Bu eser için bir arkadaş grubu tarafından desteklenen S.H.-A. NIH/NCATS (TL1TR001104), Welch Vakfı Hibe (I-1827) ve NIGMS (RGM120502A) Z.W. Z.W. bir R01 hibe'tıbbi araştırma ve kanser önleme ve Texas akademik ve Araştırma Enstitüsü (R1222) Virginia Murchison Linthicum uzman olduğunu.

1. hazırlayın örnekleri
<ol><li>Kültür 2 x 106 amiloid HT-29 kolon kanser hücrelerinin 10 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin içeren DMEM) 10 cm doku kültürü tabak içinde üreten. Kültür hücreleri 37 ° C kuluçka %5 CO2gece.<ol>
<li>Sonra % 80 confluency için hücrelerin büyümesine, fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL hücrelerle yıka. 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri yemek tamamen Disosiye sonra kültür orta 10 mL ekleyin ve 15 mL konik tüp 10 mL pipet hücrelerle aktarmak. Senaryo Özeti 3 dakika oda sıcaklığında 1000 x g santrifüj kapasitesi. Orta Aspire edin, 5 mL kültür ortamının hücrelerde resuspend ve bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Her iki 10 cm tabak tabak 2 x 106 hücreler.</li>
		<li>Hücreleri uygun ve gecede 37 ° C kuluçka %5 CO2kurtarmak için izin verir. Amyloids 20 ng/mL tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), 100 nM şaplak atmak mimetic ve 20 µM pan-caspase inhibitörü Z-VAD-FMK11ile oluşumu ikna etmek için bir yemek için tedavi uygulanır. Kasanın TSZ kısaltılır. Araç ile diğer çanak bir denetim olarak tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uygun süreyi sonra genellikle 6 h, lysate hücre hasat.<ol>
<li>Plastik bir sıyırıcı plaka kapalı hücre scrape ve 10 mL pipet 15 mL konik tüp içine aktarmak için kullanın. 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Hücreleri tarafından 10 mL buz soğuk PBS resuspending ve 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de centrifuging 2 kez yıkamak PBS çözüm Aspire edin. Not: İşlemi burada hücre Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ˗80 ° C ilâ 1 aylığına depolayarak duraklatılmış.</li>
		<li>Hücre Pelet 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve buz üzerinde 30 dk için lizis arabellek 0.3 ml kuluçkaya. 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g, santrifüj Süpernatant lysate tüm cep telefonu var. Not: İşlemi burada örnek-20 ° C'de için birkaç ay kadar depolayarak duraklatılmış.</li>
		<li>Bir Bradford tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek. 4 x 3 µg/µL örnek 20 µL hazırlamak ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya SDD-yaş yükleme arabellek ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hazırlayın ve jelleri çalıştırın
<ol><li>200 ml 1 x Tris-asetat arabelleği (TAE) bir cam kabı ve özel eritmek için bir mikrodalga Isı özel 2 g ekleyin. 1 mL % 20 SDS % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için ekleyin. Karıştırmak için dikkatli bir şekilde girdap. Kabarcıklar SDS eklenmesinden sonra oluşturmamanız için dikkat ediniz.</li>
	<li>Özel çözüm 15 cm x 14 cm jel levha dökün. 1-mL pipet herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için kullanın. Bir 20-iyi tarak en üste yerleştirmek.</li>
	<li>İlk Boyut: pipet 60 µg, her hücrenin sağ şeritte lysate. (Boya açık yaklaşık ¾ jel yoluyla olana) jel 60 V 4 h için çalıştırın çalışan tampon olarak % 0,1 SDS içeren TAE kullanarak.</li>
	<li>İkinci Boyut: jel 90 ° saat yönünün tersine (Şekil 2A) dikkatle döndürün. Jel 60 V 4 h için çalıştırın. Not: Genel çalışan 4 V/cm jel uzunluğu bir durumdur. Çalışan koşulların tam olarak birinci ve ikinci boyutları için aynı olduğunu önemlidir.</li>
</ol>3. transfer
<ol><li>Proteinler polivinilidin difluoride (PVDF) membran (Şekil 2B) aktarmak için kılcal aktarma yöntemini kullanın.<ol>
<li>Aktarma arabelleği için 500 mL ekleyin bir yaklaşık 20 cm x 20 cm kapsayıcı. 5-cm yüksek yığın kağıt havlu konteyner yanında yapmak. Yığının üst yüzey alanı jel boyutları büyük olması gerekir.</li>
		<li>14 cm x 15 cm filtre kağıdı Aktarım arabellek emmek ve kağıt havlu yığını üzerine yerleştirin. Hiçbir kırışıklık veya kabarcıklar ile kağıda yerleştirmek için dikkat ediniz. Filtre kağıt başka bir parça ile tekrar.</li>
		<li>14 cm x 15 cm PVDF membran için 30 metanol içinde etkinleştirmek s sonra filtre tüm kabarcıklar kaldırmak için bir rulo kullanmak için dikkat çekici kağıt üzerinde katman. Jel Aktarım arabellek ile durulayın ve yine herhangi bir kabarcıklar inişli çıkışlı membran üstüne katman.</li>
		<li>Plastik film ile yakın Aktarım arabellek kapsayıcıya kağıt havlu kenarı kapsar. Bir sonraki adımda inşa kağıt köprü kağıt havlu yığını ile doğrudan temas gelebilir değil önemlidir.</li>
		<li>15 cm x 35 cm filtre kağıt Aktarım arabellek emmek ve böylece bir ucunu üst jel kapsar ve diğer ucunu Aktarım arabellek kapsayıcısında yerleştirin. Başka bir köprü ile yineleyin.</li>
		<li>Kapsayıcı plastik wrap ile kapak ve gecede oda sıcaklığında bekletin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot algılama
<ol><li>Durulama zar 50 mL % 0.05 içeren PBS ile ara-20 (PBST) olarak tehlikeli madde kabına 20 cm × 20 cm. 20 mL % 5 süt PBST içinde ekleyin. Rock engellemek 30 dakika oda sıcaklığında.</li>
	<li>Tavşan anti-MLKL antikor PBST sütte %5 20 mL içine 10 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. Gecede 4 ° C'de rocker üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.</li>
	<li>Anti-rabbit-HRP 20 ml % 5 süt PBST içinde 4 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. 2 h için oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.</li>
	<li>Gelişmiş Kemiluminesan substrat (ECL) ekleyin ve röntgen filmleri üreticinin protokolüne göre için maruz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

En önemli bir özelliği, 2D SDD-yaş Elektroforez koşullar birinci ve ikinci boyutu için aynı olmasıdır. Benzer bir şekilde her iki sırasında geçiş lifleri 45 ° (hiçbir ayrılma veya bozulma oluştuğunu gösteren), keskin bir çapraz çizgi bağlıdır algılama yeteneğini electrophoreses. Farklı koşullar, örneğin voltaj veya çalışma süreyi değiştirme kullanarak bu sonuçlar karanlık olacak. Geleneksel 1 D için olduğu gibi bu amiloid ve amiloid benzeri lifleri bozabilir olacaktır Ayrıca, SDD-yaş, örnek kaynar, kaçınılmalıdır. Tüm transferler için olduğu gibi filtre kağıdı, membran ve jel katmanlar arasında kabarcıklar önlemek için özen gösterilmelidir. Son olarak, transfer adımı sırasında bu köprü sarkıt değil ve kağıt havlu yığını doğrudan temas önemlidir. Bunu önlemek için güvenilir bir yol plastik wrap küçük bir parça kağıt havlu kenarı kapsayacak şekilde kullanmaktır.
Protokolü (60 V 4 h için) sağlanan çalışan koşulları ayarlanabilir. Örneğin, bu protokol için özel jel 14 cm x 15 cm oldu. Daha küçük bir jel kullandıysanız, voltaj (4 V/cm jel uzunluk) ve çalışma zamanında orantılı olarak ayarlanmalıdır. İki örnek aynı anda jel hazırlanırken iki tarak kullanarak analiz. Örnekleri her tarak için en iyi sağ yüklü olmalıdır. Böylece en iyi örnek alt yarısı jel çalışmaz bu durumda, çalışma zamanı tekrar kısaltılabilir. Zaman jel bir boyut için ayarlanıyorsa, diğer boyut eşleşecek şekilde ayarlanır önemlidir.
SDS-sayfa aksine 1 D ve 2D SDD-yaş yarı denaturing. Lifler korunacak çünkü bazı epitopları ulaşılmaz kalabilir. Bu bazı antikorlar tarafından algılama sınırlayabilir. 2D SDD-yaş amiloid veya amiloid benzeri liflerin tam boyutunu belirlemek için onun yetenek sınırlıdır. Ancak, bir göreli boyut karşılaştırma yapılabilir.
Ayrılma veya bozulma SDD-yaş sırasında tüm protein kompleksleri tabidir ve bu yüzden nitel sonuçlar yorumlamak zor olabilir. 2D kullanımına SDD-yaş SDD-yaş sırasında görülen boyutu heterojenite SDS-bağımlı ayrılma Elektroforez sırasında nedeniyle değil onay izin verir. 2D SDD-yaş geleneksel 1 D SDD-yaş kullanıldığı herhangi bir bağlamda kullanmak uygundur. Boyutu heterojenite 1 D SDD-çağda gözlenen 2D SDD-yaş özellikle yararlıdır.

Protein misfolding nedeniyle amiloid lifleri oluşumu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı1gibi patolojik koşullarda bir rol oynamaya uzun bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, amiloid veya amiloid benzeri liflerin oluşumu sinyal yolları insanlar Anti-yayılmacı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı2 necroptosis3,ve4sırasında dahil olmak üzere ve daha düşük organizmalar bir parçası olmak için gösterilen Maya5,6gibi. Bu nedenle, bu elyaf laboratuarda algılama yeteneğini önemlidir. Şu anda, amiloid ve amiloid benzeri lifler algılamak için üç ana yolu vardır: Boyalar, EM ve SDD-yaş kullanımı.
Boya, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T, gibi kullanımı hızlı ve kolayca detectable mikroskopi veya spektroskopisi7kullanarak olmanın avantajı sunuyor. Ancak, mikroskopi, Kongo kırmızısı, söz konusu olduğunda tarafından hangi proteinleri oluşturan lifler veya boyutu lifler, hiçbir özgüllük algılar. Benzer şekilde, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T bağlayıcı protein kompleksleri için algılamak için spektroskopisi kullanımı yalnızca bir pozitif veya negatif sonuç sağlar.
EM lifleri ve aynı zamanda lif uzunluğu ve çapı8hakkında kantitatif bilgi varlığının kesin kanıt sağlar. Ancak, bu yöntem çok sıkı arıtma gerektirir. Ayrıca, EM pahalı ekipman kullanan bir özel bir tekniktir.
SDD-yaş SDS dayanıklı mega Dalton protein kompleksleri amiloid veya amiloid benzeri lifler de dahil olmak üzere tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok avantaj sunar. İlk olarak, arıtma liflerinin gerektirmez ve peform9için kolaydır. İkinci olarak, göreli boyutu ve fiber heterogenicity miktarı dahil olmak üzere liflerinin boyutu hakkında Nitel bilgi sağlar. Western Blot Elektroforez sonra gerçekleştirilen çünkü son olarak, bu SDD-yaş yarı denaturing olduğu için bazı epitopları hangi gizli kalmasını unutulmamalıdır, ancak kendisi için herhangi bir proteinin bir antikor olduğunu var olup olmadığını belirlemek kolaydır algılama antikor tarafından olmak zordur.
Son zamanlarda, reseptör etkileşen protein kinaz 1 (RIPK1) ve 3 (RIPK3) bildirilmiştir formu amiloid lifleri için platformlar necroptosis sırasında nekroz3programlanmış bir tür sinyal olarak hizmet etmek için. Bu iplikler okurken, bizim laboratuvar lineage kinaz etki alanı gibi (MLKL), karışık başka bir necroptosis ilişkili protein de amiloid benzeri lifler4kurdu gösterdi. Ancak, SDD-yaş ile incelenmesi üzerine, MLKL lifleri boyutunu birbirlerine (şekil 1) aynı çıktı RIPK1 ve RIPK3 lifler farklı çıktı. MLKL necroptosis necrosome10denilen karmaşık sinyal oluşturmak için RIPK1/RIPK3 için bağlar tanınmış olduğundan bu beklenmedik bir şeydi.
En az iki açıklaması vardır. İlk olarak, iki tamamen farklı amiloid benzeri lifler necroptosis sırasında bir içeren RIPK1/RIPK3 ve diğer içeren MLKL şeklinde. İkinci olarak, tek bir içeren RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis ama MLKL ilişkilendirmesiyle diğer proteinler sırasında oluşmuş amiloid benzeri lifler zayıf yeterince SDD-yaş sırasında ayrışıp türüdür.
Bu sorunu çözmek için bir iki boyutlu (2D) SDD yaşından öneriyorum. SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler aynı geçiş desen birinci ve ikinci boyut Elektroforez sırasında olacaktır. Bu tespit bir membran proteinleri aktarma ve Western blot taşıma sonra olacak. İstikrarlı elyaf keskin köşegen desen sergileyecek. Bu herhangi bir sapma lifler SDS-Elektroforez nedeniyle değişiklikleri meydana öneririz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >gel electrophoresis unit</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >HE99XPRO</td>
			<td >appratus for gel running.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agrose</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97062-250</td>
			<td>For agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paper tower</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >19-120-2484</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >filter paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21427-386</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PVDF membrane</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >162-0177</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >blocking milk powder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1706404XTU</td>
			<td>for blocking in Western blot</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MLKL antibody</td>
			<td >Genetex</td>
			<td >GTX107538</td>
			<td>rabbit anti-MLKL antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK1 antibody</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >610459</td>
			<td>mouse anti-RIPK1 antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK3 antibody</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-Rabbit-HRP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6154</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECL</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >WBKLS0500</td>
			<td>Western chemiluminescent HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-ray film</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >F-BX810</td>
			<td>for Western blot result</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D6429</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4135</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicilin-streptomycin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4333</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin solution</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4049</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS for tissue culture</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8662</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >recombinant TNF</td>
			<td >made in our lab</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >smac-mimetic</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ZVAD-FMK</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >A1902</td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Model TC20; for counting cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >23225</td>
			<td>for measuring protein concentration in cell lysates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lifter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >07-200-364</td>
			<td>to remove cells from dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysis Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			10 mL glycerol 
			30 mL 5 M NaCl 
			840 mL ddH2O 
			10 mL Triton-X100 
			(protease and phosphates inhibitors as desired)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X TAE (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >48.4 g Tris base 
			11.42 mL glacial acetic acid 
			20 mL 0.5M EDTA pH 8 
			ddH20 to 1 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >5 mL 10X TAE 
			10 mL glycerol 
			4 mL 20% SDS 
			0.5 mL 10% bromophenol blue 
			31 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS Transfer Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			30 mL 5 M NaCl 
			950 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBST Wash Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >100 mL 10xPBS 
			800 mL ddH2O 
			1 mL Tween20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS (10 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >800 g NaCl 
			20 g KCl 
			144 g Na2HPO4&#183;2H2O 
			24 g KH2PO4 
			add ddH2O to 10 L</td>
		</tr>
		</tbody>
</table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

Amiloid Dil veya amiloid benzeri lifler birçok insan hastalıkları ile ilişkili olan ve şimdi birçok sinyal yolları için önemli olduğunu keşfetti edilmektedir. Kolayca bu elyaf çeşitli deneysel koşullarda oluşumu algılama yeteneğini potansiyel işlevleri anlamak için önemlidir. Pek çok yöntem lifler, algılamak için kullanılan ama bazı dezavantajları olmadan olmaz. Örneğin, elektron mikroskobu (EM) veya Kongo kırmızısı veya Thioflavin T ile sık sık boyama arıtma liflerinin gerektirir. Öte yandan, yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (SDD-yaş) hücre özleri arıtma olmadan SDS dayanıklı amiloid benzeri lifler algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, boyut farkı liflerinin karşılaştırmasını sağlar. Daha da önemlisi, Western Blot tarafından spesifik proteinlerin lifler içinde tanımlamak için kullanılabilir. Daha az zaman alıcı ve labs daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir. SDD-yaş sonuçları genellikle değişken heterojenite derecesini gösterir. Protein kompleksi SDS huzurunda Elektroforez sırasında ayrılma heterojenite parçası oluşur olup olmadığını sorusunu gündeme getiriyor. Bu nedenle, ikinci bir boyut SDD-ÇAĞINDA görülen boyutu heterojenite gerçekten fiber heterojenite vivo içinde bir sonucu ve bozulma ya da ayrılma sırasında proteinlerin bazı değil bir sonucu olup olmadığını belirlemek için SDD-Age istihdam Elektroforez. Bu yöntem, amiloid veya amiloid benzeri liflerin kısmen SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil hızlı, nitel onay sağlar.

Sonra necroptosis indüksiyon, RIPK1 ve RIPK3 hemen hemen aynı amiloid benzeri desenler (şerit 2 ve 4, şekil 1) gösterdi. Ancak, MLKL lifler daha heterojen ve RIPK1/RIPK3 lifleri (lane 6, şekil 1) küçük olmak gibiydi. Bizi ister MLKL RIPK1/RIPK3-bağımsız lifler oluşturur ya da MLKL sade bir şekilde büyük RIPK1/RIPK3/MLKL lifleri SDD-yaş sırasında ayrışıp. olasılığını adrese 2D SDD-yaş yöntem geliştirmek için istenir.
Elektroforez ve transfer yordam genel bir şematik Şekil 2' de gösterilmiştir. İlk boyutun SDD-yaş sırasında amiloid veya amiloid benzeri liflerin şekil 3' teAgörüldüğü gibi karakteristik bir smear sergileyecek. İkinci boyut SDD-yaş üzerine çalışan, iki olası sonuç vardır. İlk çalıştırmada yaptıkları gibi hiçbir bozulma ya da ayrılma işlemi çalıştıran jel sırasında söz konusu olduğunda, lifler ikinci çalışma sırasında aynı şekilde geçirilir. Bu durumda, bir Western blot şekil 3' teBgörüldüğü gibi 45 ° açıyla membran üzerinde köşegen desen sergileyecek. SDD-yaş işlemi sırasında lifleri ayırmak, daha küçük lifleri daha hızlı ikinci Elektroforez sırasında göç edecek. Bu durumda, bir Western blot şekil 3Cgösterildiği gibi çapraz sınırının altında Dikey çizgiler sergileyecek.
Necroptosis sırasında görülen MLKL lifleri söz konusu olduğunda, ilk boyut SDD-yaş (şekil 4A) sırasında karakteristik smear gösteriyorlar. Ne zaman bu aynı lifleri 2D SDD-yaş için tabi tutuldu, onlar hiçbir dikey streaking (şekil 4B) ile keskin bir çapraz çizgi sergiledi. Bu kanıtlarla MLKL lifleri SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil olduğunu ve şekil 1 ' de görülen MLKL içeren lifleri RIPK1/RIPK3 lifleri gerçekten farklı olduğunu sonucuna varıldı. Ayrıca, RIPK3 IMMUNO tükenmiş-hücre lysates yaşındayken MLKL lifleri sağlam4MLKL elyaf ve RIPK1/RIPK3 lifleri gerçekten ayrı varlıklardır onaylayan, kaldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig1.jpg"> Resim 1 . Amiloid benzeri lifler muayene sırasında necroptosis. Tüm cep telefonu lysates ve TNF kaynaklı necroptosis geçiren hücrelerden hasat SDD-yaş için tabi. Batı lekesi RIPK1, RIPK3 ve MLKL için yapıldı. MLKL içeren lifleri RIPK1/RIPK3-içeren liflerinden ayrı geçiş desen sergiledi. MLKL monomer ancak bu koşul altında görünür. <a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig2.jpg"> Resim 2 . Deneysel protokol. İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (2D SDD-yaş)(a)şeması. Kırmızı etiketli sağ çoğu şeride örnekte yükleyerek başlayın. İlk boyut çalıştırma sona ermesi sonra jel 90 ° saat yönünün tersine döndür. İkinci boyut Elektroforez çalıştırın. Noktalı ok çalıştırmak ikinci boyutu yönünü gösterir, katı ok çalıştırmak ilk boyut yönünü gösterir. (B) şema devrine kılcal eylem. <a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig3.jpg"> Şekil 3 . Olası sonuçları. (A) beklenen geçiş desen SDD-yaş ilk boyut sonra amiloid veya amiloid benzeri liflerinin. Katı ok geçiş yönünü belirtir. (B) beklenen geçiş desen SDD-yaş-kararlı (Hayır bozulma ya da ayrılma) Amiloid veya amiloid benzeri lifler 2D SDD-yaş sonra. Katı ok ilk boyut SDD-yaş yönünü belirtir. Noktalı Ok ikinci boyutu SDD-yaş yönünü gösterir. (C) sigara-SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler beklenen geçiş desen. Katı ok ilk boyut SDD-yaş yönünü belirtir. Noktalı Ok ikinci boyutu SDD-yaş yönünü gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57498/57498fig4.jpg"> Şekil 4. MLKL geçiş içeren lifleri 1D ve 2D SDD-yaş sırasında. (A)tüm cep telefonu lysates hücrelerden necroptosis geçmesi TSZ ile uyarılan hasat. Lysates SDD-yaş için tabi tutuldu ve Western blot MLKL için gerçekleştirildi. Karakteristik bir smear gözlendi. (B) tüm cep telefonu lysates hücrelerden necroptosis geçmesi TSZ ile uyarılan hasat edildi. Lysates 2D SDD-yaş için tabi tutuldu ve Western blot MLKL için gerçekleştirildi. Lifler ayrılma SDD-yaş sırasında tabi olmayan gösteren 45° açıyla keskin bir çizgi gözlendi. <a href="/files/ftp_upload/57498/57498fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center. Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

Video: Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Biyokimya

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of tRNA(UUU) to TcdA, an N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehydratase, which cyclizes the threonylcarbamoyl side chain attached to A37 in the anticodon stem loop (ASL) of tRNAs to cyclic t6A (ct6A). Transcription of the synthetic gene encoding tRNA(UUU) is induced in E. coli with 1 mM isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and the cells containing tRNA are harvested 24 h post-induction. The RNA fraction is purified using the acid phenol extraction method. Pure tRNA is obtained by a gel filtration chromatography that efficiently separates the small-sized tRNA molecules from larger intact or fragmented nucleic acids. To analyze TcdA binding to tRNA(UUU), TcdA is mixed with tRNA(UUU) and separated on a native agarose gel at 4 &#176;C. The free tRNA(UUU) migrates faster, while the TcdA-tRNA(UUU) complexes undergo a mobility retardation that can be observed upon staining of the gel. We demonstrate that TcdA is a tRNA(UUU)-binding enzyme. This gel retardation assay can be used to study TcdA mutants and the effects of additives and other proteins on binding.

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

A protocol is presented for the production of tRNA(UUU) and the analysis of tRNA(UUU) in complex with the enzyme TcdA by agarose gel retardation assays.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the cell, ATP. The ETC is composed of 5 massive protein complexes, which also assemble into supercomplexes called respirasomes (C-I, C-III, and C-IV) and synthasomes (C-V) that increase the efficiency of electron transport and ATP production. Various methods have been used for over 50 years to measure ETC function, but these protocols do not provide information on the assembly of individual complexes and supercomplexes. This protocol describes the technique of native gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), a method that was modified more than 20 years ago to study ETC complex structure. Native electrophoresis permits the separation of ETC complexes into their active forms, and these complexes can then be studied using immunoblotting, in-gel assays (IGA), and purification by electroelution. By combining the results of native gel PAGE with those of other mitochondrial assays, it is possible to obtain a completer picture of ETC activity, its dynamic assembly and disassembly, and how this regulates mitochondrial structure and function. This work will also discuss limitations of these techniques. In summary, the technique of native PAGE, followed by immunoblotting, IGA, and electroelution, presented below, is a powerful way to investigate the functionality and composition of mitochondrial ETC supercomplexes.

This protocol describes the separation of functional mitochondrial electron transport chain complexes (Cx) I-V and supercomplexes thereof using native electrophoresis to reveal information about their assembly and structure. The native gel can be subjected to immunoblotting, in-gel assays, and purification by electroelution to further characterize individual complexes.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein interactions in many cases is associated with significant experimental challenges. In particular, sorting receptors interact with their protein cargo in the lumen of the membrane compartments often in a detergent-sensitive fashion, making co-immunoprecipitation of these proteins unusable. Binding of the sorting receptor sortilin to glucose transporter GLUT4 may serve as an example of weak luminal interactions between membrane proteins. Here, we describe a fast, simple, and inexpensive assay to validate the interaction between sortilin and GLUT4. For that, we have designed and chemically synthesized the myc-tagged peptide corresponding to the potential sortilin-binding epitope in the luminal part of GLUT4. Sortilin tagged with six histidines was expressed in mammalian cells, and isolated from cell lysates using Cobalt beads. Sortilin immobilized on the beads was incubated with the peptide solution at different pH values, and the eluted material was analyzed by Western blotting. This assay can be easily adapted to study other detergent-sensitive protein-protein interactions.

We describe a protocol for detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins using binding of the sorting receptor, sortilin, to the first luminal loop of the glucose transporter protein, GLUT4, as an example.

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...