この手順は、侵襲性の低い操作と高い時間分解能で睡眠覚醒調節に関与する特定の神経回路の機能を特定するのに役立ちます。この方法により、特定の神経回路の操作と連携して、モニタリング面EEGをリアルタイムで行い、回路と睡眠覚醒状態の因果関係を調べることができます。コダニ翔太は、この手順を実演する予定です。
足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、吸収パッド上の麻酔マウスの頭部を安定させるために立体戦術装置に耳の棒と鼻ピンを使用します。頭部が固定されている場合、頭皮に中矢状切開を行い、縫合性矢状とスチュラ・コロナリスまたはスチュラ・ラムドイエードの交差が同じレベルの水平線であることを確認します。位置ギャップを避けるには、必要に応じて鼻のピンチとイヤーバーを調整します。
次にセラフィンクランプを使用して皮膚を開いたホールドに使用して、頭蓋骨の露出面を消毒し、頭蓋縫合をより明確に視覚化できるようにします。アデノ関連ウイルスベクターを注入するには、エタノール殺菌した10ミリリットルのシリンジに2マイクロリットルのミネラルオイルを投入し、続いて注入するウイルスの実験量をロードする。マイクロインジェクションポンプを使用して、マイクロインジェクションニードルの先端をブレグマに調整し、座標を原点としてメモします。
次に、指定された注射部位に先端を移動し、針の先端を位置に置きます。注射部位で頭蓋骨をマークし、0.7ミリメートルの炭化カッターを装備した歯科ドリルを使用して、直径約2ミリメートルの穴を頭蓋骨にドリルします。綿棒で穴の周りから血液を除去した後、ゆっくりとストリア末端部またはBSNTのベッド核に針を移動し、ゆっくりとウイルス溶液の指定された量を注入する。
その後、慎重に針を引き込む前に、溶液がBNST組織に十分に浸透できるように針を5分間所定の位置に残します。脳波、または脳波、およびEMG、またはEMG、電極注入、最初は、絶縁の1ミリメートルがEMG電極の両端から剥がされ、電極の中心をブレグマに置いた最初の2本のステンレス鋼線をはんだ付けする。次に、各EEG電極の位置をマークします。
光ファイバーインプラントの位置を決定するには、マニピュレータに光ファイバーフェルールを取り付け、マニピュレータアームを水平線に対してプラスマイナス30度の角度に回転させます。繊維先端をブレグマに置き、座標を記録します。先端をターゲット挿入行に移動し、頭蓋骨の位置と挿入場所の横にあるアンカーねじの位置をマークします。
歯科ドリルを使用して各部位で頭蓋骨を掘削し、マニピュレータを使用して、BNSTの上に達するまで光ファイバーを静かに挿入します。フェルールは残りの頭蓋骨に置く必要があります。繊維をアンカースクリューで頭蓋骨に固定し、硬膜を壊したり、組織を損傷しないように注意してください。
その後、光硬化性歯科セメントで繊維とネジをカバーします。次に、EEG/EMG電極用のドリル穴を開け、最初の電極の先端を1つの穴に挿入します。片手でインプラントを保持し、頭蓋骨と電極の間のスペースにシアノクリレート接着剤を塗布し、任意の組織を損傷しないように注意して、残りの方法で電極を挿入します。
すべての電極が配置されたら、電極と光ファイバーの周囲を追加のシアノクリレート接着剤とシアノアクリル酸加速剤で覆い、フェルールで光ケーブルと電極に中断を引き起こしてワイヤ接続ゾーンをリードすることを避けます。今度は首の筋肉を露出させ、筋肉の下にEMG電極のためのワイヤーを挿入する。EMG電極の長さを調整して、ニューカル筋肉のすぐ下にフィットし、よりシアノアクリレート接着剤と加速剤でインプラントを満たします。
その後、完全な補償まで監視とヒートパッド上にマウスを置きます。標的ニューロンの光励起中の脳脳/EMGモニタリングでは、まずスカラーを使用してレーザー強度を調整し、フェルールを使用してレーザーケーブルの先端を未使用の光ファイバーにつなげます。ファイバとケーブルの接合部にスペースがないことを確認します。
20分後、温められたレーザーを強度チェッカーに放出し、1ミリメートルあたり10ミリワットに強度を2乗に調整します。光パルスの持続時間を 10 ミリ秒、残りの期間を 40 ミリ秒、サイクルを 20 に、繰り返しを 20 に設定します。レーザーモードをトランジスタロジックに変更し、パターンレギュレータによって制御されるファイバから光パルスが放出されることを確認します。
埋め込まれた電極とケーブルアダプタを接続し、レーザー漏れを防ぐために、光不透過性材料で接合部を覆います。そして、レーザーの準備ができたら、マウスをEEG/EMG記録用の実験室に移動します。非急速眼球運動または急速眼球運動睡眠からの覚醒までの待ち時間を評価するために、記録時間を制限し、最適化された部位の利得時間を制限し、マウスが実験室で少なくとも1時間自由に動くようにする。
実験期間中、同じ記録画面でEEGおよびEMG信号を監視します。各状態を区別しやすくするために、各波のゲインコントロールを使用して、マウスの状態を覚醒、非急速な眼球運動睡眠、または急速な眼球運動睡眠として評価します。覚醒遅延に非急速な眼球運動睡眠の測定のために、40秒間、安定した非急速な眼球運動睡眠を観察し、その後、光刺激のためのパターンジェネレータをオンにし、埋め込まれた光ファイバへのレーザー発光を確認します。
次に、睡眠状態が覚醒状態に変わるまで、EEG/EMG 信号を記録します。ここでは、非急速眼球運動睡眠中の写真刺激前後のEEG/EMGトレースを示した。EMG信号のない高電圧および低速周波数EEGは、眼球運動睡眠を表す。
写真刺激は、コントロールマウスがこの移行を実証していない間にマウスを発現するチャネロドプシン-2の刺激の約2秒後に覚醒への急性移行を引き起こし、非急速な眼球運動睡眠中のBNST GABAニューロンの興奮が覚醒の急速な誘導を引き起こすことを示唆した。逆に、急速な眼球運動睡眠中の写真刺激は効果がなかったので、遷移効果は非急速な眼球運動睡眠でのみ出現した。ウイルス注入と光ファイバー注入のステップのための正確な調整に注意することが重要です。
睡眠分析中にキャプチャされたEEG/EMGトレースを使用して、マウスの異なる警戒状態における写真操作の結果を評価することができます。この技術は、睡眠覚醒状態の調節に関与する他のコンポーネントや回路を特定するのにも役立ちます。保護ゴーグルを使用して眼へのレーザー損傷を避け、使用後は常にアデノ関連ウイルスベクター容器を殺菌してください。
