快くこのプロジェクトで使用される試料を供給するためオルブリッチ庭園のジョン ・ ワースに感謝したいと思います。この作品は、国民の中心、肺および血の協会で一部サポートされて (G.R.G.、R01HL115282)全米科学財団 (DGE1144804 J.R.G、G.R.G.)、ウィスコンシン大学外科教室と同窓会基金 (H.D.L.)。この作品は、環境保護庁 (星グラント号 83573701)、国立衛生研究所 (R01HL093282 01A1 と UH3TR000506)、全米科学財団 (IGERT DGE1144804) 部分で支えられましたまた。

1. 洗剤ベースのアプローチを使用して植物組織の decellularization
<ol><li>
新鮮なまたは冷凍F. オオバアサガラ葉のサンプルを使用します。-20 ° C のフリーザー (1 年) 将来の使用のための店で未使用の新鮮な試料を凍結します。 注: は、ほぼあらゆる目的の植物の茎や葉の組織を使用します。拡張ストレージ時間は、組織への損傷を引き起こす可能性が。<ol>
<li>サイズとサンプルの意図されていた使用に基づいて処理されるサンプルの形状が決まります (短冊状にカット サンプルすなわち機械的テスト アプリケーションに適しています、一方 8 mm ディスク サンプル ウェル培養アプリケーションに有用であります。).室温 (20-25 ° C) 脱イオン H2o ・水没中パンチ シャープ、きれいな生検で 8 mm ディスクに葉をカットします。 注: このプロトコルは、全体の葉や茎で使用できます。ただし、小さいサンプルが高速 decellularize します。</li>
		<li>室温 (20-25 ° C) 脱イオン H2O の洗浄および/またはそれらを解凍する低速設定に振るプレート セットで 5-10 分のためのサンプルをインキュベートします。十分な脱イオン H2O を使用すると、すべてのサンプルは徹底的に接液します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
適当な容器 (ガラスまたはプラスチックの皿が理想的です) のサンプル 10% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン H2o ・場所でのソリューションを準備し、SDS サンプルを完全にカバーするソリューションを追加します。室温 (20-25 ° C) で 5 日間のサンプルへの損傷を防ぐための低速度に振るプレート セットのサンプルをインキュベートします。 注: は満杯になるコンテナー decellularization プロセスを遅らせるし、SDS によって不均一な治療につながることができます。この手順では、サンプルは、茶色の色調を獲得すべき。<ol>
<li>5 日後に置き換えます SDS ソリューション脱イオン H2o ・加温残留 SDS ソリューションを徹底的に洗い流す振るプレートに追加の 10 〜 15 分のためのサンプル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% (v/v) の非イオン性界面活性剤 10% (v/v) の漂白剤溶液を準備します。500 mL の溶液を作る、非イオン性界面活性剤の 5 mL の漂白剤 50 mL を混ぜて、脱イオン H2o ・ サブマージ 445 mL を加える作りたてのソリューションのサンプルします。 注: 非イオン性界面活性剤/漂白剤の解決は従って長い貯蔵寿命がない、準備の 48 時間以内に使用する必要があります。</li>
	<li>
サンプルが完全にクリアされるまで、非イオン性界面活性剤/漂白剤ソリューションすべての 24 h を置き換える (視覚的比較のため図 1 aを参照してください)。余分な非イオン性界面活性剤/漂白剤溶液を洗い流す純水を 2 分間振るプレート上にサンプルをインキュベートします。振動板を試料の損傷を防ぐために低設定に設定します。 注: 使用サンプルをクリアするために必要な時間は、種類や植物の種類によって異なります。サンプルの完全な変色は、完全 decellularization の示す (徹底したクリアリングを確保するため DNA の定量化を行う)。<ol>
<li>年までそれらを格納するサンプルを凍乾 (液体窒素を用いて凍結フラッシュをお勧め、-80 ° C のサンプルを凍結も可能です)、室温 (20-25 ° C) の低湿度で保管します。</li>
		<li>トリス-HCl (10 mM、pH 8.5) のサンプルを再構成十分なコートのサンプルを使用します。優しく使用 (すなわち使用 150-300 μ L/標準 24 well プレート リンスイン) する前にマイクロ ピペットを使用して血清自由な媒体のサンプル 2-3 回をすすいでください。 注: トリス塩酸バッファーと無血清メディア (すなわちDMEM がメディアを置き換えることができます任意の基本的な細胞培養) 脱イオン H2O だけで治療を受けた人よりも扱われる SDS サンプルの細胞生存率への影響を下げることに効果的です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 洗剤無料 Decellularization アプローチを使用して試料の調製
注: この手順の最初の手順は、手順 1.1 1.1.2 (上記参照) と一致します。
<ol><li>5% (v/v) の漂白剤 (NaClO) と 3% (w/v) (NaHCO3) 重炭酸ナトリウム溶液を準備します。F. オオバアサガラの葉のサンプルにホット プレート攪拌しながら 8 mm ディスクにカットの 60-70 ° C に発煙のフード ソリューションを温めます。 注: 重炭酸ナトリウムは、炭酸ナトリウム (Na2CO3)、または水酸化ナトリウム (NaOH) と代替可能します。所望の温度は大きく (部屋温度 90 ° C) から変化し、使用するサンプルの特性に応じて調整する必要があります。</li>
	<li>ソリューションには、所望の温度範囲が達すると、サンプルが水没、それらが損傷しないように攪拌速度を減らします。サンプルが目に見えてクリア後 (視覚的比較のため図 1 bを参照)、お風呂から慎重に取り外します。脱イオン H2O に余分な漂白剤溶液を削除する 1-2 分で一度サンプルをインキュベートします。 メモ: サンプルをオフに必要な時間はかなり異なることができます。たとえば、全体の葉の茎は、高温のお風呂は完全にオフの時間を取ることができるように、カット パセリが厚い、大きなサンプル中の 10-15 分でクリアできます。</li>
	<li>サンプルを凍結乾燥し、室温 (20-25 ° C) の低湿度で保管します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+from+first+principles+to+state+of+the+art.">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels.">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li><li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" 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著者が明らかに何もありません。

ここで、植物組織を decellularize に 2 つの方法を説明します。ここでは、提示される結果25先行研究の結果と相まって出すプロトコルが可能性があることをお勧めの広いスペクトルに適用される植物種と茎と葉の両方で実行できます。これらの手順は単純な特殊な機器は必要ないので植物 decellularization は、ほとんどの実験室で行うことが。それは decellularization 後、足場必要が哺乳類の細胞接着を促進する官能基化する注目に値するです。哺乳類細胞接着と組織されている植物の成長を有効にする別の機能化技術は25現在原稿のないトピックは他の場所で説明します。
ここで紹介する decellularization プロトコル両方 (図 1) の最後のステップは彼らの成功に批判的であった。いずれかの方法を実行するはこのお風呂が混雑ないときは不均一なクリアになります。これらのメソッドは、全体の葉と茎; に適用できます。しかし、これはそれらをクリアするために必要な時間の長さを増加します。サンプルがサンプル全体を通して一貫性のあるクリアを維持する完全水中に沈むことを確認します。理想的には、構造上の損傷を最小限に抑えながら植物組織のほとんどの携帯電話の問題をクリアしてください decellularization。そう、洗剤無料法目的の標本と動作するように必要に応じて変更できることです。風呂温度が高い高速回のクリアがありますが可能性がありますもより多くのダメージ サンプル以上孵化している場合。低温培養時間が長くなる場合がありより壊れやすいサンプルに適しているでしょう。漂白剤溶液中の濃度を加速または減速 decellularization プロセスに変更もできます。洗剤無料メソッドで使用するための新しいサンプルをテストする場合はお勧めで開始する decellularization (理想的には 15-20 分毎) の進捗状況のチェックを頻繁に 50-60 ° C の風呂の温度、十分にクリアされるまで。この温度範囲は、手法の最適化中にテストされた植物種のほとんどがよく容認されました。完了時に、サンプルを視覚的に検査することができます、手動で過剰培養、として取り返しのつかない損傷されているないようにによって示される涙やお風呂から除去時に崩壊。このアプローチを使用したサンプルで細胞増殖に対するより少ない影響を示します (図 3 aを参照) のみ脱イオン H2o ・洗浄洗剤ベース アプローチよりもただし、トリス-HCl (10 mM、pH 8.5) でさらに洗浄および無血清のメディア、特に敏感なアプリケーションにそれをお勧めします。
洗剤 (SDS) 法はほとんどほとんどの植物種に適用される最小限の物理的な攪拌が必要なために、全体の葉と繊細なサンプルをクリアするためにとても便利です。前述のように、最後の手順は、サンプルの decellularization の重要なです。個別の物理的性質を持つサンプルは、非イオン性界面活性剤お風呂でインキュベーション時間を調整することによってクリアできます。このプロセスの重大な欠点は脱組織がその後哺乳類細胞の細胞の代謝活動に影響を与えることができます使用すると、洗剤の痕跡を含む場合があります。したがって、使用する前に徹底的な洗浄ステップを踏みます。ここでトリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.5) 血清無料メディアの順で洗浄のサンプルが H2O (図 3 b)、使用前に純水で洗浄したものよりも高い細胞生存率を持っていたことが分かった。
いずれかの方法で将来使用するため未処理のサンプルを格納する、結果の足場に影響が及ばないかどうかことを確認への損傷のためにそれらを監視することが重要です。被害は、割れや過度の脆さを処理するときと同様、植物組織の変色として表示できます。彼らがなくなった前に、それらを活用するように週単位でサンプルを監視し、処分する必要があることをお勧めします。損傷の発症は、長く太くより堅牢なサンプルの試料の種類によって異なります。
一般に、植物は、生体材料の潜在的なソースとして多くの約束を保持します。これは、当然のことながら開発された複雑な構造に支えられて、それらを助ける特性は彼らのネイティブ環境で育ちます。ティッシュ工学足場として植物組織の成功率は、高コスト、かつ、生体材料をデザインする困難を潜在的に安価な代替を提案します。直接の空間指向の細胞成長25に本質的に 1 つの種から別異なります、植物組織の凹凸が活きます。たとえば、以前の研究では、ひと細胞に応答する地形キュー脱植物25、現在こうしてこれらの足場は高度に組織化されたパターン25で細胞の培養に使用ことができますを示しています。組織工学に望まれるもう一つの特徴は、 de novo perfusability です。植物組織は何百もの何百万の流体輸送に非常に効率的に年かけて進化してきた、自分の血管のネットワークは、効率的に灌流24をすることができます。このプロパティは、細胞運動と血管新生の臨床応用のための交換組織を作成する究極の目標をガイドする可能性のある使用できます。これは高表面積と相互接続された多孔性材料、細胞増殖及び注入時に資する実証先行研究の知見に支えられて生体内で、宿主細胞の内部移動を有効にします。37,,363938,インプラント。高表面積と相互接続された気孔は植物組織40,41,42の特徴であるも、こうして植物由来足場周囲の組織と統合する可能性があります。生体内で。また、最近の研究は、セル24脱葉することができます正常に灌流ことと脱植物組織の細胞が播種されたとき、彼らはその地形的な合図25に適合を発見します。とき撮影のすべて一緒に、植物由来の足場は、エンジニア リング アプリケーション組織に向かって正常に適用するのに必要なプロパティを所有しています。

組織工学生体組織を作成する 1980 年代の代理および可能性のあるアドレス重要な臓器不足1。1 つの戦略は、足場を刺激し、行方不明の組織や臓器を再生する体をガイドに使用しています。高度な 3次元印刷を作り出した独特な物理的性質の足場などにアプローチを製造、達成可能な物理的な生物的特性の多様な範囲の足場を製造する能力がチャレンジ2,3。 また、機能血管ネットワークの不足は、これらの技術が限定されていました 3 次元組織を再生します。足場として脱動物と人間組織の使用が回避この問題4,5,6,7で支援します。ただし、高コスト、バッチ間の可変性および限られた可用性の広まった使用を制限可能性があります脱動物骨格の8。患者に潜在的な病気の感染やいくつかの哺乳類ティッシュの脱9に対する免疫学的反応の懸念もあります。
セルロース、植物および細菌のソースから派生は、再生医療で幅広い用途のためのバイオマテリアルを生成する広く使用されています。いくつかの例があります: 骨10、11、軟骨12,13,14と創傷治癒の15。足場を構成するセルロースの耐久性と耐性を哺乳類細胞によって分解されている付加的な利点があります。これは、哺乳類細胞はセルロース分子を分解に必要な酵素を生成しないためにです。比較では、足場はコラーゲンなどの細胞外マトリックスから高分子を使用して生産、16容易に分解され、長期的なアプリケーションには適していない場合があります。コラーゲンの足場は、化学架橋により安定化することができます。ただし、足場17の生体適合性に影響を与えるゲルビーズの固有の毒性のためのトレードオフがあります。逆に、セルロースには、哺乳類細胞18,19,20による酵素分解に不浸透ではないため長時間の注入のサイトで存在を維持する可能性があります。これは加水分解前処理の分解の率およびセルラーゼ21足場の共同配信をチューニングすることによって変更できます。植物由来セルロースの脱足場体内の生体適合性は、マウス22に行われた研究で実証されています。
進化の何百万年の何百も、植物はその構造と流体輸送と保存の効率を高めるための構成を洗練しています。工場血管は、小型船の場合、マレーの法23によると哺乳類の血管のように分岐することで油圧抵抗を最小限に抑えます。Decellularization 後、植物の相互接続された毛穴と血管の複雑なネットワークは維持されます。、すぐに利用できる異なる植物種の膨大な数を考慮した植物由来足場現在組織工学24,25の足場に影響を与える設計上の制限を克服するために可能性があります。例えば、Modulevskyらは脱アップル組織は皮下22マウスの背中に移植されたときに血管新生や細胞の移行が発生したことを示した。同様に、Gershlakらは、血管内皮細胞を脱葉24の血管内で成長するかもしれないことを示した。別の実験では、Gershlakらは心筋細胞が葉の表面上に成長させることができる、24を契約することができたことを示すことができるも。
植物には、複雑な組織を細胞からマクロ スケールで培った高度な製造技術とも達成するために困難であるにも含まれます。植物組織の複雑な階層設計、それらを彼らの成分26の合計よりも強く。植物は堅く、堅い茎等に至る種々 の機械的特性の茄多を持っている、27の葉よりフレキシブルで柔軟なものにします。葉は、サイズの面で種によって異なります、形状、破壊強度、血管新生、性、親水性の程度が異なるを運ぶことができます。全体的にみて、これらの植物のプロパティは、脱植物がティッシュ工学足場などのユニークで高機能な医療機器として使用できることを提案します。
このプロトコルは植物組織を decellularize に 2 つの方法に焦点を当てて、ようの葉し、茎、再生組織工学における足場として使用するため。最初の方法は DNA および哺乳類 decellularize し、組織6,22,25 を植物に広く使われている技術から適応されている携帯電話の問題を削除する風呂のシリーズを使用して洗剤ベースの技術 ,28,29,30。2 番目のメソッドは洗剤無料、一般に葉31の軟部組織を削除するために使用「白骨」プロトコルから適応。前の仕事を示したことは血管の周囲の軟部組織の31からの分離を促進漂白剤と炭酸水素ナトリウムの溶液に葉をぐつぐつ煮えます。この手法は、17回と 18th世紀、アルベルトゥスマグヌス セバ32とエドワード ・ パリッシュ33の仕事などで行う実験に引用できます。これらの実験は、葉や果物などの植物の問題を残すことのまわりの中心は長時間水に浸漬時間 (週か月) と当然のことながら朽ち果てるに柔らかい組織を許可します。ここで「白骨化」アプローチは、細胞残渣を削除する、かなり軟部組織構造を崩すことを避けるために低温培養時間が長くなるなど、穏やかな条件を使用する適応されます。ここに詳細な実験、3 つの植物のタイプを使用しました:イチジク オオバアサガラ、パキラアクアティカとフクギの種。DNA の定量化、機械テスト、および両手法による細胞の代謝活性に与える影響の結果を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:136px;">75746-1KG</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:136px;">807426</td>
			<td style="width:277px;">Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td style="width:111px;">Clorox</td>
			<td style="width:136px;">Item #: 31009</td>
			<td style="width:277px;">Standard concentrated bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">217120010</td>
			<td style="width:277px;">Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">8 mm Biopunch</td>
			<td style="width:111px;">HealthLink</td>
			<td style="width:136px;">15111-80</td>
			<td style="width:277px;">Cuts samples that fit well in 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Belly Dancer-Shake table</td>
			<td style="width:111px;">Stovall Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">BDRAA115S</td>
			<td style="width:277px;">Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Isotemp hot/stir plate</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any style/brand of hot/stir plate.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Beaker</td>
			<td style="width:111px;">Any</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP153-500</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">MT50003PC</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Quant-iT Picogreen dsDNA assay</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:136px;">P11496</td>
			<td style="width:277px;">Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two methods for decellularization of plant tissues for tissue engineering applications

組織置換のための足場として使用されて自己、合成、動物由来の移植率の低い、貧しい生体適合性、コストなどの制限があります。植物組織に適して表面積が大きく、優れた水の輸送と保存などの足場として相互接続された気孔率、既存の血管ネットワーク、および機械の広い範囲を使用して、それら有利な特性を持っています。プロパティ。組織工学用植物 decellularization の 2 つの成功した方法は以下のとおりです。最初の方法は、洗剤お風呂使用の哺乳類ティッシュをクリアする以前に確立された方法に類似している携帯電話の問題を削除するに基づいています。2 番目の葉の血管系を分離し、葉と茎をクリアする塩浴と温水の漂白剤の使用を含むプロトコルから適応洗剤無料メソッドです。両方のメソッドは、同等の機械的性質と低細胞代謝の影響より良い自分の用途に合ったプロトコルを選択するユーザーをできるように足場を得られます。

両方の方法は、細胞培養と組織エンジニア リング アプリケーションにより適していた足場を得られました。図 1は、洗剤手法や洗剤を使用しない方法のために切断された試料 (直径 8 mm) をそのまま葉を使用して decellularization プロセスの一般的なワークフローを示します。フィカス オオバアサガラ組織両方の方法を次の成功した decellularization は、はっきりとそのままのサンプル (図 1Aおよび1 b) を得られました。全体植物組織 (図 1 a); を decellularize することが可能だったしかし、小さいサンプルより速くより効果的にオフに登場。洗剤ベースのアプローチで観察される潜在的な問題には、非イオン性界面活性剤浴 (図 1) から早期の削除の結果として異種 decellularization が関与しています。洗剤を使用しない方法の欠点は、温水浴 (図 1) で長期間の加温による損傷が発生することです。
両方の方法を使用して準備脱足場の機械的性質は、他研究24,34で行っていたように一軸引張試験を用いて検討しました。このテストには、最大接線弾性係数 (MTM) (図 2 a)、障害 (SAF) (図 2 b) および最終的な引張強さ (UTS) (図 2) F. オオバアサガラとパキラアクアティカサンプルのひずみが得られました。両方 decellularization プロトコルを使用してp. アクアティカ試料は、測定パラメーターのすべての 3 つの間で同様の機械的性質を表示されます。F. オオバアサガラサンプルは、テスト、UTS を除くすべてのケースで同様の傾向を示した。特に、洗剤ベース (SDS) プロトコルを使用して作製したサンプルは、無料の洗剤 (漂白剤) アプローチで調製したものより高い平均 UTS 結果を持っていた。これらの結果は、別の植物種から採取した異なる脱足場プロパティ 2 つの decellularization プロトコル経由で準備したとき生成するかもしれないことを示します。
いずれかの方法を使用してサンプルをクリア、DNA 除去を測定してゲノム DNA が以前に確立されたプロトコル35を使用して分離されました。両方の decellularization 方法 (洗剤ベースし、洗剤無料) 有意に減少した 2.47 サンプルのゲノム DNA の内容 ng の DNA/mg (n = 3、s = 0.18) 2.71 と組織の DNA/mg の ng (n = 3、s = 1.60) それぞれ (図 2 D)。サンプルの非脱いた 104.67 組織の DNA/mg の ng (n = 3、s = 26.21) (図 2 D)。Decellularization は、植物細胞の効果的な除去を示された後の DNA 量の大幅減の問題します。
2 つの decellularization 方法の細胞生存率への影響は、ひと皮膚線維芽細胞 (hDF) 脱p. アクアティカやガルシニア足場存在下で 2 日間の培養の代謝活性を測定することによって評価されました。hDFs は、高い代謝活性洗剤ベースのメソッド (図 3 a) 準備と洗剤無料メソッドを介して脱足場の存在下で培養した場合を持っていた。確保するための準備の足場に細胞培養前広範囲洗浄した decellularization、追加実験のセットの中に使用する試薬の徹底的な除去を行った。2 つの別の洗濯方法は洗剤ベースのアプローチを使用したサンプルでテストされた: トリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.5) の洗浄に続いて対血清無料メディアの洗浄 2 洗浄脱イオン H2o.両方のアプローチは、1 × PBS で最終的な洗浄ステップを使用しました。脱プラント足場に続いてさらさ哺乳類細胞への影響は、上記と同じ代謝活性アッセイを用いて測定しました。トリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.5) 血清無料メディア続いて助け脱イオン H2O、サンプルから洗剤無料サンプルに匹敵する洗剤ベースのアプローチで治療を行うと比較して細胞の代謝活性に対する影響を軽減メソッド (図 3 b)。
以前洗剤ベースのアプローチ25; を使用した足場で哺乳類細胞を育てることができることが示されました。したがって、以前テストされていない洗剤無料法により作製したサンプルにこれを実証する必要があります。間葉系幹細胞 (MSCs) 播種足場あたり 20,000 セルでF. オオバアサガラの葉のサンプル (8 mm ディスク) を脱し、24 時間インキュベートすること。これらの足場は付着を容易にする RGD ドーパミン共役セル導入前に機能されました。図 4は、典型的なサンプルから収集した画像を示します。明視野像は、使用サンプル (図 4 a) のセクションの全体の構造を表示する収集されました。MSCs は、カルセインを使用して蛍光顕微鏡を用いた (図 4 b) のイメージに染色された.画像は、葉の表面に成長のセルの位置を表示する (図 4) をかぶせていた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig1.jpg"> 図 1.植物組織の decellularization の一般的なワークフローです。(洗浄と準備は、普遍的な) 植物組織の decellularization の一般的なワークフロー(A) 上のパスは、洗剤を使用しないメソッドの洗剤ベース メソッド (B) 底。F.オオバアサガラの非イオン性界面活性剤/漂白剤風呂 (D) は破損している decellularization からの早期除去による洗剤ベースのメソッドを使用してp. アクアティカ葉の (C)、不完全な/失敗しました decellularization長期間加温温水により洗剤を使用しない方法でソリューションを漂白剤します。<a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig2.jpg"> 図 2.機械的性質と方法間の decellularization の有効性の比較。平均 ± SD;統計的分析を行った 2 標本 t 検定とp値が統計的に有意な (以下 0.05 〜) を使用します。F. オオバアサガラのサンプルとp. アクアティカ(洗剤ベースのアプローチ、洗剤フリーの赤と緑の未処理のサンプルに使用される青いバー) の機械試験の比較 (F. オオバアサガラ洗剤ベース n = 4、洗剤無料 n = 2;P. アクアティカ洗剤ベース n = 3、洗剤無料 n = 4) 障害 (SAF) (C) および最終的な引張強さ (UTS) の (A) 最大接線弾性率 (MTM) (B) ひずみ。3 つのサンプルのそれぞれのグループから 3 通で (D) A dsDNA 定量化分析を実行した: 未処理 (新鮮な n = 3)、洗剤無料メソッド (ブリーチ、n = 3) と洗剤ベースのメソッド (SDS、n = 3)、 p値は、decellularization メソッド未処理のサンプル グループと比較グループ。<a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig3.jpg"> 図 3.2 つの decellularization メソッドの間の影響の比較代謝活性アッセイ結果。平均 ± SD;統計的分析を行った 2 標本の t 検定を使用して、 p値が統計的に有意な (以下 0.05 〜)。細胞の代謝活動をp. アクアティカとガルシニア(追加なしのサンプル コントロールの井戸に正規化) の種の両方の組織サンプルの存在下で測定した 2 つの代謝への影響 (A) の比較を表示するにはdecellularization メソッド (n = 各グループの 3) の 2 つを使用して代謝の活性への影響 (B) 比較洗浄洗剤ベースのプロトコルで、: トリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.5) 血清無料メディアと組み合わせる (n = 4)対H を脱イオン2O (n = 4)。<a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig4.jpg"> 図 4.間葉系幹細胞 (MSCs) の表面上に成長脱フィカスオオバアサガラ RGD ドーパミン共役機能します。MSCs は、 F. オオバアサガラ葉で栽培され洗剤無料法による脱、RGD ドーパミン共役 (500 μ m スケールの参照のバーが追加された) 官能基化 (A) 明視野イメージ脱葉 (B の部) カルセインの蛍光画像ステンド MSCs 葉表面 (C) 結合される明るいフィールドと蛍光画像を成長しています。<a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法

ここで私たちは、現在し、コントラストの 2 つのプロトコルを使用して植物組織を decellularize: 洗剤ベースのアプローチと洗剤無料アプローチ。両方の方法は、組織工学用の足場として利用することができます使用、植物組織の細胞外のマトリックスを残します。

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. ここで私たちは、現在し、コントラストの 2 つのプロトコルを使用して植物組織を decellularize: 洗剤ベースのアプローチと洗剤無料アプローチ。両方の方法は、組織工学用の足場として利用することができます使用、植物組織の細胞外のマトリックスを残します。

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

生物工学

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

全肝臓の細胞化とRecellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...