この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。

1. 細胞や培養皿の準備
注: 組織培養層流フードの 1-3 の手順に従います。手袋を着用します。
<ol><li>ガラス底培養皿を使用している場合は、フィブロネクチンとガラスをコートします。プラスチック製の食器を使用して手順 1.2 を省略します。<ol>
<li>フィブロネクチンの 0.1 mg/mL の溶液を作る: 9 mL の 1x PBS で 1 mg/mL フィブロネクチン溶液 1 mL を希釈します。</li>
		<li>0.5-1 の各ウェルのガラス底をカバー フィブロネクチンの mL と室温で 1 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペットを使用して、フィブロネクチン ソリューションを収集、4 ° C で保存 メモ: フィブロネクチン ソリューションを複数回使用できます。</li>
		<li>1-2 mL の 1x PBS、一度ガラスを洗浄し、PBS を離れて吸い出しなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(別大きさで分類された井戸に使用する細胞数の表 1参照) 適切な細胞の培養基の 2 mL で 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 x 10 の5セルをプレートします。安定 (ディスカッションを参照) カスパーゼ BiFC コンポーネントを表現する細胞ラインを使用している場合、2 x 10 の5セルをプレートし、治療手順 (手順 3) に進みます。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターで 37 ° C で一晩シャーレに付着します。</li>
</ol>2. トランスフェクション細胞のカスパーゼ BiFC コンポーネントを紹介するには
<ol><li>適切なトランスフェクション試薬で細胞を transfect します。 注: このプロトコルは、最小限の毒性のために最適化された Lipofectamine 2000 の指示をについて説明します。このプロトコルは、LN18 細胞 MCF7 細胞、Hela 細胞で正常に使用されています。追加場合、トランスフェクション試薬は製造元の指示に従って、必要に応じて最適化します。<ol>
<li>生殖不能の管に低下した血清中メディアの 750 μ L にトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>5 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>追加 10 ng 記者プラスミド (蛍光蛋白質、例えば赤い蛍光蛋白質 [RFP] transfected セルにラベル付けするプラスミド) のために導入するのにも、各滅菌 1.5 mL チューブに。</li>
		<li>20 追加各カスパーゼ BiFC プラスミドの ng (例えば、20 カスパーゼ-2 prodomain [C2 プロ] ng-VC と 20 ng C2 Pro (ヴァイオリン) の) 各管 (表 2) に。</li>
		<li>低下した血清中のメディアを追加することにより 100 μ L の総ボリュームまで各チューブをもたらします。</li>
		<li>P200 ピペットを使用して、追加のトランスフェクション試薬溶液 100 μ L ステップ 2.1.2 からプラスミドの混合物に滴状に。</li>
		<li>プラスミド トランスフェクション試薬ミックス室温で 20 分間、インキュベートします。</li>
		<li>メディアや吸引でピペットを使用してセルからの吸引し、井戸の横にそっと血清無料メディアの 800 μ L をピペット p1000 ピペットを使用しています。</li>
		<li>P200 ピペットを使用して、各ウェルに滴状 DNA 脂質複合体の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>3 h の 37 ° C で培養孵卵器内のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>ように注意して、単層を混乱させる、ピペットで吸引を使用して吸引により DNA 脂質複合体を含む血清無料メディアを削除します。</li>
		<li>各ウェルの側を軽く下に予め温めておいた (37 ° C) 完全な成長媒体の 2 mL のピペットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最適な蛋白質の表現のための 24-48 時間培養のインキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
</ol>3. カスパーゼ活性化の誘導
<ol><li>薬やカスパーゼ活性化約 24 h 後トランスフェクションを誘導する刺激を扱います。<ol>
<li>目的に薬物濃度予め加温 (37 ° C) イメージング メディア (Hepes [20 mM, pH 7.2 7.5] と 2-メルカプトエタノール [55 μ M] 補足の完全な成長媒体) とミックス優しくを追加 (表 3)。</li>
		<li>吸引や吸引でピペットを使用してセルからメディアと井戸の横にそっと 3.1.1 から溶液 2 mL ピペット ピペットを使用して、その後。</li>
		<li>未処理のコントロールと 1 つの井戸に薬物なしのイメージング メディアを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C で培養のインキュベーターで細胞をインキュベートかコマ撮り実験手順 4.3 に進みます。</li>
</ol>4.カスパーゼ BiFC データ集録
<ol><li>
単一の時間ポイント獲得のカスパーゼ BiFC
	<ol>
<li>顕微鏡と蛍光光源の製造元の指示に従ってを入れます。</li>
		<li>RFP フィルターとレポーター遺伝子蛍光焦点の下のセルを検索します。</li>
		<li>手集計カウンターを使用すると、視野の RFP 陽性の細胞のすべてをカウントします。数を記録します。</li>
		<li>同じ視野を維持しながら GFP フィルター (または YFP フィルター使用可能な場合) に切り替えるし、緑も赤血球の数を数える手集計カウンターを使用して、(金星陽性)。金星陽性赤血球のみが評価されることを確保するため 2 つのフィルターを切り替える前後。レコード番号 (図 3)。</li>
		<li>各プレートの 3 つの個々 の領域の少なくとも 100 の RFP 陽性細胞を数えます。</li>
		<li>各エリアで金星正トランスフェクション細胞 (すなわち緑も赤細胞) の割合を計算します。標準偏差を取得する結果の割合を平均します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カスパーゼ BiFC の 3次元イメージング
	<ol>
<li>製造元の指示に従って顕微鏡をオンにし、集録ソフトウェアを起動します。</li>
		<li>60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置</li>
		<li>正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。</li>
		<li>落射蛍光光源や顕微鏡アイピースや共焦点レーザーとコンピューターの画面のいずれかを使用して、目的のフィールドに移動します。</li>
		<li>RFP レーザやフィルターを使用してレポーター蛍光に焦点を当てます。</li>
		<li>落射蛍光は、この時点までに使用されている場合、共焦点レーザー光源を切り替えるし、カメラによって獲得されたと集録ソフトウェア コンピューターの画面上で表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。</li>
		<li>ジョイスティック コントロールとフォーカス ホイールを使用して、微調整やセルの位置、フォーカス、ファインダーの中央にあるセル。お互いから分離され、重複していないセルを選択します。</li>
		<li>実験用に最適な設定を決定するための出発点として、金星の RFP 割合のレーザー出力の 50%、100 ms で露光時間を入力します。</li>
		<li>ライブ キャプチャおよび検査結果の画像と両方のチャネルの付属表示ヒストグラム。</li>
		<li>信号が少なく、イメージ作るは難しいが場合、は、画像の信号までの増減割合レーザー力および/または露出時間が長くなるよさそうです。</li>
		<li>信号が飽和しないを確認します。顕著なピークは、各蛍光表示されるかどうかを確認する表示ヒストグラムを検査します。ピークを包含する全体のヒストグラム表示場合、は、低いレーザー力と露出設定 (図 2) を入力します。</li>
		<li>信号の特定を確実に同じ条件の下で制御 (未処理または非導入) の細胞を可視化します。 注: 単色形質転換細胞は、クロス オーバーの制御にも使用できますが、信号が空間的に異なる (例えば細胞質とミトコンドリア) 場合これは必要ではありません。</li>
		<li>選択または顕微鏡のソフトウェアで Z スタック モジュールを開きます。</li>
		<li>フォーカスつまみを使用して、セルの中心に対応する焦点の位置を近似します。</li>
		<li>セルが表示されなくなるまで、1 つの方向でピントを調整、トップの位置とこれを選択します。</li>
		<li>セルが再び表示されなくなるまで反対方向にフォーカスを調整し、下の位置としてこれを選択します。</li>
		<li>最適ステップ サイズ (通常約 20 μ m) を選択し、自動的に上部と下部の位置の間 20 μ m の手順のそれぞれで各チャンネルで 1 つの画像を取るためにカメラを指示する集録を開始します。</li>
		<li>(図 4、映画 1) 3 D のイメージを再構築するのに 3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カスパーゼ BiFC のタイムラプス イメージング
	<ol>
<li>実験する前に少なくとも 1 時間は顕微鏡をオンにし、37 ° C に温度を設定</li>
		<li>40 x、60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置します。</li>
		<li>正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。</li>
		<li>CO2発生源が利用できる場合は、プレート ホルダー上に CO2配信デバイス (通常提供する CO2管に接続されているプレキシ ガラス蓋) を置きます。CO2レベルを 5% に設定し、ソフトウェア内から CO2のコント ローラーをオンにします。CO2発生源が利用できない場合 20 mM Hepes にメディアをバッファーが含まれます。</li>
		<li>Transfected セルのフィールドに移動し、カメラによって獲得されたと RFP レーザーを使用して、コンピューター画面上の獲得ソフトウェアによって表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。</li>
		<li>次の手順 4.2.8-4.2.12 RFP レーザーのレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力します。蛍光信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。</li>
		<li>肯定的な制御を使用してサンプル (例については表 3を参照) で、以下 YFP レーザ光のレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力する手順 4.2.8-4.2.12。金星信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。</li>
		<li>プレートの各ウェル、記者を表現する 1 つまたは複数のセルを含む別の位置の数を選択します。</li>
		<li>取られるフレームの時間経過および合計数の各フレーム間の時間間隔を入力します。次のフレームが行われる前にすべての選択した位置を取得する時間があることを確認します。</li>
		<li>各位置に再アクセスして、修正し、必要に応じてフォーカスを更新します。</li>
		<li>外部振動や温度の変化に起因する焦点のドリフトを修正するにフォーカス ドリフト補正システム (ある場合) をオンに。</li>
		<li>コマ撮りを開始し、データを保存します。</li>
		<li>(図 5、映画 2) 利用のイメージング ソフトウェアを使用してデータを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。
カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。
カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。
この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。

カスパーゼ 2 BiFC による DNA 損傷の例は図 3に示します。カンプトテシン、トポイソメラーゼ私阻害剤は DNA の損傷・ カスパーゼ-2 の活性化を誘導するために使用されました。BiFC プローブを細胞に表現をし、セルの合計数を視覚化するために、赤の蛍光タンパク質 mCherry は記者として使用されました。金星蛍光グリーンでは、大涙点を表すカスパーゼ 2 近接を誘発します。金星-陽性細胞の割合を決定するため、これらの細胞を数えることができます。細胞内局在についての結論は、このようなイメージからも可能です。例で示すように、細胞質17のように核小体もカスパーゼ 2 誘導近接が検出されました。カスパーゼ活性化複合体の細胞内分布の高解像度の可視化を提供するために単一セルの 3 次元でイメージを作成できます。図 4は、このような 3 D 画像を表現する 2 つの方法を示しています。最初はセルの 3 D 再構成を生成します。緑と赤で核にカスパーゼ 2 BiFC のカンプトテシン誘導を例です。3 D 再構成は、細胞全体両方の蛍光物質の相対的なローカリゼーションを示しています。このタイプの結果表示は、単一軸 (映画 1) セルの回転、映画として提示されたときに特に有効です。2 番目のパネルは、同じセルの直交ビューです。これは、セル内の特定の位置にあるセルのxy、 xzとyzの可視化を提供します。この方法で結果の描写は 2D 形式で提示された 3 D データを解釈しやすく、雑誌記事のように発表に適してことができます。図 5は、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ治療神経膠芽腫細胞におけるカスパーゼ 2 BiFC のタイムラプス イメージングの例を示します (ムービー 2を参照してください)。グラフは、セル ( 20から適応) セルの数値全体の平均当たり平均金星強度の増加を示しています。この種類のデータは、1 つのグラフ上で単一のセルのトレースの数としても表示できます。例で示すように、カスパーゼによる近接の発症は処置に続く約 2 時間です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig1.jpg"> 図 1: カスパーゼ構造および分子蛍光補完 (BiFC) 方法論の概略図。(A)開始カスパーゼの一般的な構造。Prodomain 大小サブユニットと活性部位のシステインを含む保存 QACRG モチーフが描かれています。(B) BiFC 分割蛍光タンパク質単独で蛍光ではないが、蛍光分子相互作用の蛋白質に融合を改革に関連付けることができますを使用します。カスパーゼ BiFC、prodomain (Pro) のフルレングスのカスパーゼを半分 N 末端に融合または (金星 N) と C 末端に半分の金星 (ヴィーナス C)。単量体の状態でカスパーゼの融合蛋白質は蛍光ではありません。PIDDosome などの活性化プラットフォームに採用の時に、ここで示すように、金星の 2 つの半分の協会は強制金星蛍光性の増加として測定はカスパーゼによる近接を表します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig2.jpg"> 図 2: 代表的な画像表示ヒストグラムを用いた飽和を認識します。最適な (上部のパネル) と飽和信号 (下のパネル) の例のとおりです。金星 (黄色のピーク) および RFP (赤いピーク) 信号が表示されます。強度を表し、y 軸は x 軸のピクセル。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig3.jpg"> 図 3: DNA 損傷に続くカスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC).Hela 細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントが表現された未処理(A)を左またはカンプトテシン (100 μ M) で治療(B)貴殿 183 局所薬 (20 μ M) が存在します。mCherry は、共同に蛍光レポーターとして表現されました。代表的な画像は、カンプトテシン処理細胞の処置に続く 16 h でカスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) のセルを表示します。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig4.jpg"> 図 4: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) のローカリゼーション。カスパーゼ 2 BiFC コンポーネントおよび蛍光原子力記者を発現 Hela 細胞は、qVD 183 局所薬 (20 μ M) の存在下でカンプトテシン (20 μ M) と扱われました。Zまでの 0.1 μ m シリアル共焦点画像から構成される 3 D 再構成-セルの平面 24 h 後に行われた、緑赤とカスパーゼ 2 BiFC で核を示します。左側のパネルが 3 D の最大強度投影レンダリング復興を示しています (「ムービー 1」も参照).右側のパネルは、同じセルの直交スライス ビューを示しています。中央のボックス (青) がxy平面 (黄色) 右のボックスはyz平面、トップ ボックス (白) はxz平面。Yz 平面とxz平面交差十字線によるとしています。スケール バーを表す 10 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig5.jpg"> 図 5: カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) のコマ(A) LN18 膠芽腫細胞をトランスフェクトしたカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントとボルテゾミブ投与した DsRed 水戸 (赤い) 赤い蛍光ミトコンドリア マーカー (15 nM) qVD 183 局所薬 (20 μ M) が存在します。セルが 37 ° C で共焦点顕微鏡に置かれ、8 h. 画像の金星蛍光 (の増加をもたらした 2 つのカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントの誘起近接時間経過表示から代表的な細胞の 2 分ごとに画像が撮影されました。緑) 時間をかけて。(B)各セルは、各時点での金星の平均強度を測定しました。金星の蛍光は、ボルテゾミブ治療後時間の経過とともに増加しました。未処理のコントロール部には、レーザー光 (図20から適応) からの低またはごくわずかな毒性条件が示されます。スケール バーを表す 20 μ m。 誤差範囲を表す 8 (コントロール) の平均 (SEM) の標準誤差および 14 (ボルテゾミブ) 個々 のセル (ムービー 2 を参照してください)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/57316fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プレートのサイズ</td>
			<td>セルの数</td>
			<td>メディアのボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 ウェル プレート</td>
			<td>1 x 10 の5細胞/ウェル</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 ウェル プレート</td>
			<td>5 x 10 の4細胞/ウェル</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 well プレート</td>
			<td>2.5 x 10 の4セル/も</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 チャンバーディッシュ</td>
			<td>2.5 x 10 の4セル/室内</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 チャンバーディッシュ</td>
			<td>10 の4セル × 1.25/室内</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: プレートに細胞数のガイドライン。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) コンポーネントを安定に発現する細胞を使用して、プレートはここで示された金額を倍増します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プレートのサイズ</td>
			<td>トランスフェクション試薬</td>
			<td>低下した血清中メディア</td>
			<td>記者プラスミド</td>
			<td>カスパーゼ-pro VC プラスミド</td>
			<td>カスパーゼ-pro VN プラスミド</td>
			<td>プラスミドのミックスに追加減少血清メディア</td>
			<td>トランスフェクション試薬溶液プラスミドのミックスに追加</td>
			<td>血清無料メディアがセルに追加されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 ウェル プレート</td>
			<td>12 μ L/プレート</td>
			<td>750 Μ L</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>100 μ L の合計</td>
			<td>100 Μ L</td>
			<td>800 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 ウェル プレート</td>
			<td>12 μ L/プレート</td>
			<td>750 Μ L</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>50 μ L の合計</td>
			<td>50 Μ L</td>
			<td>400 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 well プレート</td>
			<td>12 μ L/プレート</td>
			<td>750 Μ L</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>25 μ L の合計</td>
			<td>25 Μ L</td>
			<td>200 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 チャンバーディッシュ</td>
			<td>4 μ L/プレート</td>
			<td>250 Μ L</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>25 μ L の合計</td>
			<td>25 Μ L</td>
			<td>200 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 チャンバーディッシュ</td>
			<td>4 μ L/プレート</td>
			<td>250 Μ L</td>
			<td>1.25 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>合計 12.5 μ L に</td>
			<td>12.5 Μ L</td>
			<td>100 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: トランスフェクション試薬のボリュームをお勧めします。メモ: 提案したプラスミドの量はスタート地点に過ぎません。信号が検出されない場合は、6 ウェル プレートのウェルあたり 20 200 ng からプラスミドを滴定することをお勧めします。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>カスパーゼ</td>
			<td>治療</td>
			<td>濃度</td>
			<td>時間</td>
			<td>予想される結果</td>
		</tr>
<tr>
<td>カスパーゼ 1</td>
			<td>過剰表現 ASC</td>
			<td>250 ng/6 ウェル プレートのウェル</td>
			<td>48 h</td>
			<td>50 %bifc 正</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">カスパーゼ-2</td>
			<td>過剰表現 RAIDD</td>
			<td>500 ng/6 ウェル プレートのウェル</td>
			<td>24 h</td>
			<td>90 %bifc 正</td>
		</tr>
<tr>
<td>カンプトテシン</td>
			<td>100 Μ M</td>
			<td>16 h</td>
			<td>30-60 %bifc 正</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒート ショック</td>
			<td>45 ° C で 1 時間</td>
			<td>16 h</td>
			<td>80 %bifc 正</td>
		</tr>
<tr>
<td>カスパーゼ-4</td>
			<td>発現 NALP1</td>
			<td>250 ng/6 ウェル プレートのウェル</td>
			<td>48 h</td>
			<td>30 %bifc 正</td>
		</tr>
<tr>
<td>カスパーゼ-5</td>
			<td>発現 IPAF</td>
			<td>250 ng/6 ウェル プレートのウェル</td>
			<td>48 h</td>
			<td>15 %bifc 正</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) の肯定的なコントロールの例です。条件と予想される結果をベース14,17,18を構築、Pro を使用してパブリッシュされたデータについて。共発現プラスミドは BiFC プラスミド (ステップ 2.1.4) と一緒に導入する必要があります。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57316/57316video1.jpg"> 映画 1: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) の 3 D のローカリゼーション。Y回転 3 D 再構成-共焦点画像からz軸-飛行機、hela 細胞の細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントおよび蛍光原子力記者が 16 h のカンプトテシン (20 μ M) と扱われた表現。映画は、カスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) の核を示しています。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/3D_(Turn_around_Y).avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57316/57316video2.jpg"> 映画 2: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) のタイムラプス。LN18 膠芽腫細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントをトランスフェクトしたし、ボルテゾミブによる治療 (15 nm) 8 時間 2 分ごとをイメージしました。映画は、カスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) のミトコンドリアを示しています。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57316/Movie2.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K ビュー.  Baylor College of Medicine. このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。

ビデオ: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

神経科学

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

生化学

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

生物学

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

医学

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

免疫・感染学

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫反応

免疫調節

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

要約

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視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

二分子蛍光相補

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオセンサーによる検出

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

インビボでのバイオセンサーは、ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

要約

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視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

二分子蛍光相補

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオセンサーによる検出

インビボでのバイオセンサーは、ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します