 0,3 mililitros de 1% de caseína en PBS, sobre hielo. Para procesar el tejido pulmonar, transfiera todo el contenido del tubo de muestra pulmonar a un homogeneizador estéril de Dounce de 15 mililitros, y use un pestillo para homogeneizar el tejido. Disociar la muestra hasta que no queden grandes partículas de tejido, y devolver la suspensión homogeneizada al tubo original de 15 mililitros.
Retire una alícuota de 0,3 mililitros para encoger unidades formadoras de colonias, y recoja el resto del homogeneizar por centrifugación. Aliquot 0,5 mililitros de sobrenadante en tubos de microcentrífuga preetiquetados para su almacenamiento a 20 grados Celsius hasta el análisis de expresión de citoquinas por Eliza. A continuación, diluir en serie 0,1 mililitros alícuotas de la suspensión pulmonar homogeneizada de reserva de set en 0,9 mililitros de PBS estériles por dilución, y utilizar un esparcidor de triángulo estéril para la placa de 0,1 mililitros de cada dilución elegida empíricamente en placas preetiquetados 10%Bordet-Gengou más estreptomicina.
Aquí, se muestran mediciones y cálculos representativos de densidad óptica 600 para lograr una suspensión bacteriana de una densidad óptica, para preparar un inóculo bacteriano diluido cien veces más para ser entregado a ratones. Después de siete días de estimulación del antígeno vacunal, las células del bazo inmunizadas del grupo de la vacuna combinada producen interferón gamma, y IL17, mientras que regulan significativamente IL5, promoviendo un ayudante T, un ayudante T 17 polarización de la respuesta inmune durante una infección por tos ferina B. La enumeración de la unidad formadora de colonias de bacterias recuperadas de problemas respiratorios de un ratón infectado por tos ferina B se puede utilizar para evaluar los efectos protectores de la vacuna de interés.
Trabajar tan rápido y lo más eficientemente posible con el fin de evitar la necrosis tisular, y almacenar el tejido aislado en el hielo para preservar la viabilidad de las bacterias recuperadas. La citometría de flujo ELISpot y el aislamiento de ADN y ARN se pueden realizar para evaluar las células inmunitarias, la producción de analitos y para permitir análisis epigenéticos y transcriptómicos. Cuando se trabaja con agentes infecciosos como La tos ferina de Bordetella, es importante recordar usar el EPP adecuado y trabajar en un gabinete de bioseguridad certificado para evitar la transmisión de patógenos.
Este protocolo detalla la enumeración de la CFU desde el tracto respiratorio, específicamente la faringe nasal. Para abordar preguntas en la vacuna y los campos de enfermedades infecciosas sobre cómo atacar la colonización bacteriana en la nariz.
