This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.

注：このプロトコルは、以前に公開された非変性PAGEプロトコル12に基づいています。その研究では、のMxAタンパク質のオリゴマー状態は、内因性のMxAを発現するのMxAを過剰発現するベロ細胞またはIFN-αで刺激されたA549細胞のいずれかを用いて評価しました。以下に記載されるプロトコルは、のMxAに加えて、任意のタンパク質のオリゴマー状態を分析するために使用することができます。しかし、さらなる最適化が必要とされ得ます。 非変性PAGEのための細胞溶解物の調製注：いずれかのベロまたはA549細胞におけるヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を分析するために、1.0×10 6個の細胞を採取しました。細胞型または分析するタンパク質の存在量に依存して、細胞数を調整すべきです。すぐに感光性ヨードアセトアミドを添加するように、露光から溶解バッファを保護することも重要です。 <ol><li>にウェル当たり0.3×10 6 A549またはVero細胞をシード6ウェルディッシュに。ウェル毎に2 mlの増殖培地中で細胞を維持した （ 表1参照 ）。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で一晩細胞をインキュベートします。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1mlで洗浄することにより細胞を回収し、0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸0.5mlを室温で約5分間（EDTA）1X溶液を添加することによって切り離します。 </li><li>すぐに細胞がディッシュから剥離として、0.5ミリリットルの増殖培地を追加し、注意深くピペッティングにより混合します。 </li><li>各ウェルに1 2ミリリットルチューブの細胞を転送し、テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）を使用して、それらをペレット化。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなくピペットで上清を除去します。 </li><li>慎重に上下細胞懸濁液をピペットで1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を洗浄。 </li><li>テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）で細胞をペレット化。 </li><li>慎重のwiをピペットで上清を除去し細胞ペレットを取り外すthout。 </li><li>上下にピペッティングし、氷上に置くことにより、200μlの氷冷溶解緩衝液中に再懸濁細胞（ 表1参照）。 </li><li>直ちに、スズ箔を使用して管を覆うことにより光から溶解物を保護し、氷上で30分間インキュベートします。 注：遊離チオール基の保護が不可逆的であるため、氷上で30分間インキュベートした後、それは、もはや露光からの溶解物を保護するために不可欠です。 </li><li>あらかじめ冷却テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）での遠心分離により細胞破片を除去します。 </li><li>遠心分離工程の間に20分間の4℃の冷室で透析緩衝液（ 表1）に透析カラムを平衡化します。万の分子量カットオフでカラムを使用してください。 <ol><li>フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに入れます。穏やかな攪拌を確保するために、磁気撹拌機を使用しています。膜には触れないでください。 注：Dialysカラムは、購入またはフィアラおよび共同研究者ら19によって記載されたプロトコルに従って、1.5ミリリットルのチューブから調製することができるされています。 </li></ol></li><li>透析緩衝液とフロートブイから列を削除します。膜に触れることなく、ピペッティングにより準備された透析カラムにクリアされた溶解物を転送します。フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに戻ってそれらを置きます。 </li><li>慎重にマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら4℃で少なくとも4時間（好ましくは一晩）氷冷透析緩衝液（ 表1）を含有するビーカー中で溶解物を透析します。 200μlの溶解液のために少なくとも100ミリリットルの透析緩衝液を使用してください。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに透析サンプルを転送します。テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）で遠心分離によって沈殿物を除去します。オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐためにすぐに透析した後、プロトコル（セクション2）に進みます。凍結しないでください調製した溶解物。 </li></ol> 2.電気泳動注：いくつかの変更22で前述したように電気泳動を行いました。以下に記載されたプロトコルでは、プレキャスト勾配ゲルを使用した（4〜15％勾配）。あるいは、ゲルは、実験室で調製することができます。 SDSのオリゴマータンパク質複合体の解離を防止するような任意の変性剤を排除することが非常に重要です。電気泳動の時間は人間のMxAタンパク質の異なるオリゴマー状態のために最適化されました。しかし、それは、オリゴマー複合体の大きさ、ならびに複合体を分析するために達成されることになっている分離の範囲に応じて、他のタンパク質のために変化することができます。したがって、電気泳動の最適な時間は、経験的に決定されるべきです。オリゴマーの最適な解像度を分析するために電流が25ミリアンペアを超えてはなりません。 <ol><li>ゲルチャンバ内の非変性PAGEゲルを組み立てます。トンを埋めます予冷ランニング緩衝液（ 表1）と彼の内側および外側チャンバ。 </li><li> 4℃の低温室で15分間ゲル当たり25ミリアンペアで予備冷却したランニング緩衝液でゲルを事前に実行します。 </li><li> 4×サンプル緩衝液（ 表1）の5μlの上記で調製した溶解物の15μlのを混ぜます。サンプルを沸騰しないでください。 </li><li>サンプルの負荷15μlを、ゲル上の任意の天然タンパク質の標準。 4℃の低温室で4時間25ミリアンペアでゲルを実行します。 注：半定量的分析のため、タンパク質定量化プロトコル（ 例えば、Bradfordタンパク質アッセイ23）はレーンあたり総タンパク質の等量の充填を確実にするために行うことができます。 </li></ol> 3.ウエスタンブロット注：以下で説明するには、湿ったウェスタンブロットシステムのプロトコルです。任意のブロッティング膜を使用することができます。 BUFブロッティングで平衡化する前に、100％メタノールにポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を活性化させますFER。セミドライウエスタンブロット法を代わりに使用することができるが、大きなオリゴマー複合体のために最適化されなければなりません。 <ol><li>ゲルを分解し、慎重にSDS緩衝液（ 表1）にそれを転送します。 </li><li>穏やかに振盪しながら室温で10分間インキュベートします。 </li><li> 2スポンジ、4セルロース濾紙シートとゲルあたりブロッティング膜を準備します。バッファ（ 表1）をブロッティングでそれらを浸します。 </li><li> 1スポンジ、2セルロース濾紙シート、膜、ゲル、2セルロース濾紙シート、1スポンジ：（下から上）を次のようにサンドイッチを組み立てます。 </li><li>ブロッティングタンクにサンドイッチを入れてください。ゲルはマイナス極に直面しながら、膜がプラス極に直面していることを確認します。 </li><li>あらかじめ冷却ブロッティングバッファーでブロッティングタンクを埋めます。 </li><li>最高のタンパク質導入の結果を得るために4℃で一晩90ミリアンペアで吸い取ります。 </li><li>サンドイッチを分解し、PONC中で膜をインキュベートすることにより、タンパク質標準を可視化室温で5分間オーSソリューション。 </li><li>あなたは明らかにタンパク質標準のバンドが表示されるまで、慎重に脱イオン水でポンソーSを洗浄することにより、膜脱色。 </li><li>ペンを使用して、タンパク質標準のバンドをマークします。 注：残留ポンソーSは、免疫染色を妨げる可能性があります。これを回避するために、膜を脱イオン水で1分間、およびその後の洗浄のために、0.1M NaOH中でのインキュベーションによってさらに脱色することができます。 </li><li>ブロッキング緩衝液で膜をブロックし、室温で少なくとも1時間または一晩4°Cのため（ 表1参照）。 </li><li>分析されるタンパク質に対する抗体を用いた免疫染色により、目的のタンパク質（単数または複数）を視覚化します。 注：緩衝液（ 表1）をブロック1,000：ヒトのMxAタンパク質は、ヒトMx1の1に希釈するための具体的なウサギポリクローナル抗体を用いて可視化しました。抗体溶液を4℃で一晩インキュベートしました。あるいは、モノクローナルANTI-のMxA抗体（クローン143）を使用することができる（データは示していない）24。 </li></ol>

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	<li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc.">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li><li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins:+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping.">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression.">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li><li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction:+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes.">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li><li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+symmetry+and+protein+function.">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li><li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylalanine+hydroxylase:+function,+structure,+and+regulation.">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li><li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MxA+protein:+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity.">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li><li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+GTPases:+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity.">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li><li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization.">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li><li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity.">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function.">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li><li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus.">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA.">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li><li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly:+Application+to+the+green+fluorescent+protein.">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li><li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery.">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules.">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly.">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9.">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins.">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li><li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49.">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li><li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced,+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum.">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li><li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers.">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li><li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes.">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li><li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection.">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、ウェスタンブロット分析を行った非変性PAGEによって哺乳動物細胞で発現するタンパク質のオリゴマー状態の急速な決意を可能にする簡単な方法を説明します。このアプローチの主な利点は、所定のタンパク質のオリゴマー状態は、従来のタンパク質精製せずに全細胞溶解物から決定することができるということです。これは、オリゴマー化または補助因子に関連してその機能を発揮するタンパク質のために重要であり得ます。また、タンパク質は、その天然の状態のままであり、さらに、ゲルから抽出された場合、酵素活性または他のタンパク質の機能を決定し、オリゴマー状態と相関させることができます。 このプロトコルの重要な側面は、サンプル調製時の洗剤の選択です。これは、細胞膜に関連するタンパク質のために特に重要です。 MxAのは、主に、滑らかな小胞体25の膜に関連すると思われます</suP&gt;。細胞溶解のための非イオン性界面活性剤NP40をのMxAの沈殿を防止する、最適でした。以前19に記載のように緩衝液交換し、透析による溶解物の低分子量不純物を除去した後、0.1％3の存在- [（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ] -1-プロパンスルホネート（CHAPS）ゲル中のMxAの沈殿を防止するために必要とされました電気泳動。 大腸菌で発現し精製された組換えのMxAタンパク質で決定されるように加えて、CHAPSはのMxAの酵素活性を阻害しません大腸菌 12。これは、界面活性剤は、タンパク質を変性または溶解中のタンパク質 - タンパク質相互作用を妨害しないことが非常に重要です。このようなNP40、Octoxinol 9などの非変性界面活性剤は、ジギトニンおよびCHAPS可溶化するのに適しています。界面活性剤およびその濃度の選択は、経験的に決定されるべきです。洗剤はまた、界面活性剤があることが必要である、特定のアッセイのために、例えば 、下流の実験に影響を与える可能性があります簡単にではなくOctoxinol 9 26と、透析によってCHAPSで達成されて除去されます。 記載された方法は、非変性条件下での細胞溶解物由来のタンパク質を分析するので、タンパク質の事前の精製を必要としません。組換えタンパク質の精製は、時に、凝集または沈殿からタンパク質を防止するために、高い塩および他の添加剤を添加することによってバッファの最適化を必要とするので、これは利点です。しかし、これらの添加剤及び高塩濃度は、必ずしもその天然の状態に似ていない可能性があり、タンパク質のオリゴマー形成に影響を与える可能性があります。特にヒトのMxAタンパク質の場合には、塩濃度およびヌクレオチドの存在は、より高いオリゴマー状態27の形成に重要な役割を果たしています。細胞安定化因子が依然として存在しているので、細胞溶解物において、タンパク質はより容易に安定化されます。したがって、PRを分析することが可能ですそれ以上の細胞の生理的条件下でotein複合体（ 例えば 、生理的塩濃度およびpH）。このプロトコルはまた、構造的に関連MXBまたはダイナミン8のために例えば、オリゴマーを形成する他のタンパク質に適用可能であるべきです。 プロトコルの別の重要な側面は、溶解（ 図1）の間に細胞質タンパク質の人工的なジスルフィド架橋の形成を防止する遊離チオール基の保護です。最初の実験は、1,4-ジチオスレイトール（DTT）またはβメルカプトエタノールの添加は、試料調製中に人工ジスルフィド結合の形成を防止するのに十分ではないことを示しました。両方の還元剤は、ジスルフィド架橋を形成することから、可逆的にチオール基を保護します。この可逆的保護は永久にすべてのチオール基を保護するのに十分ではないかもしれません。 MxAタンパク質の場合には、これは、タンパク質の不可逆的な凝集をもたらします。しかし、ヨードアセトアミドを添加することirreversDTTで処理された溶解物からのMxAと比較した場合、iblyシステインの遊離チオール基が大きくまたのMxAタンパク質の凝集を低減し保護し、哺乳動物発現細胞のMxAから調製した溶解物のヨードアセトアミド治療は免疫沈降したMxAのGTPase活性に影響を及ぼさなかった（データは示されていません）。 オリゴマー中のプロトマーの数の正確な決意のための他の重要な考慮事項は、ポリアクリルアミド濃度範囲の選択だけでなく、タンパク質分子量の基準です。ポリアクリルアミド濃度の範囲は、最初のオリゴマーの予想分子量でのバンドの最大の分離を可能にするために確立されるべきです。非変性PAGEは、任意のSDSが含まれていません。 SDSを欠く、電荷、分子量およびタンパク質の形状は、その電気泳動移動度を決定します。したがって、タンパク質分子量マーカーの選択が重要です。理想的には、分子量の基準は、ARだろう既知のオリゴマーの状態で、目的のタンパク質のecombinant精製された形。これが常に利用可能ではないので、非変性または天然のタンパク質マーカーを使用する必要があります。 MxAのは、UAP56やトゴトウイルス属、ラクロスウイルスやインフルエンザウイルス12,28-30のウイルス核タンパク質のような他の細胞タンパク質と結合することが示されているので、我々はまた、特異的抗体UAP56またはインフルエンザ核タンパク質が共同個別のかどうかを用いた免疫染色によってテスト非変性PAゲル上のMxAと。しかし、我々はのMxAヘテロオリゴマーの形成の証拠は認められませんでした。これはおそらくのMxA-UAP56とのMxA-核タンパク質相互作用は低親和性12,24のものであるという事実によるものです。また、UAP56またはウイルス核タンパク質と会合のMxAタンパク質の割合は、この方法によって検出することが非常に低いので、難しいかもしれません。 また、分析されるべき考慮タンパク質のpKaを取ることが重要です。記載される非denatでuringページプロトコルは、タンパク質は、pH 8.3での電気泳動によって分離されています。ほとんどのタンパク質は負に、このpHで荷電されています。しかし、塩基性タンパク質は、pH 8.3で正の正味電荷を示すため、反対方向に実行されます。塩基性タンパク質の分析は、タンパク質の全体的な負電荷を確実にするために、ランニング緩衝液のpHを調節するため、結果として、それは、重要です。 まとめると、我々はここで、その前に精製を必要とせずに、哺乳動物細胞で発現されるタンパク質のオリゴマー状態を迅速に評価するためのプロトコルを提示します。

タンパク質の四次構造は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。シグナル伝達経路、遺伝子発現、および酵素活性化/非活性化は、すべてのタンパク質複合体1-4の適切なアセンブリに頼ります。また、ホモまたはヘテロオリゴマーとして知られるこのプロセスは不可逆的共有結合または可逆的な静電および疎水性のタンパク質 - タンパク質相互作用に起因します。オリゴマー化は、ゲノムサイズを大きくすることなく、異なる細胞過程を多様化するだけでなく、変性および劣化5に対してより耐性である安定な複合体を構築するためのタンパク質のための戦略を提供するだけでなく。オリゴマー化の欠陥は、タンパク質の機能に影響を与え、疾患の発症をもたらすことができます。例えば、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、四量体複合体を形成します。タンパク質複合体の中のいくつかの変異は、四量体形成を弱め、病気のフェニルケトン6につながることができます。 7を誘発インターフェロン（IFN）です。これは、ダイナミンのような大GTPアーゼのスーパーファミリーに属し、 インビトロ 8 に大きなオリゴマー構造を形成する能力を有します。オリゴマー化は、迅速な分解9,10からのMxAを保護するために提案されています。多くの研究グループによる激しい努力にもかかわらず、作用の分子機構は、主にとらえどころのないままで、その抗ウイルス機能のためのMxAのオリゴマー化状態の役割が議論9,11,12の下にあります。この点で、ガオと共同研究者は、MxAのが大きなリング状オリゴマー構造11の形でウイルス核タンパク質と相互作用することにより、その抗ウイルス活性を発揮するモデルを提案しました。しかし、最近では、我々は、のMxA二量体が抗ウイルス活性を示し、インフルエンザウイルス12の核タンパク質と相互作用することを実証しました。 BMxAの結晶構造にASED、ガオと共同研究者は、in vitroで 、そのオリゴマー化およびその抗ウイルス機能11,13のために重要である界面領域におけるいくつかのアミノ酸残基を同定しました。したがって、抗ウイルス活性を発揮するのMxAのオリゴマーいる状態解明するために、我々は、急速に、内因性のMxAはIFNα刺激後に発現並びにヒト細胞において発現のMxAインタフェース変異体のoligmeric状態を決定するための簡単なプロトコルを確立しようとしました。 一般に、スプリット緑色蛍光タンパク質などのタンパク質の間の相互作用を研究するために使用される多くの技術があるが（スプリット-GFP）相補性アッセイ14、表面プラズモン共鳴15と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）16、それらが提供していませんオリゴマータンパク質複合体の正確な化学量論の情報。この特定の側面の調査のため、技術など多角度光散乱（MALS）17および分析超遠心分離18は非常に便利です。通常、これらの方法を用いて分析したタンパク質は、精製されたタンパク質です。オリゴマー化プロセスは、他の細胞因子に依存し得ます。これらの要因が不明である場合は、解析がより困難です。さらに、いくつかのタンパク質は、 大腸菌で発現することが困難であり、 coliおよび精製します。したがって、これらの方法は、細胞環境におけるタンパク質のオリゴマー化を分析するための最適な選択肢ではありません。また、これらの技術は容易に入手できない高価な機器を必要とします。 非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー又は従来のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEに続く化学的架橋は、細胞溶解物2,19,20からのオリゴマーの形成の特徴付けのために有用なツールです。これらの方法は、特別な装置を必要とせず、簡単にPEすることができます標準的な実験室でrformed。我々は、最初に不変非特異的凝集のMxAの沈殿を導いた種々の化学架橋プロトコルを評価しました。したがって、我々は次の非変性PAGEプロトコルをテストしました。非変性PAGEは、SDSの使用を排除するように、タンパク質の移動は、母国の電荷に依存します。ブルーネイティブPAGEは、SDSに似て全体的に負電荷を有するタンパク質をロードするためにクーマシーブリリアントブルーG250を使用しますが、タンパク質21を変性させません。残念ながら、多くの場合、溶解緩衝液に含まれている（ 例えば、マグネシウム2+）高塩および二価カチオンの存在下で鮮やかな青色の沈殿物をクーマシー。使用される緩衝剤によっては、オリゴマータンパク質複合体に影響を与える可能性の手順をさらに最適化することなくサンプルを分析することは困難です。 ここでは、のオリゴマー化を決定するために、以前に発表された方法22に基づいて簡単なプロトコルを提示非変性PAGEを使用して細胞溶解物由来のヒトのMxAタンパク質。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:244px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">69570</td>
			<td style="width:268px;">Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) 
			Can be self-made according to Fiala et al. 2011</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:244px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">456-1083</td>
			<td style="width:268px;">Pre-run in running buffer to adjust buffer system</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td>use 1 tablet per 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">PBS, pH 7.4&#160; bottle a 500ml Gibco</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P7170</td>
			<td style="width:268px;">toxic! wear gloves and protect eyes!</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:244px;">NativeMark Unstained Protein Standard&#160; 50ul</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">P/N 57030</td>
			<td>load 5 ul/well</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">A549 cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL185</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL81</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">anti-Mx1 antibody</td>
			<td style="width:140px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:131px;">H00004599_D01P</td>
			<td>Use at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:244px;">ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">NA934V</td>
			<td>Use at a 1:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:244px;">0.5% Trypsin-EDTA (1x)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:131px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Iodoacetamide&#160;&#160; 5g</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">I-6125</td>
			<td>stock&#160; 100mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Bromphenolblue</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Pen&#160; Strep 100 x&#160;&#160;&#160;&#160; 100ml&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">15140 - 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Glutamax 100xStock, 100ml&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">350500-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PVDV blotting&#160; membrane</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">10600022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium fluoride (NaF)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">NP-40</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">492015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tween 20</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">6555204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CHAPS 10% solution</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">N907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0007132391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">b-Glycerophospate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Milk powder</td>
			<td style="width:140px;">Migros/Switzerland</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Methanol</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:131px;">1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-subunit protein complexes of human mxa using non-denaturing polyacrylamide gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

非変性PAGEを使用して、我々は、ヒト野生型のMxA、二量体界面の突然変異体のMxA（R640A）とのMxA（L617D）ならびに細胞溶解物12から単量体インターフェース変異体のMxA（M527D）のオリゴマー状態を分析しました。細胞は（ 図1参照 ） は 、タンパク質の可溶化および遊離チオール基の保護を確実にするために1％のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（NP-40）及びヨードアセトアミドを含有する緩衝液中で溶解しました。前述したように、塩、小代謝産物を透析19により除去しました。タンパク質分離は、非変性PAGEによって行いました。効率的なウエスタンブロットを容易にするために、ゲルをブロッティングの前にSDS緩衝液中でインキュベートしました。 MxAタンパク質はのMxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により可視化しました。ワークフローは、図2に記載されています。 IFN-αから内因性ヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を比較するために、<html> ; A549細胞を刺激し、我々は、組換え野生型、単量体および二量体のMxAの変種でVero細胞（内因性のMxAを欠く）をトランスフェクトしました。染色されていない天然のタンパク質マーカー（ 図3A）と比較した場合、これらの組換え野生型、単量体および二量体のMxAのは、それぞれ、形成された安定した四量体、単量体および二量体を変異体です。したがって、我々は、IFN-αに由来する内因性ヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態は、A549細胞を刺激し評価するために、これらの組換えタンパク質を使用した。 図3Bは、IFN-αで刺激されたA549細胞の溶解物中のMxAの大きさは、四量体に相当することがわかります。 まとめると、我々は、細胞溶解物からのヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を決定するための方法を記載しています。我々の非変性PAGEのアプローチは、他のオリゴマータンパク質複合体のオリゴマー状態を評価するために使用することができます。 83 / 54683fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：ヨードアセトアミドの構造と反応スキームは、ヨードアセトアミドは、不可逆的チオエーテル結合を形成することにより、自由システインのチオール基を保護します。システインからの硫黄原子とヨウ素の求核置換から、この安定した修正結果。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54683/54683fig2.jpg" /> 図2： 非変性PAGEのワークフローダイアグラム細胞溶解物の非変性PAGEアプローチの体系的な表現。細胞溶解の際に、界面活性剤は、タンパク質を可溶化し、チオール基は、タンパク質凝集を防ぐために、ヨードアセトアミドで保護されています。透析は、非変性PAGEに干渉する可能性が小さい代謝物および塩を除去します<s&gt; 19アップ。複雑な分離は、非変性条件下で行われます。オリゴマー複合体の検出は、免疫染色に続いてウエスタンブロットによって達成される。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54683/54683fig3.jpg" /> 図3：非変性PAGEおよびウェスタンブロッティングを用いてヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態の決意 （A）組換えのMxAは、異所的にベロ細胞で発現変異体。野生型のMxA（四量体）インタフェース突然変異体のMxA（R640A）、のMxA（L617D）（二量体）とのMxA（M527D）の複合体は、それらのオリゴマー状態を確認し、彼らの予想分子量で移動。 （B）A549細胞のMxAの発現を誘導するIFN-αmlの1,000 IUで刺激しました。内因性のMxAのsh四量体の形態に対応するバンドをOWS。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ名 </td><td colspan="2"> コンテンツ </td><td colspan="2"> 注釈 </td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td colspan="2"> 20mMのトリス-HCl（pH7.5）、 150mMのNaCl、 5mMのMgCl 2、 100μMのヨードアセトアミド、 50mMのNaFを、 1 mMののNa 3 VO 4、 1％NP-40、 βグリセロリン酸50 mMの、 EDTAフリー、プロテアーゼ阻害剤カクテル50mlの溶解緩衝液当たり1錠</td><td colspan="2">ヨードアセトアミド、NaFをし、Na 3 VO 4、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（NP-40）、βグリセロリン酸およびプロテアーゼinhibiを追加細胞溶解前TORカクテル右 ヨードアセトアミドは、感光性と、溶液中の場合不安定です。露光を防止し、使用前に右を溶解します。 </td></tr><tr><td>透析緩衝液</td><td colspan="2"> 20mMトリス - 塩酸（pHは6.8）、 10％グリセロール、 0.1％CHAPS、 0.5 mMのDTT </td><td colspan="2"> CHAPSは、他の非変性界面活性剤によりraplacedすることができます</td></tr><tr><td>ランニングバッファー</td><td colspan="2"> 25 mMトリス塩酸（pHは8.3）、 192 mMグリシン、 0.1％CHAPS、 0.5 mMのDTT </td><td colspan="2"> pHが8.3では、ほとんどのタンパク質は負に帯電しています。しかし、基本的なタンパク質のために、酸性pHを使用する必要があります。それ以外の場合、タンパク質は逆の方向に実行され、失われます。 CHAPSは、他の非変性界面活性剤で置換することができます</td></tr><tr><td>サンプルバッファ</td><td colspan="2"> 310 mMトリス - 塩酸（pH6.8）、 0.05％ブロモフェノールブルー、 50％グリセロール</tD&gt; <td colspan="2"></td></tr><tr><td> SDSバッファー</td><td colspan="2"> 25 mMトリス塩酸（pHは8.3）、 192 mMグリシン、 0.1％SDS </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td>ブロッティングバッファー</td><td colspan="2"> 25mMトリス、 192 mMグリシン、 20％メタノール</td><td colspan="2">非常に大きな複合体のために、メタノールは省略されことができます</td></tr><tr><td>ブロッキング緩衝液</td><td colspan="2"> 50mMのトリス-HCl（pH7.4） 150mMのNaCl 0.05％のTween 20 5％の粉ミルク</td><td colspan="2"></td></tr><tr><td>成長培地</td><td colspan="2">ダルベッコ改変培地 1×ペニシリン/ストレプトマイシン 2mMのグルタミン 10％ウシ胎児血清</td><td colspan="2"></td></tr></tbody></table> 表1： 非変性PAGEのために必要なバッファのレシピ。

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.1K ビュー.  University of Zurich. This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

生化学

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...