This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

L.からスポロポレニン外膜カプセルの1の抽出（SECS） clavatum胞子注：SEC抽出プロセスはの可燃性粉末（L.のclavatum）、ホット腐食性の酸、及び可燃性の溶剤、したがって、適切な個人用保護具（ゴーグル、フェイスマスク、手袋、白衣）、使用上の承認されたリスクアセスメント、および廃棄を伴います許可された実験室の担当者による化学物質が不可欠です。 <ol><li> 胞子脱脂 <ol><li>ガラス冷却器、水循環システム、及び水浴（ 図1）を用いて換気フード中で還流セットアップを準備します。 </li><li> 100グラムL.を計量clavatum胞子ほこりを作成せずに離れいかなる発火源から。 注：ここで使用される胞子は、商業的に入手した（材料リストを参照してください）。 </li><li>ゆっくりと1Lのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、磁気攪拌棒を備えた丸底フラスコに移し胞子。 </li><li>胞子に500ミリリットルのアセトンを追加します。PTFEフラスコと均質な懸濁液を形成するために軽くフラスコを振ります。 </li><li> 50℃に設定した水浴中にPTFEフラスコを置き、還流冷却器に接続します。 </li><li> 200rpmで攪拌しながら6時間アセトン中で還流を行い、その後、室温で冷却させます。 </li><li>真空下、濾紙を用いて懸濁液を濾過し、大きな（直径15cm）をガラスペトリ皿に脱脂胞子を集めます。 </li><li>溶媒を蒸発させるための穴をアルミホイルで覆うことにより、室温（ヒュームフード）で胞子を乾燥させます。 </li></ol></li><li> 酸分解 <ol><li> 85％を準備し、脱イオンと（v / v）のリン酸（DI）水および1LのPTFEフラスコに脱脂乾燥胞子を転送します。 </li><li>脱脂胞子にリン酸（85％v / vの）の500ミリリットルを追加します。 </li><li> 70℃に設定した水浴中にPTFEフラスコを置き、還流冷却器に接続します。 </li><li> 30時間リン酸中で穏やかな還流（70℃）を行い、その後に許可室温で冷却。 </li><li> 500 mlの温かい脱イオン水を使用して懸濁液を希釈し、濾紙を用いて真空ろ過によりSECSを集めます。 </li><li>洗浄液のシリーズを実行するために3リットルのガラス製ビーカーにSECSを転送します。 </li></ol></li><li> SECの洗濯 <ol><li>ヒュームフードにSECSを含む3 Lのガラスビーカーを置きます。 </li><li> 10分間穏やかに攪拌しながら秒に800ミリリットル熱い（50℃）DI水を追加します。 </li><li>ろ紙と真空濾過セットアップを使用してサスペンションをフィルタリングします。 </li><li>きれいな3LのガラスビーカーにSECSを収集します。 </li><li>繰り返しは、1.3.1を繰り返します。 1.3.4。五回。 </li><li> 10分間穏やかに攪拌しながら秒に600ミリリットル熱い（45℃）のアセトンを追加します。 </li><li>真空下で濾過によりSECSを収集し、クリーンな3リットルのガラス製ビーカーにSECSを転送します。 </li><li>繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（50°C）、2 M塩酸を用いて。 </li><li>繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホ600ミリリットルを使用して、T（50°C）、2 M水酸化ナトリウム。 </li><li>繰り返しは、1.3.1と1.3.4を8回繰り返します。 </li><li>繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（45℃）アセトンを使用。 </li><li>繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（45°C）エタノールを使用。 </li><li>繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット800ミリリットル（50°C）DI水を使用。 </li><li>すべての水分を除去するために、室温で24時間ドラフト内で6大きなガラスシャーレとドライにきれいなSECSを転送します。 </li><li> 60℃、10時間、または一定重量になるまで1ミリバールの真空の真空オーブン中で秒を乾燥させます。 </li><li>乾燥したSECSを収集し、ポリプロピレンボトルに移します。 </li><li>乾燥キャビネットにSECSを保管してください。 </li></ol></li></ol> SECSの2キャラクタリゼーション<ol><li>さまざまな段階で生産さ胞子とSECSを使用して、走査型電子顕微鏡分析41を行います。 </li><li>さまざまな段階で生産さ胞子とSECSを使用して元素分析41を行います。 D元素分析の前に、少なくとも1時間60℃ですべてのサンプルRYと6.25の増倍率で％の窒素を使用して、タンパク質含有量を計算する。11、各試料について三重の測定値を使用して結果を取得します。 </li><li>動画粒子分析器を使用してmicromeritic特性分析を行う。41 </li><li>共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、未処理のスキャン処理、及びFITC-BSA-ロードさ秒41 </li></ol>真空装填法による3.生体高分子カプセル化<ol><li> DI水、50 mlのポリプロピレンチューブへの転送を使用して125 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）溶液1.2 mlで調製します。 </li><li> SECS 150mgのを秤量し、BSA溶液に移します。 </li><li>均一な溶液を形成するために10分間チューブをボルテックス。 </li><li>ろ紙を使用してチューブをカバーしています。 </li><li> 1ミリバールの真空で4時間、凍結乾燥機フラスコや乾燥にチューブを転送します。 </li><li>手順3.1を実行します3.5。三つの独立したバッチのため。 </li><li> BSA-ロードSECSを収集し、乳鉢と乳棒を使用して凝集物を除去します。 </li><li> 50ミリリットルチューブにBSA-ロードされたSECSを移し、残留BSAを除去するために、2ミリリットルのDI水を追加します。 </li><li> 5分間4704×gで遠心分離することによってSECSを収集し、上清を捨てます。 </li><li>一度DI水での洗浄を繰り返します。 </li><li>ろ紙を用いてBSA-ロードSECSを含むチューブをカバーしています。 </li><li>冷凍庫（-20℃）にSECSを移し、1時間凍結します。 </li><li>さらなる特性まで冷凍庫で24時間とストアのSECSを凍結乾燥します。 </li><li>ステップ3.1と同様の手順を使用して、BSAを含まないプラセボSECSを準備します。 3.13に。 </li><li> 3.1の手順と同様の手順を使用してFITC-BSAロードされたSECSを準備します。 3.13に。 </li></ol>カプセル化効率の4決意<ol><li> 2ミリリットルポリプロピレンチューブ中のBSA-ロードされたSECS 5mgを秤量します。 </li><li> 1.4ミリリットルホスファを追加TEは、5分間の生理食塩液pH7.4（PBS）と渦緩衝しました。 </li><li>プローブは、10秒の3サイクルの間、40％の振幅でサスペンションを超音波処理します。 </li><li> 0.45μmのポリエーテルスルホン（PES）フィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。 </li><li>ステップ4.1と同様の手順を実行します。 4.4。プラセボSECSを使用。 </li><li>ブランクとしてプラセボを用いて280nmでの吸光度を測定します。 </li><li> BSAの量は、PBS中のBSA標準曲線（200〜1000μgの/ ml）を用いてカプセル化された定量化する。42 </li></ol>

<ol>
	<li>Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporopollenin+micro-reactors+for+in-situ+preparation,+encapsulation+and+targeted+delivery+of+active+components.">Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components.</a> J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).</li><li>Barrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , (2008).</li><li>Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+Form.">Dosage Form.</a> US Patent. , (2009).</li><li>Lorch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+contrast+agent+delivery+using+spore+capsules:+controlled+release+in+blood+plasma.">MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma.</a> Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).</li><li>Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+bioavailability+of+eicosapentaenoic+acid+from+fish+oil+after+encapsulation+within+plant+spore+exines+as+microcapsules.">Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules.</a> Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).</li><li>Barrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporopollenin+exines:+A+novel+natural+taste+masking+material.">Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material.</a> LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).</li><li>Barrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+plant+spore+exine+capsules+for+microencapsulation.">Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation.</a> J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).</li><li>Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+living+cells+into+sporopollenin+microcapsules.">Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules.</a> J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).</li><li>Diego-Taboada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration+of+edible+oil+from+emulsions+using+new+single+and+double+layered+microcapsules+from+plant+spores.">Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores.</a> J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).</li><li>Diego-Taboada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+free+microcapsules+obtained+from+plant+spores+as+a+model+for+drug+delivery:+Ibuprofen+encapsulation,+release+and+taste.">Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste.</a> Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).</li><li>Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+grains+for+oral+vaccination.">Pollen grains for oral vaccination.</a> J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).</li><li>Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., Gaonkar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+24.">Ch 24.</a> Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. , 283-297 (2014).</li><li>Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+Pollen+Shells+to+Enhance+Drug+Delivery.">Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery.</a> Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+novel+rape+pollen+shell+microencapsulation+and+its+use+for+protein+adsorption+and+pH-controlled+release.">Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release.</a> J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).</li><li>Archibald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+iron+interact+with+sporopollenin+exine+capsules?+An+X-ray+absorption+study+including+microfocus+XANES+and+XRF+imaging.">How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging.</a> J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).</li><li>Southworth, D., et al., Blackmore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+10.">Ch 10.</a> Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. , 193-212 (2013).</li><li>Stanley, R. G., Linskens, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , 307 (1974).</li><li>Ariizumi, T., Toriyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+sporopollenin+synthesis+and+pollen+exine+development.">Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).</li><li>Mundargi, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Sunflower+Pollen+as+a+Drug+Delivery+Vehicle.">Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle.</a> Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).</li><li>Mundargi, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopodium+Spores:+A+Naturally+Manufactured,+Superrobust+Biomaterial+for+Drug+Delivery.">Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).</li><li>Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+Formulations+Containing+Sporopollenin.">Topical Formulations Containing Sporopollenin.</a> US Patent. , (2007).</li><li>Zetzsche, F., Huggler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+&#252;ber+die+Membran+der+Sporen+und+Pollen+I.+1.+Lycopodium+clavatum+L.">Untersuchungen &#252;ber die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L.</a> Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).</li><li>Zetschke, F., Kaelin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+&#252;ber+die+membran+der+sporen+und+pollen+v.+4.+Zur+autoxydation+der+sporopollenine.">Untersuchungen &#252;ber die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine.</a> Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).</li><li>Zetzsche, F., Vicari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+&#252;ber+die+Membran+der+Sporen+und+Pollen+III.+2.+Picea+orientalis+Pinus+silvestris+L.,+Corylus+Avellana+L.">Untersuchungen &#252;ber die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L.</a> Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).</li><li>Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Konstitution+des+Lycopodium-Sporonins,+des+Tasmanins+und+des+Lange-Sporonins.+XI.+Mitteilung+&#252;ber+die+Membran+der+Sporen+und+Pollen.">Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung &#252;ber die Membran der Sporen und Pollen.</a> Journal f&#252;r Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).</li><li>Shaw, G., Yeadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+studies+on+the+constitution+of+some+pollen+and+spore+membranes.">Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes.</a> Grana. 5 (2), 247-252 (1964).</li><li>Shaw, G., Yeadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+studies+on+the+constitution+of+some+pollen+and+spore+membranes.">Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes.</a> J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).</li><li>Dom&#236;nguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+sporopollenin:+degradation+and+structural+elucidation.">Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation.</a> Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).</li><li>Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+controlled+release+formulations+of+5-fluorouracil+from+natural+Lycopodium+clavatum+spores.">Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores.</a> J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).</li><li>Orhan, I., K&#252;peli, E., &#350;ener, B., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+anti-inflammatory+potential+of+the+clubmoss,+Lycopodium+clavatum+L.">Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L.</a> J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).</li><li>Baytop, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Therapy with medicinal plants in Turkey. , 334-335 (1999).</li><li>Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+potentials+of+a+plant+extract+(Lycopodium+clavatum)+on+mice+chronically+fed+hepato-carcinogens.">Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).</li><li>Ma, X., Gang, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lycopodium+alkaloids.">The lycopodium alkaloids.</a> Nat. Prod. Rep. 21 (6), 752-772 (2004).</li><li>Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopodine+triggers+apoptosis+by+modulating+5-lipoxygenase,+and+depolarizing+mitochondrial+membrane+potential+in+androgen+sensitive+and+refractory+prostate+cancer+cells+without+modulating+p53+activity:+signaling+cascade+and+drug-DNA+interaction.">Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction.</a> Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).</li><li>Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+potential+of+Lycopodium+clavatum+and+Cnicus+benedictus+hydroethanolic+extracts+on+stressed+mice.">Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice.</a> Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).</li><li>Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+better+understanding+of+pharmacological+activities+and+uses+of+phytochemicals+of+Lycopodium+clavatum:+A+review.">A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review.</a> J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).</li><li>Mundargi, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+sporopollenin+exine+capsules+from+sunflower+pollen+grains.">Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains.</a> RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).</li><li>Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Polyethylene+Fractionation+Using+the+Statistical+Associating+Fluid+Theory.">Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory.</a> , (2000).</li><li>El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+wet+process+phosphoric+acid+by+decreasing+iron+and+uranium+using+white+silica+sand.">Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand.</a> J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).</li><li>Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+Controlling+Chemical+Additives+for+Phosphoric+Acid+Production+Plants.">Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants.</a> Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).</li><li>Mundargi, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eco-friendly+streamlined+process+for+sporopollenin+exine+capsule+extraction.">Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction.</a> Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).</li><li>Smith, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , 182 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この作品、L.からSEC抽出の体系的な分析ではclavatumの胞子を提示し、この報告書はまた、既存の一般的に使用されるプロトコルの重要な合理化を達成しつつ、より高品質のカプセルを製造することが可能であることを示している。高い処理温度（180°C）を必要とする既存のプロトコルとは対照的に11と長いプロセス時間（7日）、11現在のSEC抽出処理の最適化は、主に酸分解工程の温度および持続時間を減少させることに集中していました。 脱脂やアルカリの治療は、胞子からsporoplasmic材料の最小限の除去を提供します。しかし、120時間の5時間からアシドリシスはsporoplasmic材料の最大量を除去しました。結果は、70（総処理時間と温度が急激に従来の技術、11から減少し、わずか30時間で、適度な温度のことをすることができることを示しました°C）は、リン酸、最適な品質のカプセルを提供しました。また、30時間の酸分解を超えて、それはSECSはSECSのバッチ全体が、全体的な構造的完全性の減少を示すことができることを示唆し、破砕し始め、粒子断片の有意な増加が認められたことが判明しました。さらに、それことに留意すべきであるL. clavatumは比較的堅牢スポロポレニン、2を含むと考えられ、そのような酸濃度、温度、および/または加水分解の持続時間として、このプロトコルに関与する具体的な処理条件は、他の花粉種のために調整する必要があること。 これは、酸分解のみによってSECSの生産は30時間利回り清潔で無傷のSECSのためのリン酸（85％v / vの）を使用していることが示された。41データは酸分解がSEC生産における重要なステップであることを確認します。最後に、酸のみのSECSはBSAのカプセル化のために使用され、負荷の高い程度を観察しました。ロードワット内部SECキャビティ圧が強制的に空のカプセルにBSA溶液を描画するように変更される真空の適用によって達成されます。ナノチャネル（直径15 - 20 nm）を、以前にL.の外膜壁において同定されていますclavatum、7は解決策が大きな内部キャビティ内に入ることを可能にします。充填後、カプセルは、自由流動性粉末を得るために、凍結乾燥機中で洗浄し、乾燥させました。 サイズの均一性および形態学的特徴は、成功した封入材料の品質を評価するための重要な因子です。 BSA-ロードSECSの観察サイズの均一性と無傷の形態は、マイクロカプセル化アプリケーションのための酸分解-のみ処理SECSの潜在的な使用方法を確認しました。 これらの結果は、SECSの大規模な工業生産のためおよび薬物のマイクロカプセル化におけるSECSの潜在的な用途で大きな関心を刺激するために重要であり、タンパク質、ペプチド、栄養補助食品、栄養補助食品、および化粧品。

マイクロカプセル化の用途に使用するための植物の胞子や花粉から得られる天然植物ベースのカプセルで大きな関心があります。自然界では1月15日 、胞子および花粉は、過酷な環境条件に対して敏感な遺伝物質のための保護を提供します。植物の胞子および花粉の基本的な構造は、典型的には、外殻層（外膜）、内側シェル層（内膜）、内部細胞質の材料を含みます。外膜は、化学的に頑強なバイオポリマー1,9,10,13,16から構成されてスポロポレニンと呼ばれ、内膜は、セルロース系材料から主に構成されている。16-18空カプセルは、細胞質物質を除去するための様々なプロセス7,9によって単離することができます、タンパク質、及び内膜層。2,12,16これらのスポロポレニン外膜カプセル（秒）は、それらの狭いサイズ分布および均一な形態に合成封止材への魅力的な代替手段を提供する。7,9,13,19,20このようなヒカゲノカズラなど様々な植物種からSECSを得るために、標準化されたプロセスの開発は、マイクロカプセル化薬物送達の分野での応用、食品、および化粧品の広い範囲の可能性を開きます。6,10-13,21 秒を得るために、研究者らは、第一の有機溶媒で胞子および花粉を処理し、細胞質の内容物を除去するために、アルカリ性溶液中で還流した。22-25しかしながら 、残りのカプセル構造体は依然としてセルロース内膜層を含むことが決定されました。これを除去するために、研究者らは、しかし、2リン酸と22〜25は、SEC内膜除去の好ましい方法になって、数日間にわたって、塩酸、熱硫酸、または熱リン酸を用いた長期の酸加水分解処理の使用を検討し、進行中年間の研究は、様々な胞子、花粉が私を処理する過酷に弾力性の異なる程度を持っていることが示されていますthods一般的に使用される。26,27一部の胞子や花粉が完全に分解され、強いアルカリ性溶液中のすべての構造的完全性を失う、または重く強い酸性溶液中に損傷している。となる16処理条件にSEC応答の変動は、化学における微妙な変化に起因しています構造と種間スポロポレニン外膜材料の外膜形態。28によりスポロポレニン外膜カプセル（秒）の堅牢性の変動には、胞子や花粉のそれぞれの種の処理条件を最適化する必要があります。 L.の種からの植物の胞子clavatumは SECSの最も広く研究されている単一のソースとなっています。 。その広く普及、低コスト、単分散性、および化学的堅牢性に主であることが提案されている9,29胞子が簡単に1のグループ分けの形でsporoplasmic内容を採取し、含まれていることができます- 2μmの細胞小器官およびbiomolecules。11 L. clavatum胞子は、治療用途の広い範囲のための自然な粉末潤滑剤、化粧品の30,31のベース、30通りと漢方薬32-36で使用されてきました。 L.から得られたSECS clavatumの胞子および花粉の他の種からの秒以下の処理に対してより弾力的であることが示されている。2処理後、得られたSECSは、カプセル化のために、大きな内部空洞を提供しながら、それらの複雑なmicroridge構造と高い形態学的均一性を維持することが示されている。7研究はことを示しているL. clavatum SECSドラッグは、10,13ワクチン、11タンパク質、7,14細胞、8油、5-7,9および栄養補助食品のカプセル化に使用することができます。5,15観測SECローディング効率は、従来に比べて比較的高いですカプセル化材料。7はまた、報告された多くの利点がありますSECのカプセル化など、6,10の味をマスクすると、酸化に対する自然ある程度の保護を提供する。既存の研究では12の能力、L.のための最も一般的に使用されるSECの抽出方法として、 clavatumは、4つの主要なステップに基づいています。ステップ1は、胞子を脱脂するために50℃で最大12時間、アセトン中での溶媒の還流である。11ステップ2は、細胞質およびタンパク質性物質を除去するために、120℃で最大12時間、6％の水酸化カリウムでアルカリ性の還流である。11ステップ3つのセルロース内膜物質を除去するために180℃で最大7日間、85％リン酸中の酸還流で11ステップ4つのすべての残りの非外膜材料を除去するために水、溶媒、酸、および塩基を用いて総合的な洗浄工程でありますそして残留農薬。 カプセル化の用途に関連してSEC抽出の主な目標は、無料のあちこちに、細胞質材料の空であるカプセルを製造するためにあります潜在的にアレルゲン性タンパク質M、および形態学的にインタクト。2,37とが、工業生産の観点から、そのようなエネルギー効率、製造時間、安全性、及び得られた廃棄物などの追加の経済的および環境的要因を考慮することも重要です。エネルギー効率に関しては、高温及び長い処理時間の両方が生産コストだけでなく、環境負荷に影響を与えます。生産期間と所要時間は、処理の収益性に影響を与える重要な要因です。特に懸念されるのは高温のリン酸処理は安全性の問題が増加し、一括所要時間の大幅なインフラ整備の増加や遅延につながる腐食性のスケーリングをもたらすことが知られているということです。38-40可能であれば、つながる可能性があり、必要なステップの数を最小限に抑えます大幅に生産廃棄物の削減します。しかしながら、一般的にLの4段階のプロセスを使用しclavatum SEC抽出は、単にEVを持っています研究の数十年からolvedと少しの実際のプロセスの最適化を持っていました。最近、Mundargi らは 、41は、体系的に最も一般的に報告SEC抽出技術のいずれかを評価し、最適化することにより、この分野で進行中の作業に多大な貢献をしました。 この研究の最初のセクションで：胞子脱脂6時間50℃でアセトン処理を利用することが実証されています。胞子原形質および内膜除去手順は、30時間、70℃で85％のリン酸処理を利用して実証されています。水、溶媒、酸、および塩基でよく洗浄して残留sporoplasmic内容物の除去を実証するために使用されます。およびSECの乾燥は、対流乾燥、真空オーブン乾燥を利用することが実証されています。 3番目のセクションでは、SECの真空装填は、BSA-ロード-SEC洗浄および凍結乾燥が続くモデルタンパク質、ウシ血清アルブミン（BSA）、の真空装填を利用実証されています。 4番目のセクションでは、determinBSAのカプセル化効率のationがプローブ超音波処理、遠心分離を利用した実証、およびUV /可視分光分析されます。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Lycopodium clavatum&lt;/em&gt; spores (s-type)</td><td>Sigma</td><td>19108-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated BSA</td><td>Sigma</td><td>A9771-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid (85% w/v)</td><td>Sigma</td><td>438081-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma</td><td>V800202&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881-1KG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>V800022</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>AcME&amp;nbsp;</td><td>C000356</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Millipore purified water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres (50 &amp;plusmn; 1 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific (CA, USA)</td><td>4250A</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;nbsp;</td><td>Vector labs (CA, USA)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 &amp;mu;m, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide</td><td>Ibidi GmbH (Munich, Germany)</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Lycopodium SECs (L-type)</td><td>Polysciences, Inc. (PA, USA)</td><td>16867-1</td><td></td></tr><tr><td>Heating plates</td><td>IKA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Jeol, Japan</td><td>&amp;nbsp;JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Elemental analyzer&amp;nbsp;</td><td>Elementar, Germany</td><td>VarioEL III</td><td></td></tr><tr><td>FlowCam: The benchtop system</td><td>Fluid Imaging Technologies, USA</td><td>FlowCamVS</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Labconco, USA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrometer</td><td>Boeco, Germany</td><td>S220</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of plant-based capsules for microencapsulation applications

植物ベースの胞子や花粉由来マイクロカプセルは、マイクロカプセル化アプリケーションの多様な範囲のための堅牢なプラットフォームを提供します。内部sporoplasmic内容を削除するように胞子や花粉が処理されるときにスポロポレニン外膜カプセル（秒）が得られます。得られた中空マイクロカプセルはmicromeritic高度の均一性を示し、特定の植物種に関連する複雑な微細構造の特徴を保持しています。ここで、我々はヒカゲノカズラ胞子からSECSの生産のため、これらSECSへの親水性化合物の搬入のための合理化プロセスを示しています。現在のSEC分離手順は、最近かなり従来SEC分離に使用される処理要件を低減するために、無傷のマイクロカプセルの製造を確実にするために最適化されています。ナチュラルL. clavatumの胞子を、アセトンで脱脂し、リン酸で処理し、そして広範囲sporoplasmiを除去するために洗浄されていますCの内容。アセトン脱脂した後、85％リン酸を用いて、単一の処理ステップは全てsporoplasmicの内容を削除することが示されています。 30時間に酸処理時間を制限することにより、クリーン秒を分離し、長時間の処理時間で発生することが示されたSECの破壊を回避することができます。豊富な水で洗浄し、酸を希釈し、拠点を希釈し、溶媒をすべてsporoplasmic材料と化学残留物が十分に除去されることを保証します。真空装填技術は、代表的な親水性化合物として、モデルタンパク質（ウシ血清アルブミン）をロードするために利用されます。真空装填は、多くの場合、他のマイクロカプセル化プロトコルで必要とされる過酷な溶剤または望ましくない化学薬品を必要とせずに様々な化合物をロードするための簡単な技術を提供します。これらの単離およびロードのプロトコルに基づいて、SECSは、治療薬、食品、化粧品、およびパーソナルケアのprod、などのマイクロカプセル化アプリケーションの多様な範囲内で使用するための有望な材料を提供しますUCTS。

スポロポレニン外膜カプセルのための合理化された抽出処理 L. clavatum SEC抽出は、3つの主な工程によって達成された：（1）アセトンを用いて脱脂します。 （2）酸分解、リン酸を85％使用した（V / V）溶媒を用いて、（3）広範SEC洗浄。合理SEC抽出処理の流れは図1のAに示されている-私は簡単に説明すると、プロセスは、50℃で6時間、アセトン還流で脱脂工程を含む脱脂胞子をその後、残留除去するためにドラフト中で一晩乾燥させましたアセトン。脱脂した胞子を30時間、リン酸を用いて酸分解に供しました。酸分解時sporoplasmic材料の大部分が溶解して、次いで真空ろ過工程中に除去します。残留sporoplasmic物質を溶媒を用いて洗浄工程の大規模な一連を除去するために、酸塩基、及び水が行われます。秒は、最初に24時間室温で乾燥させ、さらに60℃、残留溶媒及び水分を除去するために10時間、1ミリバールの真空下で乾燥させました。 図1に示すように、全てのSEC抽出ステップは、危険通知をヒュームフード内で行いました。 SEC抽出の間に、約70％の質量損失はsporoplasmic物質の除去のために観察され、我々のデータは、清潔で無傷のSECSの生産の既存の報告と一致している。7、19,20,29合理化プロセスを初期脱脂ステップから最終製品に約5日間で完成され、処理が簡単に、適切な安全管理と1キロ実験室規模のバッチにスケールアップすることができます。 SECSを利用したカプセル化工程は、図1のJに提示されている- M、これらが原因involvinなしの簡単な手順であることに有利ですグラム過酷な有機溶媒または機械的な剪断力を必要とする。7当社のカプセル化の実験は、150秒のMGとSECSによる取り込みのための十分なローディング溶液の量を必要とします。これら秒で負荷が選択水性又は有機溶媒中で化合物の溶解度によって制限され、負荷は、3つの積載方法のいずれかによって達成することができる。受動的、圧縮、真空ローディング。しかし、真空装填は、化合物の比較的高いカプセル化を提供します。7、19,20 スポロポレニン外膜カプセルの物理化学的キャラクタリゼーション 図1に示す合理プロセスを用いて製造秒の清浄度を決定するために、表面および断面形態、micromeritic特性、および元素組成は、SEC抽出プロセスの様々な段階で検査しました。に示すように図2は、SEM画像は、ユニークな微細構造を有する無傷芽胞を示し、処理の前に、ミクロンスケールsporoplasmicオルガネラは断面像で観察されました。胞子脱脂やアルカリ処理とは形態学的および構造的変化はsporoplasmic細胞小器官の破裂から離れて観察されませんでした。 図3は、5時間から30時間までの様々な時点でリン酸を用いて酸分解後秒のSEM画像を示します。最大30時間、酸分解これらの結果のサポートはsporoplasmic材料を欠い無傷できれいなSECSを提供します。残留タンパク質性物質を確認するために、CHN元素分析29を実施し、データは、これらの結果は、清潔で無傷秒を達成するための最良の処理条件を選択するための指針を提供する図4に示されています。脱脂とSECSアルカリ処理、実質的なタンパク質様の場合材料除去が観察されます。しかし、リン酸を用いた酸分解して、タンパク質性物質の大部分は、30時間で除去され、更なる減少は120時間までの処理時間の増加に伴って観察されません。基本データは、SECS 7,11の拡張処理上および商業SECSと以前の報告と一致しています。 Micromeritic特性は、動画像粒子分析（DIPA）により分析し、結果は31.0±2.2ミクロンのサイズと、これらの結果は、最大30時間、酸分解後の秒の均一なサイズ分布をサポートし、図5に示されています。これとは対照的に、SEC構造的完全性は、長時間の酸分解に伴って減少し、30時間の処理期間を越え秒のかなりの断片化を引き起こすことが開始されます。 図6は 、酸分解プロで生産秒のためのSEMとDIPAデータを示しています30時間、リン酸を用いてcessing。これらの結果は、脱脂工程の後に、酸分解は32.5±2.7μmでの均一なサイズ分布、清潔で無傷のSECSを生じたことを確認します。酸分解のみのSECSは、上記および以前の報告で説明したようにアルカリおよび酸分解処理することによって製造さ秒に匹敵する11％の窒素含有量に対して決定として、唯一の0.15±0.0％の残留タンパク質含有量を有している。7 スポロポレニン外膜カプセルを使用して、マイクロカプセル化 L.の使用を実証するために酸分解のみの方法を用いて製造clavatumの秒は、マイクロカプセル化実験は、モデルタンパク質としてBSAを用いて行きました。 SECSへのロードは、150ミリグラム秒および125 mg / mlでBSA 1.2ミリリットルを用いて真空ローディング技術を用いて達成された。 図7は、CLSM IMを示します前後の酸分解のみの処理およびFITC-BSAでカプセル化された秒の年齢。データは、胞子の空洞内の胞子原形質成分の存在に起因している未処理のSECS展示自家蛍光を示しています。しかし、酸分解のみの処理の後、すべてのsporoplasmic内容が空の内部空洞が生じ削除されます。驚くべきことに、FITC-BSAのカプセル化した後、緑色蛍光がSECSへのモデルタンパク質のカプセル化を確認し、SECSの内側に観察される。19,20,41 さらに、SECS、SEM及びDIPA分析を実施したBSA-ロードされたデータは、図8に示されている。SEM画像は、BSAローディング後に無傷できれいなマイクロリッジの存在を確認するの形態学的変化とmicromeritic特性を調べました。また、実質的な変更は、BSAがSECSにロードした後、直径、真円度、アスペクト比で観察されませんでした。これらのデータは、consisteありますNT SECSを使用して、薬のカプセル化に関する以前の報告と。7,10 カプセル化されたBSAの量を定量化するために、BSAは、BSA-ロード秒を5mgから抽出し、データを表1に示す。データは、秒のグラム当たりBSAローディングの0.170±0.01グラムを示します。全体的に、SEM、DIPA、CLSM、および分光分析によるBSAの定量化は、LにBSAの成功カプセル化を確認しますclavatum SECSおよびSEC形態安定。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig1.jpg" /> L. 図1.合理抽出処理 clavatum スポロポレニン外膜カプセル（秒）。 6時間50℃で還流セットアップを用いて脱脂（A）未処理の胞子（B）胞子（C）溶媒を濾過および収集<html>脱脂胞子のイオン（D）を室温で脱脂胞子の乾燥。（E）30時間、70℃で、85％（v / v）のリン酸を用いたPTFEフラスコ中で胞子酸分解（F）酸濾過、真空濾過を使用してセットアップする。（G）SEC水、酸、塩基の一連による洗浄、溶媒洗浄工程を、（H）SEC乾燥を60℃、10時間、1ミリバールの真空の真空オーブンを用いて、（I）は無傷、クリーン、および最終製品としてSECSを乾燥させた。（J）SECSおよびBSA溶液を混合。SECSとBSAの溶液（K）均質化。BSAの（L）真空ロードをSECSに。（M）BSA-ロードされたSECS。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig1large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> 54768 / 54768fig2.jpg &quot;/&gt; L.の図2.走査電子顕微鏡分析事前酸処理のさまざまな段階でclavatumの胞子。sporoplasmic細胞小器官および生体分子を示す（A）未処理の胞子。（B）破砕sporoplasmic内容を示すアセトン処理した胞子。（C）＆（D）アルカリがsporoplasmic内容物の除去を示す胞子を処理し、内部セルロース内膜層をしわ。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig3.jpg" /> L.の図3.走査型電子顕微鏡分析酸のさまざまな段階でclavatum胞子5から30時間にトリートメント（A - D）。それぞれ、そのまま外部の微細構造とクリーンな内部キャビティを示す5、10、20、および30時間の酸処理胞子。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig4.jpg" /> 胞子とスポロポレニン外膜カプセル（秒）。治療の様々な段階後のタンパク質含有量の図4.タンパク質含量 。データは標準偏差で3回の測定の平均である（n = 3）で表されます。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図F。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig5.jpg" /> 胞子の図5.動的イメージング粒子解析（DIPA）とスポロポレニン外膜カプセル治療の様々な段階で（秒）の列（A - C）は 、それぞれ事前酸処理、酸処理、および無傷のSECSです。プロットは、SEC径、円形度、アスペクト比、およびエッジ勾配を表すグラフです。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig6.jpg" /> 図6. 走査型電子顕微鏡（SEM）および30時間Acidolyの動的イメージング粒子解析（DIPA）そのまま外部微細構造とクリーンな内部キャビティを示すSIS-のみスポロポレニン外膜カプセル（秒）。（A）SECS。（B）SECの直径、真円度、アスペクト比の代表的なグラフ。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig7.jpg" /> 前と治療とBSAのカプセル化後の図スポロポレニン外膜カプセル（秒）の7共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）解析を。最初の行がsporoplasmic細胞器官及び生体分子の自己蛍光を示す未処理の胞子を示しています。 2行目は空の内部空洞で30時間の酸分解のみのSECSを示しています。 3行目は、FITC-BSAがロード描きます30時間の酸分解専用SECSへ。 （スケールバーは10μmです）。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig8.jpg" /> 図8.走査型電子顕微鏡（SEM）およびBSA-ロードスポロポレニン外膜カプセル（秒）の動的イメージング粒子解析（DIPA）キャラクタリゼーション。 BSA-ロードされた秒の（A）のSEM画像（B）BSA装填SEC径、円形度、アスペクト比、およびエッジ勾配の代表的なグラフ。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <tableFO：= &quot;1&quot;&gt;キープtogether.withinページ<tbody><tr><td> 材料 </td><td> バッチ当たりのBSAローディング（125 mg / mlで） </td><td> 5ミリグラム秒でBSA（mg）を </td><td> ロードされたBSAの量（SECSのグラムあたりのグラム） </td></tr><tr><td>未処理の胞子</td><td> 0.6ミリリットル</td><td> 0.654±0.05 </td><td> 0.131±0.01 </td></tr><tr><td> SECS </td><td> 1.2ミリリットル</td><td> 0.831±0.05 </td><td> 0.170±0.01 </td></tr></tbody></table> 未処理の胞子とSECSへのウシ血清アルブミン（BSA）の表1カプセル化 。 BSA溶液の体積は、「未処理の胞子 &#39;または&#39;秒 &#39;150mgのバッチ当たりの負荷のために使用されます。データは標準偏差三重バッチの平均である（n = 3）で表されます。 41から適応し、科学的なレポートからの許可を得て使用。

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications at JoVE.com

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

このプロトコル/原稿がヒカゲノカズラ胞子からのスポロポレニン外膜カプセル（秒）を製造するためのこれらのSECSへの親水性化合物の搬入のための合理化されたプロセスを説明します。

マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

extraction-of-plant-based-capsules-for-microencapsulation-applications

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K ビュー.  Nanyang Technological University. このプロトコル/原稿がヒカゲノカズラ胞子からのスポロポレニン外膜カプセル（秒）を製造するためのこれらのSECSへの親水性化合物の搬入のための合理化されたプロセスを説明します。 

ビデオ: Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

生化学

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

発生生物学

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

生物工学

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Bacterial Cellulose Spheres that Encapsulate Solid Materials

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an affordable and simple method for BC sphere production. In addition to producing these spheres, an encapsulation method for solid particles has also been identified. To produce BC spheres, water, black tea, sugar, vinegar, and bacterial culture are combined in a baffled flask and the contents are agitated. After determining the proper culture conditions for BC sphere formation, their ability to encapsulate solid particles was tested using biochar, polymer beads, and mine waste. Spheres were characterized using ImageJ software and thermal gravimetric analysis (TGA). Results indicate that spheres with 7.5 mm diameters can be made in 7 days. Adding various particles increases the average size range of the BC capsules. The spheres encapsulated 10 - 20% of their dry mass. This method shows low-cost sphere production and encapsulation that is possible with easily obtainable materials. BC spheres may be used in the future as a contaminant removal aid, controlled release fertilizer coating, or soil amendment.

This protocol presents an easy, inexpensive method of forming bacterial cellulose (BC) spheres. This biomaterial can function as an encapsulation medium for solid materials, including biochar, polymer spheres, and mine waste.

固体材料を封入する細菌セルロース球

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an ...

工学

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

医学

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

化学

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and scalability. In this paper, we describe a strategy for the robust and reproducible formation of hPSC spheroids where a co-axial flow focusing device is utilized to entrap hPSCs inside core-shell microcapsules. The core solution contained single cell suspension of hPSCs and was made viscous by the incorporation of high molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) and density gradient media. The shell stream comprised of PEG-4 arm-maleimide or PEG-4-Mal and flowed alongside the core stream toward two consecutive oil junctions. Droplet formation occurred at the first oil junction with shell solution wrapping itself around the core. Chemical crosslinking of the shell occurred at the second oil junction by introducing a di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol or DTT) to these droplets. The crosslinker reacts with maleimide functional groups via click chemistry, resulting in the formation of a hydrogel shell around the microcapsules. Our encapsulation technology produced 400 &#181;m diameter capsules at a rate of 10 capsules per second. The resultant capsules had a hydrogel shell and an aqueous core that allowed single cells to rapidly assemble into aggregates and form spheroids. The process of encapsulation did not adversely affect the viability of hPSCs, with &gt;95% viability observed 3 days post-encapsulation. For comparison, hPSCs encapsulated in solid gel microparticles (without an aqueous core) did not form spheroids and had &lt;50% viability 3 days after encapsulation. Spheroid formation of hPSCs inside core-shell microcapsules occurred within 48 h after encapsulation, with the spheroid diameter being a function of cell inoculation density. Overall, the microfluidic encapsulation technology described in this protocol was well-suited for hPSCs encapsulation and spheroid formation.

This article describes encapsulation of human pluripotent stem cells (hPSCs) using a co-axial flow focusing device. We demonstrate that this microfluidic encapsulation technology enables efficient formation of hPSC spheroids.