Dieses Verfahren kann uns helfen, die Funktion eines bestimmten Neurokreislaufs zu identifizieren, die an der Schlafwachheitregulierung mit weniger invasiver Manipulation und hoher zeitlicher Auflösung beteiligt sind. Diese Methode ermöglicht es uns, die Überwachungsfläche EEG in Echtzeit in Verbindung mit der Manipulation eines bestimmten Neurokreislaufs zu untersuchen, um den kausalen Zusammenhang zwischen Schaltkreisen und Schlafwachheitzuständen zu untersuchen. Shota Kodani wird das Verfahren demonstrieren.
Nach der Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf Zehenkneifung, tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres und verwenden Sie die Ohrstangen und Nasennadel auf den stereotaktischen Apparat, um den Kopf der anästhesierten Maus auf einem saugfähigen Pad zu stabilisieren. Wenn der Kopf in Position fixiert ist, machen Sie einen mittel-sagittalen Schnitt in der Kopfhaut, um zu bestätigen, dass der Schnittpunkt zwischen der sutura sagittalis und sutura coronalis oder sutura lambdoidea in einer horizontalen Linie auf der gleichen Ebene sind. Um einen Positionierspalt zu vermeiden, stellen Sie die Nasenkneife und die Ohrbügel nach Bedarf ein.
Dann mit Serafin Klemmen auf die Haut offen desinfizieren die exponierte Oberfläche des Schädels, damit die Schädelnähte klarer visualisiert werden können. Um den adeno-assoziierten Virusvektor zu injizieren, laden Sie eine Ethanol-sterilisierte 10-Milliliter-Spritze mit zwei Mikrolitermineralöl, gefolgt von dem experimentellen Virusvolumen, das injiziert werden soll. Verwenden Sie die Mikroinjektionspumpe, um die Spitze der Mikroinjektionsnadel auf das Bregma einzustellen und die Koordinaten als Ursprungsort zu notieren.
Dann bewegen Sie die Spitze an die vorgesehene Injektionsstelle und legen Sie die Spitze der Nadel auf die Position. Markieren Sie den Schädel an der Injektionsstelle und bohren Sie mit einem 0,7-Millimeter-Hartmetallschneider ein etwa zwei Millimeter langes Loch in den Schädel. Nach dem Entfernen von Blut aus dem Loch mit einem Wattestäbchen, bewegen Sie die Nadel langsam auf den Bettkern der Stria terminalis oder BSNT und langsam injizieren das angegebene Volumen der Viruslösung.
Dann lassen Sie die Nadel für fünf Minuten an Ort und Stelle, damit die Lösung das BNST-Gewebe ausreichend infiltrieren kann, bevor sie die Nadel vorsichtig zurückzieht. Für Elektroenzephalogramm, EEG, und Elektromyogramm, oder EMG, Elektrodenimplantation, zuerst zwei Edelstahldrähte löten, von denen ein Millimeter Isolierung von beiden Enden zu den EMG-Elektroden entfernt wurde und legen Sie die Mitte der Elektroden auf die Bregma. Markieren Sie dann die Position für jede EEG-Elektrode.
Um die Position des optischen Faserimplantats zu bestimmen, befestigen Sie eine Glasfaserferrule am Manipulator und drehen Sie den Manipulatorarm auf einen Plus- oder Minus-30-Grad-Winkel gegenüber einer horizontalen Linie. Setzen Sie die Faserspitze auf das Bregma und notieren Sie die Koordinaten. Bewegen Sie die Spitze zur zielgerichteten Einfügelinie und markieren Sie die Position auf dem Schädel und die Position für die Ankerschraube neben der Einfügestelle.
Verwenden Sie den Zahnbohrer, um den Schädel an jeder Stelle zu bohren und verwenden Sie den Manipulator, um die Glasfaser vorsichtig einzufügen, bis sie über dem BNST reicht. Die Ferrule sollte auf dem verbleibenden Schädel ruhen. Sichern Sie die Faser mit einer Ankerschraube am Schädel, wobei Sie darauf achten, die Dura nicht zu brechen oder Gewebe zu beschädigen.
Dann die Faser abdecken und mit fotohärtendem Zahnzement verschrauben. Als nächstes bohren Sie Löcher für EEG/EMG-Elektroden und legen Sie die Spitze der ersten Elektrode in ein Loch ein. Halten Sie das Implantat mit einer Hand, wenden Sie Cyanoacrylat-Klebstoff auf den Raum zwischen dem Schädel und der Elektrode und legen Sie die Elektrode den Rest des Weges, wobei darauf zu achten, kein Gewebe zu beschädigen.
Wenn alle Elektroden platziert sind, decken Sie den Umfang der Elektroden und der Glasfasern mit zusätzlichem Cyanoacrylatkleber und Cyanoacrylat-Beschleunigung ab, um eine Unterbrechung der Ferrule zu Optischen Kabeln und Elektroden zu Bleiverbindungszonen zu vermeiden. Setzen Sie nun die Nackenmuskulatur aus und legen Sie die Drähte für die EMG-Elektrode unter den Muskel ein. Stellen Sie die Länge der EMG-Elektrode so ein, dass sie knapp unter die Nuchalmuskulatur passt, und füllen Sie die Implantate mit mehr Cyanoacrylatkleber und Beschleuniger.
Dann legen Sie die Maus auf ein Heatpad mit Überwachung bis zur vollen Belohnung. Für die EEG/EMG-Überwachung während der Photo-Erregung von gezielten Neuronen verwenden Sie zunächst einen Skalar, um die Laserintensität einzustellen und mit einer Ferrule die Spitze des Laserkabels an eine ungenutzte Glasfaser zu hemmen. Vergewissern Sie sich, dass an der Kreuzung zwischen der Faser und dem Kabel kein Platz vorhanden ist.
Nach 20 Minuten den aufgewärmten Laser an den Intensitätsprüfer aussenden und die Intensität auf 10 Milliwatt pro Millimeter quadratisch einstellen. Stellen Sie die Lichtimpulsdauer auf 10 Millisekunden, die Ruhezeit auf 40 Millisekunden, den Zyklus auf 20 und die Wiederholung auf 20 ein. Ändern Sie den Lasermodus in Transistorlogik und bestätigen Sie, dass Lichtimpulse von der vom Musterregler gesteuerten Faser emittiert werden.
Schließen Sie die implantierte Elektrode und den Kabeladapter an und bedecken Sie die Verbindung mit lichtundurchlässigem Material, um Laserlecks zu verhindern. Und wenn der Laser bereit ist, bewegen Sie die Mäuse zur EEG/EMG-Aufnahme in die Versuchskammer. Um die Latenz auf Wachheit aus nicht schneller Augenbewegung oder schnellem Augenbewegungsschlaf zu beurteilen, begrenzen Sie die Aufnahmezeit und optimierte Platzgewinnzeit und lassen Sie die Mäuse sich in der Versuchskammer für mindestens eine Stunde frei bewegen.
Überwachen Sie während des Versuchszeitraums die EEG- und EMG-Signale im selben Aufnahmebildschirm. Bewerten Sie den Zustand der Maus als Wachheit, nicht schnelle Augenbewegung Schlaf, oder schnelle Augenbewegung Schlaf mit der Gain-Kontrolle für jede Welle für die einfache Unterscheidung jedes Zustands. Zur Messung der nicht schnellen Augenbewegung Schlaf bis Wachheit Latenz, beobachten stabile nicht schnelle Augenbewegung Schlaf für 40 Sekunden, dann schalten Sie den Mustergenerator für Fotostimulation und bestätigen Laseremission auf die implantierten Optischen Fasern.
Zeichnen Sie dann die EEG/EMG-Signale auf, bis sich der Schlafzustand in Wachheit ändert. Hier werden dargestellte EEG/EMG-Spuren vor und nach der Photostimulation bei nicht schneller Augenbewegung Schlaf gezeigt. Ein Hochspannungs- und Langsamfrequenz-EEG ohne EMG-Signale steht für einen nicht schnellen Augenbewegungsschlaf.
Fotostimulation löste einen akuten Übergang zur Wachheit etwa zwei Sekunden nach der Stimulation in Channelrhodopsin-2 exezierenden Mäusen aus, während Kontrollmäuse diesen Übergang nicht demonstrierten, was darauf hindeutet, dass die Anregung von BNST GABA Neuronen während der nicht schnellen Augenbewegung Schlaf eine schnelle Induktion von Wachheit auslöst. Umgekehrt hatte die Fotostimulation während der schnellen Augenbewegung keinen Effekt, so dass ein Übergangseffekt nur im Schlaf der nicht schnellen Augenbewegung auftauchte. Es ist wichtig, auf präzise Koordinationen für die Virusinjektion und die Implantationsschritte der Optischen Faser zu achten.
Die bei der Schlafanalyse erfassten EEG/EMG-Spuren können verwendet werden, um die Folgen der Fotomanipulation auf die verschiedenen wachsamen Zustände bei Mäusen zu bewerten. Diese Technik wird uns auch helfen, andere Komponenten und Schaltkreise zu identifizieren, die bei der Regulierung der Schlafwachheit zuständen. Verwenden Sie Schutzbrillen, um Laserschäden am Auge zu vermeiden und achten Sie darauf, immer autoklav sterilisieren die adeno-assoziierten Virusvektor-Container nach Gebrauch.
