Questa procedura può aiutarci a identificare la funzione di specifico circuito neurologico che sono coinvolti nella regolazione della veglia del sonno con manipolazione meno invasiva e alta risoluzione temporale. Questo metodo ci consente la superficie di monitoraggio EEG in tempo reale in combinazione con la manipolazione di uno specifico circuito neurologico per esaminare la relazione causale tra circuiti e stati di veglia del sonno. Shota Kodani dimostrerà la procedura.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, applicare un unguento agli occhi dell'animale e utilizzare le barre dell'orecchio e il perno del naso all'apparato stereotattico per stabilizzare la testa del mouse anestetizzato su un cuscinetto assorbente. Quando la testa è fissata in posizione, fare un'incisione medio-sagittale nel cuoio capelluto per confermare che l'intersezione tra la sutura sagittalis e la sutura coronalis o sutura lambdoidea si trova in una linea orizzontale allo stesso livello. Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare il pizzicamento del naso e le barre dell'orecchio in base alle esigenze.
Quindi l'uso di morsetti serafin per tenere aperta la pelle disinfetta la superficie esposta del cranio per consentire una visualizzazione più chiara delle suture cranici. Per iniettare il vettore virale adeno-associato, caricare una siringa sterilizzata a etanolo da 10 millilitro con due microlitri di olio minerale, seguita dal volume sperimentale del virus da iniettare. Utilizzare la pompa di microiniezione per regolare la punta dell'ago di microiniezione sul bregma e annotare le coordinate come punto di origine.
Quindi spostare la punta nel sito di iniezione designato e posizionare la punta dell'ago sulla posizione. Contrassegnare il cranio nel sito di iniezione e utilizzare un trapano dentale dotato di una fresa in carburo da 0,7 millimetri per praticare un foro di circa due millimetri di diametro nel cranio. Dopo aver rimosso il sangue da tutto il foro con un batuffolo di cotone, spostare lentamente l'ago nel nucleo del letto della stria terminalis o BSNT e iniettare lentamente il volume designato della soluzione virale.
Quindi lasciare l'ago in posizione per cinque minuti per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST prima di ritrarre accuratamente l'ago. Per l'elettroencefalogramma, o EEG, e l'elettromiogramma, o EMG, impianto di elettrodi, prima saldare due fili di acciaio inossidabile da cui è stato rimosso un millimetro di isolamento da entrambe le estremità agli elettrodi EMG e posizionare il centro degli elettrodi sul bregma. Quindi contrassegnare la posizione per ogni elettrodo EEG.
Per determinare la posizione dell'impianto in fibra ottica, attaccare un ferrule in fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio manipolatore su un angolo più o meno di 30 gradi rispetto a una linea orizzontale. Metti la punta della fibra sul bregma e registra le coordinate. Spostare la punta sulla linea di inserimento mirata e contrassegnare la posizione sul cranio e la posizione per la vite di ancoraggio accanto al sito di inserimento.
Utilizzare il trapano dentale per forare il cranio in ogni sito e utilizzare il manipolatore per inserire delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere il BNST. Il ferrule dovrebbe poggiare sul cranio rimanente. Fissare la fibra al cranio con una vite di ancoraggio, facendo attenzione a non rompere la dura o danneggiare alcun tessuto.
Quindi coprire la fibra e avvitare con cemento dentale foto-polimerizzabile. Successivamente, praticare fori per elettrodi EEG/EMG e inserire la punta del primo elettrodo in un unico foro. Tenendo l'impianto con una mano, applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e l'elettrodo e inserire l'elettrodo per il resto del percorso, facendo attenzione a non danneggiare alcun tessuto.
Una volta posizionati tutti gli elettrodi, coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato aggiuntivo e accelerante cianoacrilato per evitare di causare interruzioni al ferrule al cavo ottico e all'elettrodo per condurre zone di collegamento del filo. Ora esponi i muscoli del collo e inserisci i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si adatti appena sotto i muscoli nucali e riempire gli impianti con più adesivo cianoacrilato e accelerante.
Quindi posizionare il mouse su un riscaldatore con monitoraggio fino a completa ricompensa. Per il monitoraggio EEG/EMG durante la foto-eccitazione di neuroni mirati, utilizzare prima uno scalare per regolare l'intensità del laser e utilizzare un ferrule per intere la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata. Verificare che non vi sia spazio alla giunzione tra la fibra e il cavo.
Dopo 20 minuti, emetti il laser riscaldato al controllo dell'intensità e regola l'intensità a 10 milliwatt per millimetro al quadrato. Impostare la durata dell'impulso luminoso su 10 millisecondi, il periodo di riposo su 40 millisecondi, il ciclo su 20 e la ripetizione su 20. Cambiare la modalità laser in logica transistor e confermare che gli impulsi di luce vengono emessi dalla fibra controllata dal regolatore di pattern.
Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore per cavi, quindi coprire la giunzione con materiale impermeabile leggero per evitare perdite laser. E quando il laser è pronto, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione EEG / EMG. Per valutare la latenza alla veglia da movimenti oculari non rapidi o sonno rapido del movimento degli occhi, limitare il tempo di registrazione e ottimizzare il tempo di guadagno del sito e lasciare che i topi si muovano liberamente nella camera sperimentale per almeno un'ora.
Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nella stessa schermata di registrazione. Valuta lo stato del mouse come veglia, sonno non rapido del movimento degli occhi o sonno rapido del movimento degli occhi usando il controllo del guadagno per ogni onda per facilitare la distinzione di ogni stato. Per la misurazione del sonno di movimento oculare non rapido alla latenza di veglia, osservare il sonno stabile non rapido del movimento degli occhi per 40 secondi, quindi accendere il generatore di modelli per la stimolazione fotografica e confermare l'emissione laser alle fibre ottiche impiantate.
Quindi registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato di sospensione non cambia in veglia. Qui sono rappresentate tracce EEG / EMG prima e dopo la stimolazione fotografica durante il sonno non rapido del movimento degli occhi. Un EEG ad alta tensione e a bassa frequenza senza segnali EMG, rappresenta un sonno di movimento degli occhi non rapido.
La stimolazione fotografica ha innescato una transizione acuta alla veglia circa due secondi dopo la stimolazione nei topi che esprimono la channelrhodopsin-2 mentre i topi di controllo non hanno dimostrato questa transizione, suggerendo che l'eccitazione dei neuroni BNST GABA durante il sonno non rapido del movimento degli occhi innesca una rapida induzione della veglia. Al contrario, la stimolazione fotografica durante il sonno rapido del movimento degli occhi non ha avuto alcun effetto, quindi un effetto di transizione è emerso solo nel sonno non rapido del movimento degli occhi. È importante prestare attenzione a coordinazioni precise per le fasi di iniezione del virus e impianto in fibra ottica.
Le tracce EEG/EMG catturate durante l'analisi del sonno possono essere utilizzate per valutare le conseguenze della manipolazione fotografica sui diversi stati vigilanti nei topi. Questa tecnica ci aiuterà anche a identificare altri componenti e circuiti coinvolti nella regolazione degli stati di veglia del sonno. Utilizzare occhiali protettivi per evitare danni laser all'occhio e assicurarsi di sterilizzare sempre il contenitore vettoriale del virus adeno-associato dopo l'uso.
