この作品の交わりに支えられて s. h. a.NIH/NCATS (TL1TR001104) からウェルチ財団 (I-1827) を与えるし、Z.W. Z.W. に日の出 (RGM120502A) から R01 グラントはテキサス州学者の研究所 (R1222) やがん予防医学研究のバージニア マーチソン リンシカム学者。

1. 試料を準備します。
<ol><li>2 x 10 の文化6アミロイド 10 ml のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシンを含む 10 cm 培養皿に HT 29 大腸がん細胞を生産します。培養細胞は、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩します。<ol>
<li>セルは、80% の confluency に成長後は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml セルを洗浄しています。トリプシン溶液 3 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>セルはお皿から完全解離後培地 10 mL を追加し、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットで細胞を転送します。室温で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心します。培地を吸引を 5 mL の培地、細胞を再懸濁します、携帯カウンターを使用してセルをカウントします。それぞれ 2 つの 10 cm 料理のプレート 2 x 106セルです。</li>
		<li>細胞が接着し、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩回復を許可します。一皿 20 ng/ml の腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、100 nM Smac 擬態と 20 μ M 汎カスパーゼ阻害剤 Z VAD FMK11アミロイドの形成を誘導するために治療を適用します。組み合わせはチーリンと省略されます。コントロールとして車両と他の料理を扱います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な期間後 6 h 通常細胞ライセートの収穫します。<ol>
<li>プラスチックのスクレーパーとプレートから細胞をこすり、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットを使用します。4 ° C で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離します。</li>
		<li>10 mL の氷冷 PBS に再、4 ° C で 3 分間 1,000 × g で遠心分離によってセルを洗浄して 2 回PBS ソリューションを吸い出しなさい。 注: プロセスをここで休止して細胞ペレットを液体窒素で凍結し、˗80 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを転送し、0.3 mL の氷の上で 30 分間溶解バッファーで孵化させなさい。4 ° C で 15 分間 20,000 × g で遠心します。上清は全細胞ライセートです。 注: プロセスは、-20 ° c で数ヶ月にサンプルを格納することによってここで休止できます。</li>
		<li>製造元のプロトコルに従ってブラッドフォードの試金蛋白質濃度を測定します。4 x 20 μ 3 μ g/μ L のサンプルを準備し、10 分間室温でインキュベート SDD 時代読み込みバッファーを追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 準備し、ゲルを実行
<ol><li>寒天 2 g を 200 mL のガラス製ビーカーで agarose を溶かし、電子レンジで加熱 1 x トリス酢酸バッファー (TAE) に追加します。最終濃度 0.1 %sds の 20 %sds の 1 mL を追加します。慎重に混合旋回します。SDS 添加後泡を生成しないように注意してください。</li>
	<li>15 cm × 14 cm ゲル平板にアガロース溶液を注ぐ。1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去します。1 つの 20 も櫛を上部に配置します。</li>
	<li>まず寸法: ピペット 60 μ g の全細胞ライセート一番右車線で。(染料のフロントはゲルを通って約 ¾) まで約 4 時間 60 V でゲルを実行実行バッファーとして 0.1 %sds を含む TAE を使用します。</li>
	<li>2 番目の寸法: 慎重回転させるとゲル 90 ° 反時計回り (図 2A)。約 4 時間の 60 V でゲルを実行します。 注: 一般的な走行条件は 4 V/cm のゲルの長さです。実行条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることが重要です。</li>
</ol>3. 転送
<ol><li>ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜 (図 2B) に蛋白質を転送するための毛管転送メソッドを使用します。<ol>
<li>転送バッファーの 500 の mL を追加し、約 20 cm × 20 cm のコンテナー。コンテナーの横にあるペーパー タオルの 5 cm 高スタックを確認します。スタックの先頭の表面積は、ゲルの大きさよりも大きくなければなりません。</li>
		<li>転送バッファーの 14 cm x 15 cm のフィルター ペーパーを浸し、紙タオルのスタック上に配置。しわや気泡がない紙の上に注意してください。フィルター紙の別の部分でを繰り返します。</li>
		<li>30 のメタノールで 14 cm x 15 cm PVDF 膜をアクティブに s は、ローラーを使用して、すべてのバブルを削除する世話ろ紙上にレイヤーします。転送バッファーでゲルを洗い流すし、再び任意の気泡をロールアウト、膜上にレイヤーします。</li>
		<li>プラスチック製のラップと転送バッファーのコンテナーに最も近いペーパー タオルの端をカバーします。ペーパー タオルのスタックとの直接接触に次の手順で紙の鉄橋が来ないことが重要です。</li>
		<li>転送バッファーの 15 cm × 35 cm フィルター紙を浸漬し、一端がゲルの上をカバーしてもう一方の端は、転送バッファーのコンテナー内に配置します。別の橋を繰り返します。</li>
		<li>プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、室温で一晩おきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ウエスタンブロット検出
<ol><li>0.05% を含む PBS の 50 mL の膜を洗浄トゥイーン 20 (pbst;) 20 cm × 20 cm のコンテナー。PBST で 5% ミルク 20 mL を追加します。ブロックを 30 分間室温でロック。</li>
	<li>PBST で 5% ミルク 20 mL にウサギ抗 MLKL 抗体の 10 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。4 ° C で一晩ロッカーでインキュベートします。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>Pbst; 5% ミルク 20 mL に抗うさぎ HRP の 4 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。ロッカー 2 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>基板化学発光 (ECL) を追加し、製造元のプロトコルによると x 線フィルムを公開します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

2 D の SDD 時代の最も重要な側面は、電気泳動条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることです。45 ° (解離や劣化が発生しなかったことを示す) でシャープな斜めラインによって異なります両方中に同じ方法で移行する繊維を検出する能力は electrophoreses します。電圧または実行時間の長さを変更するなど、さまざまな条件を使用して、これらの結果があいまいされます。また、従来の 1 次元の場合と同様 SDD 時代、サンプルを沸騰避けるべきである、これはアミロイドとアミロイド様線維が中断されますと。すべての転送として、フィルター ペーパー、膜およびゲルの層間泡を避けるために注意が必要があります。最後に、転送処理中にブリッジしないドループし、ペーパー タオル スタックに直接問い合わせが重要です。信頼性の高い方法これを防ぐためには、ペーパー タオルの端をカバーするプラスチック製のラップの小片を使用することです。
プロトコル (60 V 4 時間) で提供される実行条件を調整可能性があります。たとえば、このプロトコルでは agarose のゲルは 14 cm x 15 cm だった。小さいゲルを使用する場合電圧 (4 V/cm のゲルの長さ) と実行時比率に応じて調整する必要があります。2 つのサンプルは、ゲルを準備するときに 2 つの櫛を使用して一度に分析する可能性があります。サンプルは、各櫛のために最もよく右に読み込む必要があります。この場合、上のサンプルが実行されないように、底にゲルの半分は、ランタイムを再び縮められねばなりません。ゲルの 1 つの次元の時間を調整する場合、他の寸法が一致するように調整が重要です。
SDS-PAGE と対照をなして 1 D および 2 D の SDD 時代が半変化です。繊維がそのまま残っているのでいくつかのエピトープはアクセスできません可能性があります。これは、いくつかの抗体による検出を制限があります。2D SDD 時代は、アミロイドやアミロイド様線維の正確なサイズを決定する能力に制限されます。しかし、相対的なサイズ比較を行うことがあります。
すべての蛋白質の複合体は、解離や SDD 時代劣化、定性的な結果を解釈することは困難かもしれないので。2 d 使用 SDD 時代は SDD 時代の間に見られるサイズの不均一性は、電気泳動中に SDS 依存性解離原因確認を許可します。2D SDD 時代は伝統的な 1 D SDD 時代が使用される任意のコンテキストで使用する適切です。2D SDD 時代は、1 D SDD 時代のサイズの不均一性が観察されるときに便利です。

1アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの病態に関与するタンパク質のミスフォールディングによるアミロイド繊維の形成を知られている長い。最近では、アミロイドやアミロイド様線維形成が抗ウイルス自然免疫応答2ネクロトーシス3,4中を含む人間と低い有機体のシグナル伝達経路の一部であると示されています。酵母5,6などしたがって、実験室でこれらの繊維を検出する機能は重要です。現在、アミロイドとアミロイド様線維を検出する 3 つの主な方法があります: 染料、EM、および SDD 時代の使用。
コンゴ赤や Thioflavin T などの染料の使用では、急速な顕微鏡、分光法7を使用して容易に検出できるという利点を提供しています。しかし、コンゴ赤の場合、顕微鏡による検出には、繊維、または繊維のサイズを構成するタンパク質の特異性は提供しません。同様に、コンゴ赤または Thioflavin T のバインディングを蛋白質の複合体を検出する分光学の使用は、正または負の結果のみを提供します。
EM は、繊維と繊維の長さと直径の8について定量的な情報の存在の決定的な証拠を提供します。ただし、この方法では、非常に厳格な浄化が必要です。さらに、EM は高価な機器を使用する特殊な技術です。
SDD 時代は、SDS 耐性メガ ダルトン タンパク質やアミロイドのようなアミロイド繊維を含むを検出するために使用されています。多くの利点を提供しています。最初に、それは繊維の精製を必要としないし、peform9に簡単です。第二に、それは相対的なサイズおよび繊維の heterogenicity の量を含む繊維のサイズに関する定性的情報を提供します。ウェスタンブロッティングは、電気泳動後実行できます、ために、最後に、それは、SDD 時代は半変化、いくつかのエピトープが隠されたままにするそれに注意する必要がありますを任意のタンパク質、抗体がある存在を検出する簡単です抗体による検出を複雑になります。
最近では、受容体相互作用タンパク質キナーゼ 1 (RIPK1) と 3 (RIPK3) は、ネクロトーシス、壊死3のプログラムのフォームの間にプラットフォームをシグナルとして機能するフォーム アミロイド線維に報告されています。これらの繊維を勉強しながら私たちの研究室は、リネージュ キナーゼ ドメインのような (MLKL) を混合、別のネクロトーシス関連蛋白質がまた4アミロイド様線維を形成を示した。しかし、SDD の年齢を調べると、MLKL 繊維のサイズ登場登場お互い (図 1) と同じ RIPK1 と RIPK3 の繊維とは異なる。MLKL RIPK1/RIPK3 にバインド ネクロトーシス シグナリング複合 necrosome10と呼ばれる形成して知られているのでこれは予想外だった。
少なくとも 2 つの説明があります。最初に、2 つのまったく異なるアミロイドのような繊維がネクロトーシス、1 つ含む RIPK1/RIPK3 およびその他の含まれている MLKL の中にフォームがあります。第二に、含む RIPK1/RIPK3/MLKL 可能性がありますネクロトーシス、MLKL 協会他の蛋白質との間に形成されるアミロイド様線維の 1 種類のみですそれは SDD 時代の間に電離する十分に弱いです。
これに対処するため二次元 (2 D) SDD 時代を実行することを提案します。SDD 時代安定アミロイドやアミロイド様線維は最初と 2 番目のディメンションの電気泳動中に同じの移行パターンをあります。膜へのタンパク質の転送、西部のしみの実施後、これは検出可能になります。安定した繊維は、シャープな斜めパターンを展示いたします。これからの逸脱は、繊維が SDS 電気泳動による変化を受けることを示唆するでしょう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >gel electrophoresis unit</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >HE99XPRO</td>
			<td >appratus for gel running.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agrose</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97062-250</td>
			<td>For agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paper tower</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >19-120-2484</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >filter paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21427-386</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PVDF membrane</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >162-0177</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >blocking milk powder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1706404XTU</td>
			<td>for blocking in Western blot</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MLKL antibody</td>
			<td >Genetex</td>
			<td >GTX107538</td>
			<td>rabbit anti-MLKL antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK1 antibody</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >610459</td>
			<td>mouse anti-RIPK1 antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK3 antibody</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-Rabbit-HRP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6154</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECL</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >WBKLS0500</td>
			<td>Western chemiluminescent HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-ray film</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >F-BX810</td>
			<td>for Western blot result</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D6429</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4135</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicilin-streptomycin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4333</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin solution</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4049</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS for tissue culture</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8662</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >recombinant TNF</td>
			<td >made in our lab</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >smac-mimetic</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ZVAD-FMK</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >A1902</td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Model TC20; for counting cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >23225</td>
			<td>for measuring protein concentration in cell lysates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lifter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >07-200-364</td>
			<td>to remove cells from dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysis Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			10 mL glycerol 
			30 mL 5 M NaCl 
			840 mL ddH2O 
			10 mL Triton-X100 
			(protease and phosphates inhibitors as desired)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X TAE (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >48.4 g Tris base 
			11.42 mL glacial acetic acid 
			20 mL 0.5M EDTA pH 8 
			ddH20 to 1 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >5 mL 10X TAE 
			10 mL glycerol 
			4 mL 20% SDS 
			0.5 mL 10% bromophenol blue 
			31 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS Transfer Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			30 mL 5 M NaCl 
			950 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBST Wash Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >100 mL 10xPBS 
			800 mL ddH2O 
			1 mL Tween20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS (10 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >800 g NaCl 
			20 g KCl 
			144 g Na2HPO4&#183;2H2O 
			24 g KH2PO4 
			add ddH2O to 10 L</td>
		</tr>
		</tbody>
</table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

アミロイドやアミロイド様線維は多くの人間の病気に関連付けられている、今多くのシグナル伝達経路の重要であることが発見されています。様々 な実験条件下でのこれらの繊維の形成を容易に検出する機能は潜在的な機能を理解するために不可欠です。多くの方法は、繊維を検出するために使用されているいくつかの欠点がないわけで。たとえば、電子顕微鏡検査 (EM) やコンゴーレッドまたは Thioflavin T にしばしば染色繊維の精製が必要です。その一方で、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は精製することがなく細胞抽出液の SDS 耐性のアミロイド様線維の検出をことができます。さらに、それは繊維の大きさの違いの比較をことができます。もっと重大に、それは西部にしみが付くことによって繊維内の特定の蛋白質を識別するために使用できます。時間がかかるであり、ラボの広い数をより簡単にアクセスできます。SDD 時代結果しばしば不均質性が変化します。それはタンパク質の SDS 存在下での電気泳動の中に複合体の解離に起因する不均一性の一部であるかどうか質問を上げます。このため、我々 は SDD 時代の SDD 時代に見られるサイズの不均一性が真に繊維不均質体内の結果、劣化または中にタンパク質のいくつかの解離の結果ではないかどうかの 2 番目の次元を採用しています。電気泳動。このメソッドは、SDD 時代プロセス中にアミロイドやアミロイド様線維が部分的に解離しない高速、定性の確認できます。

ネクロトーシス誘導後 RIPK1 と RIPK3 は、ほぼ同一のアミロイドのようなパターン (レーン 2、4、図 1) を示した。しかし、MLKL 繊維はより均一であった、RIPK1/RIPK3 繊維 (レーン 6、図 1) よりも小さくなるように見えた。求め、私たちは MLKL フォーム RIPK1/RIPK3 に依存しない繊維または MLKL を単に SDD 時代に大規模な RIPK1/RIPK3/MLKL 繊維から分離するかどうか、可能性に対処するため 2次元 SDD 時代手法を開発します。
電気泳動および転送プロシージャの一般的な回路図を図 2に示します。SDD 時代最初の次元の中にアミロイドやアミロイド様線維を図 3Aに見られるように特性の塗抹標本を展示いたします。SDD 時代の 2 番目のディメンションを実行時に 2 つの可能な結果があります。ないの劣化またはゲルのプロセスを実行中に解離の場合繊維が移行されます同じ 2 番目の実行中に最初の実行の場合と同様。この例では、西部のしみは図 3Bに見られるように 45 ° の角度で膜上の斜線パターンを展示いたします。繊維は、SDD 時代プロセス中に分離する小さい繊維が第 2 電気泳動の間に高速に移行します。この場合、西部のしみは、図 3Cに示すように、斜めの線の下の垂直ストリー キングを展示いたします。
ネクロトーシス中に見られる MLKL 繊維、場合彼らは SDD 時代 (図 4A) の最初の次元の中に特性の塗抹標本が表示されます。それらの同じ繊維は 2D SDD 時代にさらされた、彼らはない垂直光線 (図 4B) シャープな斜めラインを展示しました。この証拠で、MLKL は SDD 時代プロセス中にない解離繊維と図 1に示す MLKL 含有繊維が RIPK1/RIPK3 繊維から確かに異なると考えられました。さらに、RIPK3 はセル lysates から免疫枯渇したとき MLKL 繊維に残ったそのまま4MLKL、RIPK1/RIPK3 繊維確かに別個の主体であることを確認します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig1.jpg"> 図 1.ネクロトーシス中のアミロイド様線維検討します。全体のセル lysates は TNF 誘導ネクロトーシスになる細胞から収穫され、SDD 時代を受けます。西部のしみは、RIPK1、RIPK3、MLKL に行った。MLKL 含有繊維は、RIPK1/RIPK3 含有繊維から明確な移行パターンを展示しました。MLKL モノマーがこの条件の下で見えないです。<a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig2.jpg"> 図 2.実験的プロトコル。(A) 二次元半変化洗剤 agarose ゲル電気泳動 (2 D SDD 時代) の模式図。右ほとんどの車線、赤ラベルのサンプルをロードすることによって開始します。最初のディメンションの実行が終了した後、ゲル 90 ° 反時計回りを回転します。2 番目の次元電気泳動を実行します。実線の矢印は、実行最初の次元の方向を示す、点線の矢印は、実行 2 番目の次元の方向を示します。(B) 毛管作用によって転送のスキーマです。<a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig3.jpg"> 図 3.結果。SDD 時代の最初のディメンションの後アミロイドやアミロイド様線維の (A) 予想される移行パターン。実線の矢印は、移動の方向を示します。(B) 予想される移行パターンの SDD 時代安定 (劣化または解離) アミロイドや 2D SDD 時代後アミロイド様線維。実線の矢印は、SDD 時代の最初の次元の方向を示します。点線の矢印は、SDD 時代の 2 番目の次元の方向を示します。(C) 非 SDD 時代-安定したアミロイドやアミロイド様線維の予想される移行パターン。実線の矢印は、SDD 時代の最初の次元の方向を示します。点線の矢印は、SDD 時代の 2 番目の次元の方向を示します。<a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig4.jpg"> 図 4。1 D および 2 D の SDD 時代の間に移行の MLKL 含有繊維します。(A) 全体のセル lysates はチーリン ネクロトーシスに受ける刺激から収穫されました。Lysates は SDD 時代に, MLKL の西部のしみを行いました。特徴的な塗抹標本が観察されました。(B) 全体のセル lysates はチーリン ネクロトーシスに受ける刺激から収穫されました。Lysates は 2D SDD 時代に, MLKL の西部のしみを行いました。45 ° の角度でシャープなラインを認めた、繊維に SDD 時代の間に解離が行われていないことを示します。<a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

ビデオ: Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

生化学

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of tRNA(UUU) to TcdA, an N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehydratase, which cyclizes the threonylcarbamoyl side chain attached to A37 in the anticodon stem loop (ASL) of tRNAs to cyclic t6A (ct6A). Transcription of the synthetic gene encoding tRNA(UUU) is induced in E. coli with 1 mM isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and the cells containing tRNA are harvested 24 h post-induction. The RNA fraction is purified using the acid phenol extraction method. Pure tRNA is obtained by a gel filtration chromatography that efficiently separates the small-sized tRNA molecules from larger intact or fragmented nucleic acids. To analyze TcdA binding to tRNA(UUU), TcdA is mixed with tRNA(UUU) and separated on a native agarose gel at 4 &#176;C. The free tRNA(UUU) migrates faster, while the TcdA-tRNA(UUU) complexes undergo a mobility retardation that can be observed upon staining of the gel. We demonstrate that TcdA is a tRNA(UUU)-binding enzyme. This gel retardation assay can be used to study TcdA mutants and the effects of additives and other proteins on binding.

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

A protocol is presented for the production of tRNA(UUU) and the analysis of tRNA(UUU) in complex with the enzyme TcdA by agarose gel retardation assays.

タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; - スルホニルカルバモイルアデノシンTcdA機能

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the cell, ATP. The ETC is composed of 5 massive protein complexes, which also assemble into supercomplexes called respirasomes (C-I, C-III, and C-IV) and synthasomes (C-V) that increase the efficiency of electron transport and ATP production. Various methods have been used for over 50 years to measure ETC function, but these protocols do not provide information on the assembly of individual complexes and supercomplexes. This protocol describes the technique of native gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), a method that was modified more than 20 years ago to study ETC complex structure. Native electrophoresis permits the separation of ETC complexes into their active forms, and these complexes can then be studied using immunoblotting, in-gel assays (IGA), and purification by electroelution. By combining the results of native gel PAGE with those of other mitochondrial assays, it is possible to obtain a completer picture of ETC activity, its dynamic assembly and disassembly, and how this regulates mitochondrial structure and function. This work will also discuss limitations of these techniques. In summary, the technique of native PAGE, followed by immunoblotting, IGA, and electroelution, presented below, is a powerful way to investigate the functionality and composition of mitochondrial ETC supercomplexes.

This protocol describes the separation of functional mitochondrial electron transport chain complexes (Cx) I-V and supercomplexes thereof using native electrophoresis to reveal information about their assembly and structure. The native gel can be subjected to immunoblotting, in-gel assays, and purification by electroelution to further characterize individual complexes.

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein interactions in many cases is associated with significant experimental challenges. In particular, sorting receptors interact with their protein cargo in the lumen of the membrane compartments often in a detergent-sensitive fashion, making co-immunoprecipitation of these proteins unusable. Binding of the sorting receptor sortilin to glucose transporter GLUT4 may serve as an example of weak luminal interactions between membrane proteins. Here, we describe a fast, simple, and inexpensive assay to validate the interaction between sortilin and GLUT4. For that, we have designed and chemically synthesized the myc-tagged peptide corresponding to the potential sortilin-binding epitope in the luminal part of GLUT4. Sortilin tagged with six histidines was expressed in mammalian cells, and isolated from cell lysates using Cobalt beads. Sortilin immobilized on the beads was incubated with the peptide solution at different pH values, and the eluted material was analyzed by Western blotting. This assay can be easily adapted to study other detergent-sensitive protein-protein interactions.

We describe a protocol for detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins using binding of the sorting receptor, sortilin, to the first luminal loop of the glucose transporter protein, GLUT4, as an example.

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...