Чтобы в полной мере охарактеризовать микроглиальный фенотип, важно рассмотреть как базальные, так и направленные подвижности. Этот протокол может быть использован для проверки направленной подвижности микроглии с помощью двух фотонной визуализации в срезах мозга мышей, используя индивидуальный интерфейс 3D-печати и перфузионные камеры. Демонстрация процедуры будет Фанни Этьен, аспирант, и Винченцо Mastriolia, пост-докторской исследователь, как из наших лабораторий.
По крайней мере за 30 минут до вскрытия, начать восходящей 70 миллилитров холина искусственной спинномозговой жидкости, или холина aCSF, на льду. Добавьте 150 миллилитров холина aCSF при 32 градусах по Цельсию, с карбогеном. Поместите 200 миллилитров кристаллизации блюдо с барным магнитом в запечатанную коробку пищи и добавить 200 миллилитров aCSF к блюду.
Поместите 3D печатный интерфейс ломтик держателя на верхней части блюда и удалить избыток жидкости из кристаллизации блюдо, пока только тонкая пленка раствора, охватывающих сетку интерфейса слайд держатель остается. Добавьте несколько миллиметров aCSF в нижней части пищевой коробки и начать восходящей жидкости с карбогеном. Затем закройте запечатанную коробку, сохраняя при этом постоянную карбогенацию, чтобы создать увлажняемую, 95%кислородную, 5%-углеродную камеру интерфейса, богатую углекислым газом.
После сбора урожая поместите мозг на кусок пропитанной aCSF фильтровальной бумаги и вскрыть область интереса, в соответствии с предпочтительным углом нарезки. Для корональных ломтиков, положение и клей хвостовой части мозга на 10 сантиметров Петри блюдо прилагается к режущей блок вибрирующий срез, и положение блока в камере резервуара вибрирующий срез в большой камере заполнены льдом. Заполните блюдо ледяным холином aCSF и используйте срез для получения 300-микрометров толщиной ломтиками мозга, используя четырехмиллиметровый диаметр одноразовой трубы передачи после каждого прохода лезвия, чтобы собрать каждый кусочек.
Пусть каждый ломтик восстановить в 32 градусов по Цельсию холина aCSF в течение примерно 10 минут после его получения, прежде чем передать ломтики на куски линзы очистки бумаги, увенчанный каплей холина aCSF. Затем аспирировать избыток холина aCSF и использовать шпатель для передачи ломтиков на сетку интерфейсной камеры, что позволяет ломтики восстановить в этой среде, по крайней мере 30 минут. За 30 минут до начала записи подключите перистальтический насос к индивидуальной камере записи с верхней и нижней перфузией для оптимизации оксигенации и жизнеспособности ломтиков тканей и очистите всю систему перфузии 50 миллилитров ультрапурной воды.
В конце цикла очистки, начать перфузии камеры записи с 50 миллилитров aCSF в стакане под постоянной карбогенации, и использовать одноразовые, широко ртом передачи пипетки для передачи первого ломтика, чтобы быть изображены в стакан, чтобы удалить бумагу объектива. Когда секция опустилась на дно стакана, перенесите секцию в камеру записи и распорежьте держатель среза на срез, чтобы свести к минимуму движение, вызванное потоком перфузии. Используйте ярко-полевое освещение, чтобы нацеть область мозга, интересную под увеличением от 5 до 10 раз.
Затем используйте цель 25x с объективом погружения в воду 0,35x, чтобы отрегулировать положение поля просмотра. Используйте флуоресцентное освещение, чтобы найти флуоресцентные микроглиальные клетки и заполнить пипеткой 10 микролитров aCSF, содержащих соединение интереса при его окончательной концентрации. Наймите наконечник вниз с нежной тряской, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, захваченных в кончике и смонтировать заполненный пипетку в держатель пипетки, подключенный к пятими миллилитровому шприцу с поршенем, расположенным в положении пяти миллилитров и установленным на трехосном микроманипуляторе.
Опустите пипетку осторожно к ломтику, контролируя и регулируя цель в то же время, пока наконечник пипетки слегка касается поверхности ломтика. Теперь настройте лазер и переключитесь микроскоп в мультифотонный режим. Убедитесь, что камера экранирована с любого источника света и включите неоканированные детекторы.
Установите выигрыш и используйте таблицу осмотра с цветным верхним пределом, чтобы избежать насыщения пикселей на изображении. Затем начните запись на общую продолжительность не менее 30 минут, медленно угнетая поршень шприца из пяти до одного миллилитрового положения, через пять минут, в течение пяти секунд, чтобы применить соединение к разделу. Для анализа изображений сначала выполните z-проекцию и коррекцию дрейфа с ImageJ в файле, представляющих интерес.
Затем откройте модифицированный файл в Icy и нарисуйте круглую область диаметром 35 микрометров, которая будет сосредоточена над местом инъекции. Запустите фильм снова с рентабельностью инвестиций, чтобы убедиться, что он хорошо расположен. Затем используйте плагин эволюции интенсивности интереса для измерения среднего интенсивности с течением времени в области интереса, и сохранить результаты в виде файла xls.
Этот протокол позволяет измерять реакции, индуцированные различными соединениями, такими как АТФ или серотонин. Хотя инъекция АТФ вызывает увеличение флуоресценции, после большинства инъекций АТФ, есть немедленное, небольшое снижение флуоресценции из-за искажения тканей, который возвращается через несколько минут. Размер области, представляющий интерес, также влияет на количественную оценку, поскольку увеличение диаметра снижает изменчивость экспериментов, но снижает точность и масштабы обнаруженной реакции.
Оценка микроглиальной реакции в определенный момент времени может быть полезна для статистического сравнения различных соединений или для проверки воздействия конкретных антагонистов, добавленных в раствор перфузии. Чтобы количественно оценить подвижность в трех измерениях, знайте, что, возможно, придется изменить интервал z-шага и скорость выборки приобретения, чтобы соответствовать требованиям анализа.
