ミクログリア表現型を完全に特徴付けるには、基底運動と指向性の両方の運動性に対処することが重要です。このプロトコルは、カスタマイズされた3Dプリントインターフェースと灌流室を使用して、マウスの脳スライスにおける2光子イメージングによるミクログリアの指向運動性をテストするために使用することができる。この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生であるファニー・エティエンヌと、私たちの研究室の博士研究員であるヴィンチェンツォ・マストリリアです。
解剖の少なくとも30分前に、70ミリリットルのコリン人工脳脊髄液、またはコリンaCSFを氷上でバブリングし始める。32°CでコリンaCSFの150ミリリットルを追加します, カルボーゲンと.密閉された食品箱にバーマグネットを入れた200ミリリットルの結晶皿を入れ、200ミリリットルのaCSFを皿に加えます。
3Dプリントされたインタフェーススライスホルダーを皿の上に置き、結晶化皿から余分な液体を取り除き、インターフェイススライドホルダーのメッシュを覆う溶液の薄膜だけが残るまで。食品箱の底に数ミリメートルのaCSFを追加し、カルボーゲンで流体を泡立て始めます。次に、一定のカルボガンスを維持しながら密閉ボックスを閉じて、加湿された、95%酸素、5%の二酸化炭素が豊富な界面チャンバーを作成します。
収穫後、脳をaCSF浸したろ紙の上に置き、スライスの好ましい角度に従って関心のある領域を解剖する。コロナスライスの場合、振動スライサーの切断ブロックに取り付けられた10センチメートルのペトリ皿に脳の尾面を配置して接着し、氷で満たされた大きなチャンバー内の振動スライサーのリザーバーチャンバーにブロックを配置します。皿に氷冷コリンaCSFを充填し、スライサーを使用して300マイクロメートルの厚い脳スライスを得て、ブレードの通過ごとに直径4ミリメートルの使い捨て転送ピペットを使用して各スライスを収集します。
各スライスは、32°CのコリンaCSFで約10分間回復させ、スライスをレンズクリーニングペーパーの一部に移す前に、コリンaCSFの滴をトッピングする。次に、余分なコリンaCSFを吸引し、スパチュラを使用して、スライスをインターフェースチャンバのメッシュに移し、スライスを少なくとも30分間この環境で回復させます。記録を開始する30分前に、組織スライスの酸素化と生存率を最適化するために、上下灌流を備えたカスタマイズされた記録室に蠕動ポンプを接続し、50ミリリットルの超純水で灌流システム全体をきれいにします。
洗浄サイクルの終了時に、一定のカーボゲネーションの下でガラスビーカーにaCSFの50ミリリットルで記録チャンバーの灌流を開始し、使い捨て、広口伝達ピペットを使用して、ビーカーに画像化される最初のスライスをレンズ紙を取り除く。セクションがビーカーの底部に沈んだら、セクションを記録チャンバーに移し、スライスホルダをスライスに置き、灌流流によって引き起こされる動きを最小限に抑えます。5 ~10 倍の倍率で対象となる脳領域をターゲットにする明視野照明を使用します。
次に、0.35x水浸漬レンズを使用して、視野の位置を調整するために25倍の目的を使用します。蛍光光照明を使用して蛍光ミクログリア細胞を見つけ、最終濃度で目的の化合物を含むaCSFの10マイクロリットルでピペットを埋め戻します。先端に閉じ込められた気泡を取り除くために穏やかな揺れで先端を下に向け、充填されたピペットを5ミリリットル位置に配置し、3軸マイクロマニピュレータに取り付けた5ミリリットルシリンジに接続されたピペットホルダーに取り付けます。
ピペットをスライスに向かって穏やかに下げ、ピペットチップがスライスの表面に軽く触れるまで、同時に目的を制御および調整します。今レーザーを調整し、マルチフォトンモードに顕微鏡を切り替えます。チャンバーが任意の光源からスクリーニングされ、非スキャンされた検出器のスイッチをオンにしてください。
ゲインを設定し、画像内のピクセルが飽和しないように、色分けされた上限を持つルックアップテーブルを使用します。次いで、少なくとも30分間の全持続時間の記録を開始し、5~1ミリリットル位置までシリンジプランジャーをゆっくりと抑え、5分後、5秒間にわたって、化合物をセクションに適用する。画像解析では、まず対象ファイルに ImageJ を使用して Z 投影とドリフト補正を実行します。
次に、変更されたファイルをIcyで開き、インジェクションサイトを中心とした円形の直径35マイクロメートルの領域を描画します。ROI でムービーを再実行して、ムービーが適切に配置されていることを確認します。次に、関心のある強度の進化プラグインの領域を使用して、対象領域の時間の経過に対する平均強度を測定し、その結果をxlsファイルとして保存します。
このプロトコルは、ATPやセロトニンのような異なる化合物によって誘導される応答を測定することを可能にする。ATPの注射は蛍光の増加を引き起こすが、ほとんどのATP注射の後、数分後に戻ってくる組織の歪みによる蛍光の即時、わずかな減少がある。対象領域のサイズも定量化に影響を与え、直径を大きくすると実験のばらつきが減少しますが、検出された応答の精度と大きさは低下します。
特定の時点での微小グリア応答の評価は、異なる化合物の統計的比較に有用であり、または灌流溶液に添加された特定のアンタゴニストの効果をテストするのに有用である。3 次元の運動性を定量化するには、Z ステップ間隔と取得のサンプリングレートを解析要件に合わせて変更する必要がある可能性があることを知っています。
