有用な提案や技術支援、レベッカ ・ ウィリアムズとコーネル BRC イメージングからヨハンナ Dela クルスとアンドリュー Recknagel に感謝します。この作品は国立衛生研究所健康補助金に支えられた (コーネル大学のイメージング施設) に S10 OD018516、J.C.B. に T32HD057854、J.C.S. に R01 GM45415

コーネル大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、議定書 2004-0038 JCS にここでは、記載されているすべてのメソッドを承認しました。
1. 楽器及び培地の調製
<ol><li>ワイプ作業領域 10% の漂白剤できれいにでき、漂白剤を少なくとも 5 分作業エリア表面上に残ります。5 分後に、きれいなペーパー タオルと 70% のエタノール (エタノール) 余分な漂白剤を削除します。きれいに徹底的に 70% で解剖顕微鏡江藤。 注: 作業領域が少なくとも半器官培養の汚染を避けるため無菌であることが重要です。</li>
	<li>70% で湿らせた紙タオルできれいな鉗子、はさみをラップ使用時までエタノール。 注: 理想的な解剖ツールは卵巣の年齢やサイズによって異なります。1 つ鋭いマイクロ解離シザー、2 つファインチップ鉗子 (いずれか 5 または 55 号) を使用して最高の結果が得られますと 1 つマイクロ アイリス シザーを解剖します。</li>
	<li>コニカル チューブ 50 mL 卵巣文化メディアと 37 ° C の水浴の暖かいを確認します。<ol>
<li>子房培養培地4をするためには、補足 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL 最小重要な媒体 (MEM) x 1アムホテリシン B (FBS、HEPES、1.25 mL とペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 mL と例えばMEM、45 mL、5 mL の熱不活化)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートと子房培養前挿入を準備します。<ol>
<li>ティッシュ文化フードの 35 mm の組織培養プレートに卵巣培養液 1 mL を追加します。</li>
		<li>事前ソークは、培養液で膜を挿入します。よく 24 ウェル キャリア組織培養プレートと場所細胞培養に挿入さて、あたり約 0.55 mL、通常十分なメディアを追加します。挿入の膜に触れるメディアであることを確認します。</li>
		<li>35 mm プレートと実験で卵巣の数に従ってセル文化を挿入して井戸の数を準備します。文化メディアと文化メディアと 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの挿入を含む 24 ウェル キャリア プレートの 1 つの mL を含む 35 mm プレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>郭清範囲の隣のホット プレートを配置し、37 ° C に温度を設定37 ° C、5% CO2を保つため、大気中の O2インキュベーター解剖室に近い。</li>
</ol>2. 卵巣郭清及び器官培養
注: 卵巣は、非理想的な温度への露出が最低限ある限り、室温で切り裂かれます。
<ol><li>1 つずつ斬首で産後 5 日目で雌マウスを安楽死させます。 注: 安楽死は IACUC ガイドライン研究が実行されている施設の存在により実施する必要があります。</li>
	<li>スプレー動物 70 %etoh。解剖顕微鏡の下で乾燥したペーパー タオルの上に動物を配置します。解剖顕微鏡に近い卵巣文化メディアを含む 35 mm の組織培養ディッシュを配置します。</li>
	<li>鉗子や顕微解剖アイリス シザー、腸に切らないように注意を使用して動物の腹腔内に皮膚を切開を行います。腹腔内から腸をプッシュし、卵巣を探します。卵巣を抽出し、培地を含む 35 mm の組織培養皿にそれらを置きます。</li>
	<li>卵巣は、動物から解剖されている、一度卵巣と付属の任意の組織を見やすくために解剖顕微鏡の倍率を増やします。ファインチップ鉗子をきれい、滑液包、脂肪組織など、すべての非卵巣組織を削除します。添付の非卵巣組織を除去するとき、卵巣を壊さないように注意します。</li>
	<li>卵巣が分離されたら、キャリア 24 ウェル プレートの漬け細胞文化挿入ペアを配置 (1.4.2 と 1.4.3 の手順を参照してください) と器官の潤いを保つのに十分であることを確認する媒体のボリュームを調整 (なし完全に水没して)。 注意: は、卵巣を転送するときに細胞培養インサートの膜に穴を突くように注意してください。</li>
	<li>場所は仔 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの臓器です。</li>
	<li>2.1 2.6 各動物の卵巣を切除し、細胞培養に配置するまで卵巣培養培地を含む 24 ウェル プレートの挿入手順を繰り返します。</li>
	<li>変更を使用して卵巣培養培地 2 日おきは 37 ° C の水浴から卵巣メディア因数を加温し、目的実験時点でプロトコルのパート 3 に進みます。</li>
</ol>3. ティッシュの固定
<ol><li>15 mL の円錐管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備 (6 mL の 1x PBS に 16 %pfa 電子顕微鏡グレードの 2 mL の追加など)。 注意: PFA は有害物質で、化学のフードの下で処理する必要があります。</li>
	<li>作りたての 4 %pfa ソリューションと組織を覆うことによって文化の挿入から組織を削除せず培養卵巣を修正します。(蒸発を避けるため) にプラ用接着剤で板の端を密封、4 ° C でサンプルを一晩します。 注: 組織性処理を促進するためにプロシージャ全体でセル文化挿入から卵巣を変位を避けます。チップの表面に付着した培養卵巣処理に有利な損傷臓器を失うことがなく。</li>
	<li>リンス組織 3 x 70 %etoh, いずれかが 4.1 または満ちているシンチレーション バイアルでストアをステップへ進みます 70 %etoh まで 4 ° c をさらに処理します。 注: 内生的組織を用いた場合 70% サンプルを保存の蛍光蛋白質を表現するエタノールを大幅に減らします信号。また、組織を洗浄して、0.2% アジ化ナトリウム (NaN3) と PBS に格納できます。ナン3は、しかし、非常に有毒な深刻な吸入の危険性を提起します。ヒューム フードの原液を行い処理研究室コートとニトリル手袋など適切な保護具を着用します。</li>
</ol>4. 全体のマウント蛍光
<ol><li>4.3 透過ステップ前に 4 h 以上の RT で 1 × PBS で固定ティッシュを置きます。</li>
	<li>透過溶液及びブロッキング溶液を準備します。<ol>
<li>透過ソリューションを準備しています。1 × PBS に 0.2% ポリビニル アルコール (PVA)、0.1% ナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) (から 12 wt.% 14 M 水酸化ナトリウム (NaOH) ソリューションで、ソリューションと 1.5% ポリエチレング リコール-tert-ブチルオクチルフェニル エーテル (非イオン性界面活性剤の洗剤) を追加します。50 mL の円錐管に PBS x 10 の 5 mL、0.1 グラム、PVA、NaBH4の 50 μ L、非イオン性界面活性剤の洗剤の 750 μ L を追加し、超純水を追加 50 mL を水し、混合物がソリューションに完全なるまで室温でよく攪拌します。</li>
		<li>ブロッキング液を準備しています。1 × PBS に 2.5 M グリシン pH 7.4 の洗剤、0.15% 0.1% 非イオン性界面活性剤を追加、10% ヤギ血清、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、0.2% ナン3、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン b. のストック溶液を調製2.5 超純水水 50 mL に 5 g を溶解して純水 500 mL 最終巻 (pH 7.4) にグリシンの 93.8 g と 10% ナン3の原液を溶解することにより M グリシン50 mL の円錐管に 5 mL の 10 x PBS、非イオン性界面活性剤の洗剤、グリシン原液、ヤギ血清、BSA の 1.5 g、ナン3ストック溶液 1 mL の 5 mL の 750 μ L の 50 μ L を追加することによってブロックのソリューションを準備して、、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 ml。超純水水 50 mL とシリンジ フィルターの最終巻までに最終的なソリューションを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>削除しバイアルから 1 × PBS を破棄し、卵巣が完全に水没する十分な透過ソリューションを追加します。室温で 4 h 用のシェーカー (例えばnutator) を軌道上で透過ソリューションにサンプルを配置します。 注: インキュベーション時間は、臓器の厚さに応じて異なる場合があります。</li>
	<li>卵巣が完全に水没する十分なブロッキング液で透過ソリューションを置き換えます。プラスチック接着剤でバイアルを密封し、軌道のシェーカーで室温で 12 時間以上培養組織を残します。</li>
	<li>メーカーのデータシートに従ってブロッキング液で一次抗体希釈を準備します。 注意: すべての抗体が決済エージェントと互換性があります。サンプルごとに必要な平均ボリュームは、約 750 μ L です。<ol>
<li>卵母細胞定量用 TAp63 (核卵母細胞マーカー)、mvh 遺伝子 (細胞の生殖細胞マーカー)。 注: 蛍光画像で使用される抗体は、マウス抗 p63 とウサギ抗-mvh 遺伝子)。第一抗体溶解液は再利用 2 をすることができます x 以上の汚損のプロトコル間の 4 ° C で保存および細菌の成長を避けるために正しく処理される場合。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 ウェル プレートで組織を含む挿入を置き、一次抗体溶液の約 750 μ L を追加します。卵巣が完全に水中に沈むことを確認します。蒸発を最小限に抑え、軌道シェーカーで室温で 4 日間の培養組織を残すプラスチック接着剤で板をシールします。</li>
	<li>洗浄液を準備します。<ol>
<li>洗濯ソリューションを準備しています。1 x PBS を作る 0.2 %pva と 0.15% 非イオン界面活性剤の洗剤を追加します。50 mL の円錐管に 5 mL の PBS x 10、PVA の 0.1 g、非イオン性界面活性剤の洗剤と純水 50 mL の最終巻までの 75 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体の希釈を削除し、洗浄液の寛大な量を追加します。常に卵巣が水没することを確認します。軌道のシェーカーで室温で一晩溶液中浸漬する卵巣を許可します。</li>
	<li>洗浄液を交換し、2 h 以上の軌道のシェーカーで孵化させなさい。</li>
	<li>4.9 の手順を繰り返して 1 つの追加の時間。</li>
	<li>ソリューションをブロックで二次抗体希釈を準備します。 注: 使用される二次抗体、抗マウス 488 の蛍光色素は、ヤギとヤギで発生した反ウサギ 594 蛍光染料で発生します。4.5 の手順を参照してください。平均ボリュームのサンプルごとに必要です。</li>
	<li>洗濯ソリューションを卵巣から削除し、二次抗体溶液を追加します。光 (アルミ箔ラップ プレート) からサンプルを保護し、蒸発を最小限に抑えるためのプラスチック接着剤で板をシールします。2 日間室温で軌道シェーカーでサンプルをインキュベートします。 注: その後インキュベーションのすべての手順の中にアルミ箔を使用して光からサンプルを保護を続行します。</li>
	<li>サンプルから二次抗体溶液を削除し、洗浄液を追加します。8 h の軌道シェーカーで孵化させなさい。 注: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色が必要な場合は、最初の洗浄のステップ (~ 8 時間培養) に DAPI の 50 ng/mL を追加します。</li>
	<li>一晩洗浄の洗浄ソリューションを取り付けます。</li>
	<li>準備中にクリア ソリューション (セクション 5 を参照) で、洗浄液の新鮮な一晩を置き換えるし、軌道のシェーカーでサンプルを室温で維持します。</li>
</ol>5. 卵巣クリアとイメージング
<ol><li>クリア ソリューション ScaleS(0) を準備します。<ol>
<li>ScaleS(0) 指定された割合で試薬を追加することによってソリューションの10をクリアの準備: 40 %d-(-) ソルビトール (w/v)、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)、4.3 M 尿素 10% グリセリン pH 8.1 (例えば50 mL の円錐管にグリセリン、ソルビトールの 10 g の 2.5 mL を追加、DMSO、5 mL と 25 mL の容量のための 9 M の尿素の 12 mL。30 分間 50 ° c のインバージョンによるソリューションをミックスし、使用前にガス抜き)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗濯ソリューションを削除し、ソリューションをクリアするにサンプルが水没します。良い結果を得るのため、軌道シェーカーでサンプルを維持します。</li>
	<li>クリア ソリューション 2 を置き換える × 毎日ティッシュになる透明な (約 2 日) まで。</li>
	<li>組織がクリアされると、罰金と培養の卵巣を含む挿入膜を慎重に外してイメージングのためのサンプルを準備チップ メスとスライド ガラスのサンプルを載せています。</li>
	<li>イメージングの光学断面のできる顕微鏡のサンプルに進みます。</li>
</ol>6. 卵の定量化
注: セルを定量化することができる多くの異なった計算機プログラムがあります。下記は、フィジー ImageJ14非商用画像処理パッケージを使用して卵の定量化のためのプロトコルです。
<ol><li>イメージのドロップダウン リストに [種類]黒と白 8 ビット イメージにイメージを変換 (DAPI チャネル) なし興味の特定の細胞マーカーのz-スタック画像シリーズのフラットな最大強度投影を使用して、メニュー。</li>
	<li>画像のドロップ ダウン メニューの下で調整タブをハイライト表示し、しきい値を選択します。</li>
	<li>それぞれの個々 の卵母細胞を識別するレベルにしきい値を手動で調整するには。一度レベルを決定すると、黒と白のイメージを生成する適用をクリックします。完了すると、視線は楕円形またはフリーハンドのアイコンを使用してサンプルを定量化します。 注: フィジー ImageJ 粒子定量化に使用されるイメージを微調整する別のオプションがあります。例えば、プロセスの |バイナリ] タブで、どのようなカウントされますの検出を改善するために使用できるさまざまなオプションがあります。図 4、良い卵胞を個別に使用するオプションは、浸食、続いて穴を埋めると最後に流域だった。</li>
	<li>分析のドロップ ダウン メニューで、[分析粒子を選択します。目的の解像度によるとパラメーターを設定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

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哺乳類の生殖に関する研究では、細胞培養に日常的に従順ではない特殊な細胞を定量化して、必要があります。ただし、体外培養システムは、卵巣と卵胞の生存率1,15を維持に効果的です。子房培養中に組織拡散を介して栄養素の交換のため表面積が必要です。したがって、5 日間の古いマウス卵巣のサイズが理想的との器官培養形状します。文化では、7 日間のために維持の卵巣をこのプロトコルを最適化した、特定の科学的な質問1,4によると卵巣文化長さを調整できます。わずか 3 日間の培養と 10 日 (データは示されていない)、限り卵巣でも 10 日間は大きく、文化として有効ですが、プロトコルの制限をこのように強調表示ではないかもしれないより古い動物から卵巣と同等の結果を実現しています。
前のヴィヴォ卵巣の培養が必要でない場合を修正し、変更はより大きい組織のサイズ9,16を調整する必要がありますが、説明されたプロトコルで古い卵巣を染色することが可能です。大きい卵巣どちらか長い抗体培養手順や組織を分割することができますいくつかのより小さな部分を染色することが可能があることを示す臓器に抗体の受動拡散に依存説明汚損のプロトコルイメージング後再構築します。尿素とグリセリンとクリアリング業者 (ScaleA2)8,10報告に比べて短い潜伏期間が必要なため新生児培養卵巣の効果を証明したエージェントをクリア ScaleS(0) 中のソルビトールと尿素の使用.さらに、水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) 透過溶液中の低濃度の使用バック グラウンド ノイズを減少し、サンプルは第一次および二次抗体の孵化を長く、一緒に促進組織の奥深くに染色。さらに、透過、洗浄溶液で PVA を使うと、スプリアス粒子組織17,18にこだわることを防止できます。
このプロトコルでは培養正常な卵巣は異常な卵巣が固定と処理からデタッチしながら挿入膜にアタッチされます。鉗子でゆるい組織を処理と、卵巣およびありそうな妥協イメージングが損傷します。また、緩やかな組織を 5% アガロース プラグに埋め込まれたまたは先端開放が十分に広いそれを傷つけない限り転送ピペットで処理できます。免疫染色についてこのプロトコルで使用されているもの以外の一次抗体が異なる実行可能性があり、透過とインキュベーションの手順で最適化を必要とする場合があります。
最後に、プロトコルが埋め込まれている伝統的なパラフィン切片に比べて若い卵巣から卵胞の定量化への代替アプローチを記述または他前述の全台紙画像から卵胞の体積の定量化5,9,16. 卵胞発育19の特徴づけるさまざまな段階卵子定量化のプロトコルで説明することができますの研究員の要件、手順に応じて使用されます。セル径を決定し、こうして推論濾胞ステージ ソフトウェアによって生成された粒子領域を使用できます。

細胞構成と哺乳類の卵巣の形態学的特徴を研究するために科学者はしばしば免疫組織学的染色パラフィン埋め込まれた卵巣の続く生体内で実験に依存します。もっと最近しかし、完全な卵巣器官培養が技術することができますより良い可視化と結合するために卵巣機能1,2,3、4を勉強する効果的な代替であると証明し、数量化ツールです。伝統的に、卵巣の形態解析パラフィン埋め込まれた連続切片から、骨の折れる、時間がかかり、連続パラフィン埋め込まれたティッシュの区分であることに加えて再構築の三次元の卵巣アーキテクチャによって異なりますオルガンのない保証の適切な再建をしないとセクションがしばしば紛失またはプロセスで注文ミス。
シリアルセクショニングに関連する技術的な課題に加えて、日常的に卵巣5,6あたりの卵胞数を定量化するために使用方法の変化もあります。現在使用されている方法論的変動研究5,7を越え卵巣予備のメタ分析を損ないます。たとえば、異なる研究論文から卵胞数 10 倍以上特定のひずみ6内と同様の発達年齢間によって異なります。報告された卵胞定量化にこれらの大きな違いは混乱を招く可能性し、クロス研究比較を妨げています。セクションのあらかじめ定義された数の卵胞をカウントすることによって連続切片から卵胞定量化への従来のアプローチを実行する実験的に (例えば、すべての 5 番目、10 番目、または他のセクション)。このアプローチを使用して卵胞数の変動は、切片厚で連続切片5,6を生成する際に技術的な経験だけでなく、セクションはカウント、周期性変化からもを発生します。その変動に加え伝統的なティッシュの別の欠点は、若い動物から小さな卵巣の断面が特に挑戦的な組織向き8に大きく依存することです。
以下のプロトコルは日常的に使用される卵巣文化技術1を記述しますが、クリア組織の物理的な区分および共焦点顕微鏡8 を用いた光学セクショニングを置き換えることによって伝統的な卵胞の定量化に大幅に向上 ,9。クリアで、尿素およびソルビトール ベース組織浸漬 (経頭蓋灌流または電気泳動なし) を使用してソリューションを (例えば、 ScaleS(0)10)、免疫染色と互換性があることを証明し、の減少のため許可イメージングの深さを損なうことがなく時間をクリアします。その他の報告の方法 (例えばScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12、および ClearT212) より多くの時間がかかるまたはサンプルの詳細な光学解像度を許可しません。光の断面は、以下の労働集約型であり臓器の三次元アーキテクチャ7、8を保持ため便利です。このアプローチの別の利点は、サンプルの準備組織をクリアする高価な試薬を必要としない比較的容易に行うことができます。
具体的には、説明されたプロトコルは生後 5 日目の培養マウス卵巣に最適化されていますが、生後 0 - 10 から卵巣を実施しました。メソッドでは、組織が自然にそれが培養、臓器処理や操作を促進する膜につく卵巣培養系。説明文化システムは、explanted 卵巣 10 日間までとどのように異なる実験条件を評価するためには、卵母細胞生存13を妨げる可能性を維持するために使用できます。定量化手順処理パッケージ フィジー ImageJ14非商用画像を使用してされるので、ほとんどのパーソナル コンピューターで行うことができます。さらに、将来のメタ分析することができます、科学的なコミュニティのため、定量化に使用するイメージを広く利用可能にすることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Micro dissecting scissor 4.5&#34;, straight, sharp points</td>
			<td style="width:200px;">Roboz</td>
			<td style="width:117px;">RS-5912</td>
			<td style="width:224px;">Micro dissecting scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jewelers style forceps 4-3/8&#34;, style 5</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Fine tip forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Iris Scissors 4&#34;, straight, sharp points</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-1618</td>
			<td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Minimal Essential Media (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Used in Step 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm Tissue Culture Treated Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nunc&#8482; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>141006</td>
			<td>Pore size: 8&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutator mixer GyroTwister&#8482;</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S1000-A-B</td>
			<td>three dimensional shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103219-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride solution (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl Alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>Cold water soluble</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM 163A</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-MVH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td>Dilution 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-mouse 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-rabbit 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(-)sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240850-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI-ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414044-034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

哺乳類の生殖生物学の分野の研究は、卵巣と精巣の全体的なヘルスを評価をしばしば伴います。具体的には、女性の卵巣のフィットネス頻繁の可視化と定量化卵胞と卵子によって評価されます。卵巣は、不透明な三次元組織は、従来のアプローチは苦心して全体の臓器中の細胞を可視化するために数多くのシリアル セクションにティッシュをスライスを必要です。さらに、このメソッドによって定量化は通常卵のおおよその直径で区切られたセクションのサブセットのみを得点を伴う、ので、不正確になりやすいです。ここでは、プロトコルは、全臓器組織の清算とマウス卵巣卵胞と卵子を視覚化するための免疫蛍光染色を代わりに利用した、説明します。伝統的なアプローチと比較して、このプロトコルは多くの理由で卵巣内の細胞を可視化するため有利である: 1) 卵巣試料調製及び処理全体はそのままセクションすることは困難である 2) 小さな卵巣は容易に調べることができます。3) 携帯電話の数量化をより容易にかつ正確に達成します。・ 4) イメージ全体の器官。

このプロトコルには、六つの主要なステップが含まれている次の卵巣の解剖図 1で説明したよう。図 2, 図 3, 図 4卵巣及びフィジー ImageJ を用いた全ティッシュ卵定量化のクリア組織の最適化を含むこのプロトコルの最も斬新な機能を強調表示します。図 2 aは、卵巣へ追加クリア ソリューション (は右) 後 (左) 前に、の教養 5 日生後固定卵巣と 1 h の画像を示しています。卵巣は、ソリューションをクリアで水没することの数分以内に半透明になるに開始されます。一度クリア、図 2 aのイメージのような小さな卵巣を損なうことがなく処理することは困難となります。したがって、培養 explanted 卵巣での作業は、彼らが培養される挿入膜の多孔質の表面に添付さになるため便利です。挿入膜、卵巣の添付ファイルには、卵巣自体 (図 2 b 、 図 3) ではなく膜挿入を処理する実験者ことができます。また、卵巣の近くで培養がヒューズし、図 2 bを示しています(左)の前に融合した卵巣を添付(右)ヘマトキシリンでクリアした後サンプル。
実行せずにクリアが可能な培養卵巣の光学セクショニングしかし、細胞組織の奥深くが背景から区別するために困難な信号との明確なシグナルの欠如を妨げる適切な卵子の定量化 (図 3 a)。図 3 aと対照をなして図 3 bは、全体の器官を通して卵定量化が可能なクリアのサンプルの代表的なイメージです。図 3 bは、1 (図 3 b) は容易に定量化することができるよう組織と画像内にある深い信号の重要な損失なしクリア培養卵巣の全臓器のイメージングを行うことができることを示しています。など、これらのサンプルの卵母細胞を定量化するための 1 つのアプローチは、最大強度投影光学セクションの z シリーズに変換してイメージ処理パッケージを使用してファイルをさらに処理です。図 4と図 1 の補足は、フィジー ImageJ を用いた図 3Bの卵母細胞の数を定量化するための手順を強調表示します。補足表 1には、フィジー ImageJ の粒子 (卵母細胞) 数量が含まれています。このメソッドを使用して粒子の定量化によりを別包の粒子数と各粒子の対応する領域についてはソフトウェアが計算に提供されるので卵サイズに基づく分析、ユーザー。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57593/57593fig1.jpg"> 図 1: プロトコル全体の概略します。(1) 卵巣の解剖のプロトコルの最初の視覚的な概要に続いて子房培養 (2) 組織固定 4 %pfa (3) 特異的抗体 (4)、(5) をイメージング、光学セクションを使用してを取得深いティッシュをクリアを使用して染色、共焦点顕微鏡 (6) と卵の定量化 (7) で終わる。<a href="/files/ftp_upload/57593/57593fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57593/57593fig2.jpg"> 図 2: 非クリアとクリアの卵巣の組織の不透明度の違いです。(A)卵巣生後 5 子犬 (左) をクリアせず、約 1 h (右) の穏やかなクリア後から。(B)複数卵巣が互いに近くに 7 日間培養します。各サンプルの 2 つの異なる倍率が表示されます。左端の画像が消去と右端の画像は、クリアなしです。卵巣が文化挿入の膜に接続し、プロトコルを通して接続されている場合はうまく対処できます。白色光を用いたイメージングのための組織のコントラストを向上させるために固定後卵巣 5 分ヘマトキシリンで水浸しとなった。<a href="/files/ftp_upload/57593/57593fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57593/57593fig3.jpg"> 図 3: 非クリアとクリアの卵巣の蛍光イメージング。子犬生後 5 日目から卵巣は 7 日間培養したし、説明したプロトコルを汚す全体マウント蛍光によるとステンド グラスします。マウス ヴァーサ相同物 (MVH) 生殖細胞を識別するために、緑のラベルの付いたセルは、セルの核卵母細胞特異的マーカー、p63 の付いたは赤で示しています。DAPI、青、すべての細胞の核をラベル使用だった。(A)清算せず卵巣の像。(B)清算の卵巣の像。<a href="/files/ftp_upload/57593/57593fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57593/57593fig4.jpg"> 図 4: フィジー ImageJ ソフトウェアを使用して卵を定量化する方法について視覚的なワークフローです。データ分析を容易にするため共焦点平面から派生した画像を 3 D イメージではなく最大強度投影に削減できます。最大強度投影では、ユーザーは、ターゲット粒子が明らかになるような方法でイメージしきい値パラメーターを定義できます。単純化されたイメージを取得した後、ソフトウェアを使用して、卵母細胞をカウントします。パラメーターを設定しながら画像を批判的に検討が重要です。この図では、粒子/卵子のしきい値を設定する方法の例を示します。各画像の上にあるテキストは、フィジー ImageJ でそのイメージを取得するために使用するパラメーターを強調表示します。ソフトウェアは、(補足表 1参照) 粒子の面積測定のテーブルを生成します。<a href="/files/ftp_upload/57593/57593fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: フィジー ImageJ ソフトウェア (低倍率) を使用して卵を定量化する方法について視覚的なワークフローです。この図は、近くに二つの卵巣の卵の数量を示します。実行する手順は、図 4のように同じです。2,436 粒子/卵胞は、ソフトウェアによって数えられました。ソフトウェアから得られた数量データに補足表 1になれます。<a href="/files/ftp_upload/57593/Supplemental_Figure1_fix.pdf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足表 1: フィジー ImageJ で卵胞数量計算します。このテーブルには、数えられる卵胞と補足図 1の画像から生成された対応する領域の一覧が含まれています。定量化に使用粒径が 10 μ m2から設定された-無限大。<a href="/files/ftp_upload/57593/Supplementary_table_1.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K ビュー.  Cornell University. シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

発生生物学

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...