Nos gustaría agradecer a John Wirth de los jardines de Olbrich para suministrar amablemente los especímenes utilizados en este proyecto. Este trabajo es apoyado en parte por el National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL115282 para G.R.G.) Fundación de ciencia nacional (DGE1144804 J.R.G y G.R.G.) y el Departamento de cirugía de la Universidad de Wisconsin y el fondo de antiguos alumnos (H.D.L.). Este trabajo también fue apoyado en parte por la Agencia de protección ambiental (grant no. 83573701 de estrella), los institutos nacionales de salud (R01HL093282-01A1 y UH3TR000506) y la National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

1. descelularización del tejido vegetal usando el enfoque de detergente
<ol><li>
Utilice frescas o congeladas de F. hispida, muestras foliares. Congelación de muestras frescas no utilizadas en un congelador de-20 ° C y un almacén para uso futuro (hasta un año). Nota: Utilizar tejido de tallo o de hoja de casi cualquier planta deseada. Veces de un almacenamiento prolongado pueden causar daño a los tejidos.<ol>
<li>Determinar el tamaño y la forma de muestras a procesar en base a uso de la muestra (es decir, muestras cortadas en tiras son ideales para aplicaciones de pruebas mecánicas, mientras tanto son útiles en aplicaciones de cultivo múltiples bien muestras de disco de 8 mm ). Cortar la hoja en discos de 8 mm con una biopsia fuerte, limpio golpe mientras sumergido bajo temperatura ambiente (20-25 ° C) desionizada H2O. Nota: Este protocolo se puede utilizar en tallos y hojas enteras. Sin embargo, muestras más pequeñas se decellularize más rápido.</li>
		<li>Incubar las muestras por 5-10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) desionizada H2O en un conjunto de placa de agitar a un ajuste de baja velocidad para lavar o descongelarlos. Uso suficientemente desionizada H2O para que todas las muestras están completamente mojadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar una solución de 10% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS) en desionizada H2O. lugar las muestras en un recipiente adecuado (un vaso o plato de plástico es ideal) y añadir solución de SDS para cubrir completamente las muestras. Incubar las muestras durante 5 días a temperatura ambiente (20-25 ° C) en un shake de placas ajustado a una velocidad baja para evitar daños en las muestras. Nota: No masificar el envase ya que esto puede ralentizar el proceso de descelularización y llevar al tratamiento desigual por la SDS. Durante este paso, las muestras deben adquirir una tonalidad marrón.<ol>
<li>Después de 5 días, reemplazar la solución de SDS con desionizada H2O. Incubar las muestras para un 10-15 minutos adicionales en la placa de la sacudida para enjuagar completamente cualquier resto de solución SDS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar un tensioactivo no iónico 1% (v/v) en solución de lejía del 10% (v/v). Para hacer una solución de 500 mL, mezclar 5 mL de surfactante no iónico con 50 mL de lejía 445 mL de desionizada H2O. Sumerja las muestras en la solución recién preparada. Nota: La solución de blanqueador de surfactante no iónico no tiene una vida útil larga, por lo tanto, debe utilizarse dentro de las 48 h de preparación.</li>
	<li>
Reemplazar la solución de blanqueador de surfactante no iónico cada 24 h hasta que las muestras son completamente (ver figura 1A para la comparación visual). Luego incubar la muestra en agua desionizada en un plato de agitar por 2 min para enjuagar la solución de surfactante no iónico exceso/blanqueador. Coloque la placa de la sacudida en un ajuste bajo para no dañar las muestras. Nota: El tiempo necesario para borrar las muestras utilizadas varía, dependiendo del tipo y especie de la planta. La completa decoloración de las muestras es indicativo de descelularización completo (realizar cuantificación de ADN para asegurar fondo claro).<ol>
<li>Liofilizar muestras para almacenar hasta un año (flash congelación con nitrógeno líquido es preferido, congelar muestras de-80 ° C también es aceptable) y almacenar a temperatura ambiente (20-25 ° C) a baja humedad.</li>
		<li>Reconstituya las muestras en Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) con bastantes muestras de la capa. Enjuagar las muestras 2 - 3 veces en medios libres de suero con la ayuda de una micropipeta antes de su uso (es decir, uso 150-300 μL por enjuague en una placa bien 24 estándar). Nota: Tampón Tris-HCl y medios libres de suero (es decir, DMEM, pero ninguna cultura de célula básica media puede sustituirse) son más eficaces en reducir el impacto en la viabilidad celular de las muestras de la SDS tratados que aquellos tratados con desionizada H2O solo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de las muestras utilizando el enfoque de descelularización libre de detergente
Nota: Los primeros pasos de este procedimiento coinciden con pasos 1.1-1.1.2 (véase arriba).
<ol><li>Preparar una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) 3% (p/v) y 5% (v/v) lejía (NaClO). Calentar la solución en una campana de humos a 60-70 ° C para las muestras de hojas de F. hispida cortar discos de 8 mm mientras que revuelve en una placa caliente. Nota: Puede sustituirse el bicarbonato de sodio con carbonato de sodio (Na2CO3), o hidróxido de sodio (NaOH). La temperatura varía enormemente (de temperatura a 90 ° C) y debe ajustarse de acuerdo con las propiedades de las muestras utilizadas.</li>
	<li>Una vez que la solución alcanza la temperatura deseada, sumergir las muestras y reducir la velocidad de agitación para evitar dañarlos. Después de que las muestras son visiblemente despejadas (refiérase a figura 1B para comparación visual), retirar del baño cuidadosamente. Incubar las muestras una vez desionizada de H2O por 1-2 min eliminar el exceso de lejía solución. Nota: El tiempo necesario para borrar las muestras puede variar ampliamente. Por ejemplo, perejil cortado puede eliminarse en 10-15 min, mientras que las muestras más gruesas o más grandes como conjunto las hojas o tallos pueden tardar horas en baños de alta temperatura para eliminar completamente.</li>
	<li>Liofilizar las muestras y almacenar a temperatura ambiente (20-25 ° C) a baja humedad.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+from+first+principles+to+state+of+the+art.">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels.">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li><li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+surface+modification+and+3D+fabrication+techniques+to+prepare+patterned+poly(L-lactide)+substrates+allowing+regionally+selective+cell+adhesion.">Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion.</a> Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).</li><li>Steinhoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+pulmonary+heart+valves+on+allogenic+acellular+matrix+conduits:+in+vivo+restoration+of+valve+tissue.">Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue.</a> Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix.">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li><li>Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Mesh+Implants+for+Abdominal+Hernia+Repair:+US+Food+and+Drug+Administration+Approval+Process+and+Systematic+Review+of+Its+Efficacy.">Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy.</a> JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).</li><li>Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. <a target="_blank" 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An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).</li><li>Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biocompatibility+of+cellulose+and+its+derivatives.">Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).</li><li>Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+cell+constructs+on+cellulose-based+scaffolding.">Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding.</a> Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).</li><li>Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+Subcutaneously+Implanted+Plant-Derived+Cellulose+Biomaterials.">Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials.</a> PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).</li><li>McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+transport+in+plants+obeys+Murray's+law.">Water transport in plants obeys Murray's law.</a> Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).</li><li>Gershlak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+kingdoms:+Using+decellularized+plants+as+perfusable+tissue+engineering+scaffolds.">Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 125, 13-22 (2017).</li><li>Fontana, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+Plants+as+Diverse+Biomaterials+for+Human+Cell+Culture.">Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).</li><li>Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+structural+materials.">Bioinspired structural materials.</a> Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).</li><li>Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).</li><li>Hoshiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+Extracellular+Matrix+as+an+In+vitro+Model+to+Study+the+Comprehensive+Roles+of+the+ECM+in+Stem+Cell+Differentiation.">Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Modulevsky, D. 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Los autores no tienen nada que revelar.

En este documento, se describen dos métodos para decellularize los tejidos vegetales. Los resultados presentados aquí, junto con los resultados de25estudios anteriores sugieren que los protocolos planteados son probablemente aplicable a un amplio espectro de especies de plantas y se pueden realizar en tallos y hojas. Estos procedimientos son simples y no requieren de equipo especializado, para que planta descelularización puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios. Cabe destacar que después de descelularización, los andamios deben ser funcionalizados para facilitar la adhesión de células de mamífero. Funcionalización diferentes técnicas para permitir la adhesión de células de mamífero y crecimiento en la planta, los tejidos han sido descritos en otras partes25 y son no el tema del manuscrito actual.
El paso final en ambos protocolos de descelularización presentada (figura 1) fue fundamental para su éxito. Cuando realice cualquiera de los métodos no masificar el baño ya que esto dará como resultado un claro irregular. Estos métodos pueden aplicarse a todo hojas y tallos; sin embargo, esto aumentará la cantidad de tiempo necesaria para eliminarlas. Asegúrese de que las muestras son sumergidas totalmente para mantener la limpieza constante a lo largo de toda la muestra. Idealmente, descelularización debe borrar los tejidos vegetales de la materia más celular minimizando el daño estructural. Es probable que el método libre de detergente puede ser modificado según sea necesario para trabajar con muestras deseadas. Temperaturas de baño pueden limpiar más rápido veces pero también pueden resultar en más daño a las muestras si son demasiado incubados. Temperaturas inferiores pueden requerir tiempos de incubación más largo y serían apropiadas para las muestras más frágiles. También se puede cambiar la concentración de cloro en la solución para acelerar o desacelerar el proceso de descelularización. Cuando pruebas nuevas muestras para su uso con el método libre de detergente, se recomienda empezar con una temperatura de baño de 50-60 ° C con frecuentes controles de los progresos de la descelularización (idealmente cada 15-20 minutos) hasta que son adecuadamente. Este rango de temperaturas fue bien tolerado por la mayoría de las especies de plantas que fueron probadas durante la optimización de la técnica. Al finalizar, las muestras pueden ser inspeccionadas visualmente y manualmente para asegurarse de no han sido incubados demasiado y dañado irreparablemente como estaría indicado por lagrimeo o desintegración al retirarla del baño. Muestras preparadas usando esta aproximación muestran un impacto de disminución en el crecimiento de la célula (ver Figura 3A) que el enfoque de detergente con sólo lavar desionizada H2O. Sin embargo, se recomienda lavado además con Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) y medios libres de suero, especialmente en aplicaciones sensibles.
El base de detergente (SDS) método es probablemente aplicable a la mayoría de las especies vegetales y es especialmente útil para limpiar hojas enteras y las muestras delicadas porque requiere mínima agitación física. Como se mencionó anteriormente, el paso final es crítico para la descelularización de muestras. Muestras con distintas propiedades físicas pueden eliminarse ajustando el tiempo de incubación en los baños de tensioactivo no iónico. Un inconveniente importante de este proceso es que los tejidos decellularized pueden contener trazas de los detergentes usados, que posteriormente pueden influir en la actividad metabólica celular de células de mamíferos. Por lo tanto, se recomiendan pasos de lavado minucioso antes de usar. Aquí se encontró que las muestras lavadas con tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) seguido por los medios libres de suero tuvieron mayor viabilidad de las células que los lavados con desionizada H2O antes de su utilización (figura 3B).
Almacenaje de las muestras sin tratar para uso futuro en cualquiera de los métodos, es importante monitorearlos daños garantizar que los andamios resultantes no serán impactados. Daño puede aparecer como la decoloración de los tejidos de la planta así como grietas o excesiva fragilidad cuando se maneja. Se recomienda monitorear las muestras semanalmente con el fin de utilizarlos antes de que ya no son útiles y deben eliminarse. La aparición de daño varía entre los tipos de muestras, con muestras más sólidas más gruesas dure más.
En general, las plantas sostienen mucha promesa como una fuente potencial de biomateriales. Esto es reforzado por sus estructuras intrincadas naturalmente desarrollados y características que les ayudan a crecen en sus ambientes nativos. Utilización exitosa de los tejidos vegetales como andamios de ingeniería de tejidos propone una alternativa potencialmente barata y costosos, a menudo difíciles de diseñar, biomateriales. Topografía de la superficie del tejido vegetal, que sí varía de una especie a otra, también se puede aprovechar para crecimiento celular espacial orientada directa25. Por ejemplo, un estudio anterior ha demostrado que las células humanas responden a señales topográficas presentes en plantas decellularized25, así que estos andamios se pueden utilizar para cultivo de células en patrones altamente organizado25. Otra característica que es deseable en ingeniería de tejidos es de novo perfusability. Tejidos vegetales han evolucionado cientos de millones de años para ser extremadamente eficiente en el transporte de fluidos, y sus redes vasculares pueden ser eficientemente perfusión24. Esta propiedad puede utilizarse potencialmente para guiar la migración celular y la angiogénesis con el fin de crear tejidos de reemplazo para aplicaciones clínicas. Esto es reforzado por los resultados de estudios previos que demostraron que los biomateriales con la alta superficie y la porosidad interconectada son propicias para la proliferación celular y cuando se implantan en vivo, habilitar la migración hacia el interior de las células hospedadoras en el implante36,37,38,39. La alta superficie y la porosidad interconectada son también el sello de la planta tejidos40,41,42, así andamios de origen vegetal tienen el potencial para integrar con los tejidos circundantes en vivo. Por otra parte, estudios recientes encontraron que decellularized hojas pueden ser inundadas con éxito con células24 y que cuando las células humanas fueron sembradas en los tejidos de la planta decellularized, se ajustaba a sus señales topográficas25. Cuando tomados andamios todos juntos, de origen vegetal poseen las propiedades necesarias para ser aplicadas con éxito para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Ingeniería de tejidos surgió en la década de 1980 para crear tejidos vivos sustitutos y potencialmente dirección importantes órganos y tejidos escasez1. Una de las estrategias ha utilizar andamios para estimular y guiar el cuerpo para regenerar los tejidos o los órganos. Aunque avanzados métodos de fabricación tales como impresión en 3-d han producido andamios con características físicas únicas, la capacidad para la fabricación de andamios con una amplia gama de propiedades físicas y biológicas viables sigue siendo un reto2 , 3. por otra parte, debido a la falta de una red vascular funcional, estas técnicas han sido limitadas en regeneración de tejido de 3 dimensiones. El uso de tejidos animales y humanos decellularized como andamios ha ayudado a eludir este problema4,5,6,7. Sin embargo, el alto costo, la variabilidad lote a lote y la disponibilidad limitada pueden limitar uso generalizado de animal decellularized andamios8. También hay preocupaciones sobre la potencial transmisión de enfermedades a los pacientes y reacción inmunológica a algunos tejidos mamíferos decellularized9.
Celulosa, derivada de plantas y fuentes bacterianas, se ha utilizado ampliamente para generar Biomateriales para una amplia gama de aplicaciones en medicina regenerativa. Algunos ejemplos incluyen:10,11, cartílago12,13,14 y15de cicatrización ósea. Los andamios que se componen de celulosa tienen un beneficio adicional que son durables y resistentes a ser desglosadas por células de mamífero. Esto es debido a que las células de mamífero no producen las enzimas necesarias para descomponer las moléculas de celulosa. En comparación, andamios producción con macromoléculas de la matriz extracelular, como colágeno, se descomponen fácilmente con16 y no sea idóneos para aplicaciones a largo plazo. Andamios de colágeno pueden ser estabilizados por reticulación química. Sin embargo, existe una relación inversa debido a la toxicidad inherente de los cross-linkers que afectan la biocompatibilidad de los andamios17. Por el contrario, la celulosa tiene el potencial de permanecer presentes en el lugar de implantación durante períodos prolongados de tiempo porque son impermeable a la degradación enzimática de las células mamíferas18,19,20. Esto puede modificarse mediante la regulación de la tasa de degradación a través de pretratamiento de hidrólisis y la entrega de los andamios con celulasas21. La biocompatibilidad de celulosa de origen vegetal decellularized andamios en vivo también se ha demostrado en un estudio realizado en ratones22.
A través de cientos de millones de años de evolución, las plantas han refinado su estructura y composición para aumentar la eficiencia de transporte de fluidos y la retención. Planta vasculares vasos minimizan resistencia hidráulica por ramifican en vasos más pequeños, similares a la vasculatura mamífera según23de la ley de Murray. Después de descelularización, se mantiene la red compleja de la planta de los vasos y poros interconectados. Teniendo en cuenta la gran cantidad de especies de plantas distintas disponibles, andamios de origen vegetal tienen el potencial para superar limitaciones de diseño que afecta actualmente a andamios en tejido ingeniería24,25. Por ejemplo, Modulevsky et al demostraron que la angiogénesis y migración celular ocurrió cuando apple decellularized tejido fue implantado por vía subcutánea en la parte posterior de un ratón22. Semejantemente, Gershlak et al. , demostró que las células endoteliales podrían ser crecidas dentro de la vasculatura de hojas decellularized24. En un experimento separado, Gershlak et al. también fueron capaces de demostrar que cardiomiocitos podrían cultivarse en la superficie de las hojas y pudieron contratar24.
Las plantas también incluyen organización compleja desde el celular a la escala macroscópica, que es difícil de conseguir incluso con las más avanzadas técnicas de fabricación desarrolladas hasta la fecha. El diseño jerárquico complejo de tejidos de la planta hace más fuerte que la suma de sus componentes26. Las plantas poseen una gran cantidad de propiedades mecánicas diferentes que van desde componentes rígidos y resistentes como los tallos, a unos mucho más flexibles y maleables como hojas27. Hojas varían dependiendo de la especie en términos de tamaño, forma, rompen la resistencia, el grado de vascularización y pueden llevar a diferentes grados de hidrofilicidad. En general, estas propiedades de la planta sugieren que decellularized las plantas pueden servir como dispositivos médicos únicos y altamente funcionales, como los andamios de la ingeniería del tejido.
Este protocolo se centra en dos métodos para decellularize los tejidos vegetales, como hojas y tallos, para el uso como andamios en ingeniería tisular. El primer método es una técnica basada en el detergente que utiliza una serie de baños para extraer ADN y materia celular, que ha sido adaptada de una técnica ampliamente utilizada decellularize mamíferos y vegetales tejidos6,22,25 ,28,29,30. El segundo método está libre de detergente y es una adaptación de un protocolo de "skeletonization" generalmente se utiliza para eliminar los tejidos blandos de hojas31. Trabajos previos demostraron que hirviendo las hojas en una solución de lejía y bicarbonato de sodio facilita la separación de la vasculatura de los tejidos blandos circundantes31. Esta técnica se puede citar a experimentos realizados en elth de 17 y18 siglos, tales como el trabajo de Albertus Seba32 y33de Edward Parrish . Estos experimentos de centrar dejando materia vegetal, como hojas y frutos, sumergieron en agua durante largos períodos de tiempo (semanas a meses) y permitir que los tejidos más suaves al decaimiento, naturalmente. Aquí el enfoque "skeletonization" está adaptado para utilizar condiciones más suaves, tales como tiempos de incubación más largos a temperaturas más bajas, para eliminar los residuos celulares y para evitar distorsionar significativamente la estructura de tejidos blandos. Para los experimentos detallados en este documento, se utilizaron tres tipos de plantas: Ficus hispida, Pachira aquatica y una especies de Garcinia. Resultados de la cuantificación de ADN, pruebas mecánicas e impacto en la actividad metabólica celular de ambos métodos se describen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:136px;">75746-1KG</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:136px;">807426</td>
			<td style="width:277px;">Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td style="width:111px;">Clorox</td>
			<td style="width:136px;">Item #: 31009</td>
			<td style="width:277px;">Standard concentrated bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">217120010</td>
			<td style="width:277px;">Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">8 mm Biopunch</td>
			<td style="width:111px;">HealthLink</td>
			<td style="width:136px;">15111-80</td>
			<td style="width:277px;">Cuts samples that fit well in 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Belly Dancer-Shake table</td>
			<td style="width:111px;">Stovall Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">BDRAA115S</td>
			<td style="width:277px;">Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Isotemp hot/stir plate</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any style/brand of hot/stir plate.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Beaker</td>
			<td style="width:111px;">Any</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP153-500</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">MT50003PC</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Quant-iT Picogreen dsDNA assay</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:136px;">P11496</td>
			<td style="width:277px;">Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two methods for decellularization of plant tissues for tissue engineering applications

Los injertos autólogos, sintéticos y derivados de animales, actualmente utilizados como andamios para reemplazo de tejidos tienen limitaciones debido a la baja disponibilidad, pobre biocompatibilidad y costo. Los tejidos de la planta tienen características favorables que las hacen especialmente adecuado para utilizar como andamios, tales como superficie, excelente transporte y retención, porosidad interconectada, preexistente de redes vasculares y una amplia gama de mecánicas propiedades. Aquí se describen dos métodos exitosos de descelularización de planta para aplicaciones de ingeniería de tejidos. El primer método se basa en baños detergentes para quitar la materia celular, que es similar al previamente establecidos métodos utilizados para eliminar los tejidos mamíferos. El segundo es un método libre de detergente adaptado de un protocolo que aísla la vasculatura de la hoja y consiste en el uso de una lejía caliente y el baño de sal para limpiar las hojas y tallos. Ambos métodos producen andamios con propiedades mecánicas comparables y bajo impacto metabólico celular, lo que permite al usuario seleccionar el protocolo que mejor se adapte a su uso.

Ambos métodos produjeron andamios que eran convenientes para el cultivo de células y tejidos, aplicaciones de ingeniería. La figura 1 muestra el flujo general del proceso de descelularización utilizando una hoja intacta para el método base de detergente y corte muestras (8 mm de diámetro) para el método libre de detergente. Éxito descelularización de Ficus hispida tejidos siguiendo ambos métodos rindió muestras claras e intactas (figura 1A y 1B). Es posible decellularize los tejidos de la planta entera (figura 1A); sin embargo, muestras más pequeñas parecen claramente más rápida y eficazmente. Un problema potencial con el enfoque de detergente involucrados descelularización heterogéneo como consecuencia de la prematura eliminación del baño de tensioactivo no iónico (figura 1). Un inconveniente del método libre de detergente es que se puede dañar debido a la prolongada incubación en el baño caliente (figura 1).
Las propiedades mecánicas de decellularized andamios elaborados con ambos métodos fueron investigadas usando la prueba extensible uniaxial como se hizo en otros estudios24,34. Estas pruebas produjeron el máximo módulo tangente (MTM) (figura 2A), tensión en fallas (SAF) (figura 2B) y máxima resistencia a la tracción (UTS) (figura 2) para muestras de F. hispida y Pachira aquatica . P. aquatica muestras preparadas con ambos protocolos de descelularización muestran propiedades mecánicas similares a través de los tres de los parámetros medidos. Las muestras de F. hispida mostró una tendencia similar en todos los casos excepto el UTS pruebas. En particular, muestras preparadas usando protocolo base de detergente (SDS) tenían resultados de UTS promedio mayor que los elaborados con el enfoque (Bleach) libre de detergente. Estos resultados demuestran que las muestras recogidas de diferentes especies de plantas pueden producir propiedades distintas andamio decellularized preparado por medio de los dos protocolos de descelularización.
Para medir la extracción de ADN, las muestras se limpiaron utilizando cualquiera de los métodos y su ADN genómico fue aislado usando un protocolo previamente establecido35. Ambos métodos de descelularización (base de detergente y sin detergente) disminuyeron significativamente el contenido de DNA genómico de muestras a 2,47 ng de ADN/mg (n = 3, s = 0.18) y 2.71 ng de ADN/mg de tejido (n = 3, s = 1.60) respectivamente (Figura 2D). Las muestras no decellularized tenían 104.67 ng de ADN/mg de tejido (n = 3, s = 26.21) (Figura 2D). Importa la disminución sustancial en el contenido de ADN después de descelularización indica un retiro eficaz de la célula de la planta.
El impacto en la viabilidad celular de los dos métodos de descelularización se evaluó mediante la medición de la actividad metabólica de los fibroblastos dérmicos humanos (hDF) cultivadas por 2 días en presencia de decellularized p. aquatica o andamios de Garcinia . hDFs tenía mayor actividad metabólica cuando cultivadas en presencia de andamios decellularized mediante el método libre de detergente versus aquellos preparados por el método base de detergente (figura 3A). Para asegurar la completa eliminación de los reactivos usados durante la descelularización, un conjunto de experimentos fue realizada en la que los andamios preparados lavaron extensivamente antes de la cultura de célula. Dos métodos de lavado separados fueron probados en muestras preparadas utilizando el enfoque de detergente: un lavado en tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) seguido de un lavado en medios libres de suero vs 2 lavados en desionizada H2O. Ambos enfoques utilizan pasos de final lavado con PBS 1 x. El impacto en las células de mamíferos expuestos posteriormente a los andamios de planta decellularized se midió usando el mismo ensayo de actividad metabólica como la anterior. Tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) seguido por los medios libres de suero ayudó a reducir el impacto en la actividad metabólica celular en comparación con desionizada H2O, haciendo muestras tratadas con el detergente enfoque comparable a las muestras de detergente-libre método (figura 3B).
Previamente se demostró que las células de mamífero podrían crecer en andamios elaborados con el enfoque basado en detergente25; por lo tanto, era necesario demostrar esto en muestras preparadas por el método previamente comprobado libre de detergente. Las células madre mesenquimales (MSCs) fueron sembradas en decellularized las muestras de hojas de F. hispida (discos de 8 mm) en 20.000 células por andamio y permitió a incubar durante 24 h. Estos andamios eran funcionalizados antes de la introducción de la célula con un conjugado RGD-dopamina para facilitar la adhesión. Figura 4 ilustra imágenes recogidos de una muestra típica. Una imagen de campo claro fue recogida para mostrar la estructura general de una sección de la muestra utilizada (Figura 4A). Las MSCs se tiñeron con calceína y fotografiada con un microscopio de fluorescencia (Figura 4B). Las imágenes luego fueron superpuestas (figura 4) para mostrar la ubicación de las células cada vez mayores en la superficie de la hoja.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig1.jpg"> Figura 1 . El flujo de trabajo general para la descelularización de tejidos vegetales. Flujo de trabajo típico para la descelularización de tejidos vegetales (pasos de lavado y preparación son universales); Camino superior (A) es para la parte inferior del método base de detergente (B) para el método libre de detergente. (C) una incompleta/no pudo descelularización de una hoja de p. aquatica utilizando el método base de detergente debido a la prematura eliminación de la descelularización de baño (D) A dañado de surfactante no-iónico/blanqueador de una hoja de F. hispida debido a la prolongada incubación en la solución de lejía caliente en el método libre de detergente. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig2.jpg"> Figura 2 . Comparación de propiedades mecánicas y la eficacia de descelularización entre métodos. Media ± SD; el análisis estadístico se realizó mediante los dos muestras t-test p valores y listados donde estadísticamente significativa (menor o igual a 0.05). Comparación de ensayos mecánicos de resultados entre muestras de F. hispida y p. aquatica (barras azules para enfoque de detergente, rojo para el detergente libre y verde para las muestras sin tratar) (F. hispida base de detergente n = 4, n libre de detergente = 2; P. aquatica detergente base n = 3, libre de detergente n = 4) (A) máxima tangente módulo (MTM) (B) tensión de fallo (SAF) (C) y máxima resistencia a la tracción (UTS). Ensayo de cuantificación de dsDNA (D) una se ejecutó por triplicado en tres muestras de cada grupo: sin tratamiento (fresco, n = 3), el método libre de detergente (Bleach, n = 3) y el método base de detergente (SDS, n = 3), p valores son método de descelularización Grupo en comparación con el grupo de muestra no tratada. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig3.jpg"> Figura 3 . Resultados de análisis de la actividad metabólica que comparan el impacto entre los dos métodos de descelularización. Media ± SD; el análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de dos muestras y p valores donde estadísticamente significativa (menor o igual a 0.05). Se midió la actividad metabólica celular en presencia de muestras de tejido de p. aquatica y una especie de Garcinia (normalizada a pocillos de control no muestra añadido) para mostrar una comparación (A) de los efectos metabólicos de los dos métodos de descelularización (n = 3 para cada grupo) y (B) comparación del impacto a la actividad metabólica usando dos métodos en el protocolo base de detergente: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) combinado con medios libres de suero (n = 4) vs desionizada H 2 O (n = 4). <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig4.jpg"> Figura 4 . Las células madre mesenquimales (MSCs) sobre la superficie de decellularized hoja de Ficus hispida , funcionalizada con un conjugado de dopamina RGD. MSCs se cultiva en hojas de F. hispida , decellularized por el método libre de detergente y funcionalizados con un conjugado RGD-dopamina (500 μm escala bares fueron agregados para referencia) imagen de campo brillante (A) de una sección de la hoja de decellularized (B ) Imagen de fluorescencia de calceína manchado MSCs en hoja superficial combinada (C) campo y fluorescencia imagen brillante. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Aquí presentamos, y protocolos de contraste dos utilizan para decellularize los tejidos de la planta: un enfoque de base de detergente y un libre de detergente. Ambos métodos dejan la matriz extracelular de los tejidos de la planta utilizada, que luego puede ser utilizada como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K vistas.  University of Wisconsin-Madison. Aquí presentamos, y protocolos de contraste dos utilizan para decellularize los tejidos de la planta: un enfoque de base de detergente y un libre de detergente. Ambos métodos dejan la matriz extracelular de los tejidos de la planta utilizada, que luego puede ser utilizada como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Investigación

Bioingeniería

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Recuperación Quirúrgica, aislamiento y<em&gt; In vitro</em&gt; Ampliación del cruzado anterior humana derivados de las células del ligamento para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...